Haloperoxidase를 생산하는 미생물을 분리하기 위하여 국내 연근해와 남북극 등의 해양시료에서 분리된 방선균 균주를 대상으로 탐색을 수행하여 남해 백도 해조류 추출물로부터 분리된 한 종류의 방선균(#1460)에서 높은 haloperoxidase 활성이 확인되었다. 본 균주의 생리.생화학적 특성은 Streptomyces 속과 유사하며 생산되는 haloperoxidase는 세포 조 추출물로부터 ammonium sulfate precipitation, High-Q column chromatography, gel permeation chromatography, Hydroxyapetite chromatography 그리고 hydrophobicinteraction chromatography를 통하여 42%의 수율과 purification fold 70으로 정제하였다. 본 효소의 최적 반응 pH는 7이고 pH 8에서 더 높은 안정성을 보여 $60^{\circ}C$에서 1시간 반응에 효소활성의 50%가 생존한다. 또 cyanide와 azide 이온에 의해 강한 저해현상을 보인다.
Haloperoxidase를 생산하는 미생물을 분리하기 위하여 국내 연근해와 남북극 등의 해양시료에서 분리된 방선균 균주를 대상으로 탐색을 수행하여 남해 백도 해조류 추출물로부터 분리된 한 종류의 방선균(#1460)에서 높은 haloperoxidase 활성이 확인되었다. 본 균주의 생리.생화학적 특성은 Streptomyces 속과 유사하며 생산되는 haloperoxidase는 세포 조 추출물로부터 ammonium sulfate precipitation, High-Q column chromatography, gel permeation chromatography, Hydroxyapetite chromatography 그리고 hydrophobic interaction chromatography를 통하여 42%의 수율과 purification fold 70으로 정제하였다. 본 효소의 최적 반응 pH는 7이고 pH 8에서 더 높은 안정성을 보여 $60^{\circ}C$에서 1시간 반응에 효소활성의 50%가 생존한다. 또 cyanide와 azide 이온에 의해 강한 저해현상을 보인다.
In my search of microbial source of novel enzymes, a marine actinomycetes, A1460, producing haloperoxidase was isolated from macroalgae from south sea, Korea and studied for physiological and biochemical properties. The haloperoxidation reaction was followed by the bromination of phenol red in the p...
In my search of microbial source of novel enzymes, a marine actinomycetes, A1460, producing haloperoxidase was isolated from macroalgae from south sea, Korea and studied for physiological and biochemical properties. The haloperoxidation reaction was followed by the bromination of phenol red in the presence of hydrogen peroxide and potassium bromide. The haloperoxidase was partially purified from the cell extract with $35\sim75%$ ammonium sulfate precipitation, High-Q anion exchange chromatography, gel filtration chromatography, hydroxyapetite chromatography and hydrophobic interaction chromatography to a yield of 42% and purification fold of 70. This enzyme showed relatively high heat stability without losing 50% of activity after 1 hr incubation at $60^{\circ}C$. The highest activity was found at $45^{\circ}C$, and the optimal pH was about pH 7, but higher stability was observed at pH 8. Azide and cyanide ion showed strong inhibition at less than 1 $\mu M$ level suggesting that the enzyme was Fe ion dependent haloperoxidase.
In my search of microbial source of novel enzymes, a marine actinomycetes, A1460, producing haloperoxidase was isolated from macroalgae from south sea, Korea and studied for physiological and biochemical properties. The haloperoxidation reaction was followed by the bromination of phenol red in the presence of hydrogen peroxide and potassium bromide. The haloperoxidase was partially purified from the cell extract with $35\sim75%$ ammonium sulfate precipitation, High-Q anion exchange chromatography, gel filtration chromatography, hydroxyapetite chromatography and hydrophobic interaction chromatography to a yield of 42% and purification fold of 70. This enzyme showed relatively high heat stability without losing 50% of activity after 1 hr incubation at $60^{\circ}C$. The highest activity was found at $45^{\circ}C$, and the optimal pH was about pH 7, but higher stability was observed at pH 8. Azide and cyanide ion showed strong inhibition at less than 1 $\mu M$ level suggesting that the enzyme was Fe ion dependent haloperoxidase.
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문제 정의
기대된다(2, 10). 따라서 본 연구에서는 해양 세균 및 방선균으로부터 이러한 효소(haloperoxidase)를 검색하는 연구를 수행하였다. 이차대사산물을 생산하는 것으로 확인된 방선균 균주와 유기물 분해능이 높은 균주를 대상으로 탐색을 수행하는 것이 효과적일 것이라는 판단 하에 쉽게 확인할 수 있는 antifungal activity를 보인 방선균 균주를 우선 탐색대상으로 설정하였으며 해양시료에서 분리한 방선균 한 종류에서 HPase 활성을 발견, 해당 효소를 분리 .
본 효소의 최적 pH와 온도를 알기 위하여 pH와 온도 의존도를 조사하였다. 활성에 대한 pH 의존성에서는 pH 5부터 6에 이르기까지 비슷한 정도의 활성을 보이고 있고 pH 7에서 최적 pH 가 보인다(Fig.
이차대사산물을 생산하는 것으로 확인된 방선균 균주와 유기물 분해능이 높은 균주를 대상으로 탐색을 수행하는 것이 효과적일 것이라는 판단 하에 쉽게 확인할 수 있는 antifungal activity를 보인 방선균 균주를 우선 탐색대상으로 설정하였으며 해양시료에서 분리한 방선균 한 종류에서 HPase 활성을 발견, 해당 효소를 분리 . 정제하고 생산 균주의 생화학적 성질에 대한 연구를 수행하였다.
제안 방법
HPase의 생산 능력을 검색하기 위하여 약 1, 200균주를 조사하였다. 이 중 3종이 비교적 뚜렷한 HPase 활성을 보였으며 이중방선균 한 종류(A1460)가 가장 높은 활성을 나타내었다.
Late exponential phase에 도달한 균주 10L 배양액을 0.2pm pore size의 tangential flow filter (3, 500 cm2 surface, Microgon Co., USA)를 이용하여 2L로 농축시키고 High speed centrifuge (Vision Science Co., Korea)로 15,000xg에서 20분간 원심 분리하여 균체를 수확하였다. Wet weight 100g 정도의 균체를 얻은 후 여기에 미리 4%2로 식혀둔 400ml의 lysis buffer (5mM phosphate buffer, lOmM EDTA, pH 7.
균주분리를 위한 해양생물 시료는 SCUBA로 채집된 즉시 2~3 g 정도의 시료를 취하여 외부에 묻은 물기를 제거하고 멸균된 가위를 이용하여 최대길이 0.5 cm 이하로 잘게 자른 뒤 1ml의멸균된 해수를 가하고 막자사발로 갈았다. 또는 멸균된 마늘 짜 개를 이용하여 내부에 함유된 체액을 취하여 이를 균주 분리 원으로 이용하였는데 이를 미리 준비된 평판 배지(ZoBell 배지, SWC 배지)에 0.
세포 내 추출물을 분리하고 파괴된 세포 부스러기를 제거하기 위하여 원심분리 (15, 000xg, 30 min)하여 상등액을 회수하였다. 그리고 ammonium sulfate 농도 35%와 75% 사이에 침전된 침전물을 회수하였다. 이를 30 ml의 50 mM phosphate buffer (pH 7.
특히 방선균의 경우는 균주 분리원을 60℃ water bath에서 약 1시간동안 처리하여 일반 세균을 제거한 후 이를 방선균 분리용 배지(Bennet's, Starch Casein KNO3, Chtin, M3-I and II 배지 등)에 도말하여 분리하였다. 분리된 균주의 생화학적 특성은 EASY-24Eplus Kit (Komed, Korea)를 사용하여 검사하였다.
5) 위에 덮어 2시간 방치하여 효소액이 agar로 스며들게 한다. 여 기에 15 ml의 반응용액(0.2% phenol red, 50mM phosphate buffer, 0.1 mM EDTA, 1% agar, pH 7.5)을 가하고 상온 암실에서 1시간 동안 반응시킨 뒤 색깔의 변화를 관찰한다.
본 균주는 남해안 백도에서 채집한 동정되지 않은 해조류의 표면에서 분리된 방선균이다. 우선 성장과 효소활성의 최적 배지를 선정하기 위하여 ZoBell, Sea water complete (SWC; bactotryptone 5 g, bacto yeast extract 3 g, glycerol 3 ml in 75% aged sea water, pH 7.5), lOg/L NaCl 대신 75% 해수를 함유하는 변형 LB 배지를 사용하여 성장과 단위 균체 당 HPase 활성을 검사한 growth curve 를 구한 결과 SWC 배지가 최적으로 결정되어 이를 주배지로사용하였다. 본 HPase는 cell mass에 따라 그 함량이 비례하여 증가하는 양상을 보였으며 stationary phase에 도달한 후 급속히 활성이 낮아지는 현상을 보였다.
5 unit/ml였고 건조중량은 수27 g/L였다. 이 균체를 원심분리로 회수하여 ultrasonicatore- 분쇄하여 얻은 조효소액으로부터 35-75% ammonium sulfate precipitation, High-Q ion exchange chromatography, Sephadex G-100 gel filtration chromatography, Hydroxyl-apatite column chromatography, Phenyl-Sepharose column chromatography 등을 통하여 42%의 수율과 purification fold 70으로 정제하였다(Table 2).
5 ml의 lysozyme solution (1 mg/ml) 을 가하고 cell wall을 깨기 위해 30분간 배양한다. 이 여과지를 CHC13 증기로 포화시킨 desiccator에서 30분간 배양하여 세포막을 용해시키고 2~3회 얼렸다 녹였다를 반복하여 cell을 추가로 파괴하여 내용물이 여과지에 스며들게 한다. 이 여과지를 solid buffer (50 mM phosphate buffer, 0.
따라서 본 연구에서는 해양 세균 및 방선균으로부터 이러한 효소(haloperoxidase)를 검색하는 연구를 수행하였다. 이차대사산물을 생산하는 것으로 확인된 방선균 균주와 유기물 분해능이 높은 균주를 대상으로 탐색을 수행하는 것이 효과적일 것이라는 판단 하에 쉽게 확인할 수 있는 antifungal activity를 보인 방선균 균주를 우선 탐색대상으로 설정하였으며 해양시료에서 분리한 방선균 한 종류에서 HPase 활성을 발견, 해당 효소를 분리 . 정제하고 생산 균주의 생화학적 성질에 대한 연구를 수행하였다.
0)에 녹인 50 mM KBr 용액 96 ml를 잘 섞은 용액을 제조하였다. 한편 배양된 세균을 한천 평판배지에서 Loop를 이용하여 50 mg 정도 취 한 후 1.5 ml Eppendorf tube에 넣고 0.5 ml의 lysis buffer (lOmM EDTA와 10mg/ml lysozyme을 포함하는 50mM Phosphate buffer, pH 7.5)를 넣고 1분간 초음파처리하여 cell을 파괴 한 후 원심분리 하여 (5 min at 23, 000xg, Vision High speed centrifuge) cell debris를 제거하고 supernatant를 0.1 ml 취하여 1 ml들이 disposable cuvette에 넣고 1 ml의 검색용액과 10 pl의 3% hydrogen peroxide를 가한 후 잘 섞어서 상온 혹은 25℃에서 30 분간 방치한 후 595 nm에서 흡광도를 측정하여 효소활성을 검사하였다. 흡광도가 높을수록 강한 Haloperoxidase 활성을 의미하며 30분간 A595를 L0 증가시키는 효소양을 1 unit HPase로 정한다.
1 ml씩 가하고 도말하여 균체 집락이 형성될 때까지 배양하였다. 해저 퇴적물이나 해수는 멸균된 50ml conical tube에 담아 실험실로 운반하여 처리하였다. 특히 방선균의 경우는 균주 분리원을 60℃ water bath에서 약 1시간동안 처리하여 일반 세균을 제거한 후 이를 방선균 분리용 배지(Bennet's, Starch Casein KNO3, Chtin, M3-I and II 배지 등)에 도말하여 분리하였다.
0)로 용출시켰다(Flow rate = 10~12 ml/hr). 활성 분획을 모아 다시 ultrafiltratioii하여 5ml 로 농축하고 hydroxy apatite chromatography (Phosphate 농도 구배이용, 20~200mM)와 Phenyl-Sepharose column을 이용한 hydro- phobic interaction 나辽omatogmphy를 NaCl 역농도구배 (0.6~0.05 M)를 이용하여 정제하였다.
대상 데이터
Phenol red, hydrogen peroxide (30% solution), KBr, EDTA, phosphate 및 TrisHCl, Trizma base 등 완중액용 시약은 Sigma (USA) 제품을 사용하였으며 95% 에탄올은 Merck 제품을 사용하였다. 크로마토그라피용 resin 들은 명시한 제품을 사용하였다.
그러나 CT의 경우 Br-에 비하여 595 nm에서의 흡광도 기준으로 약 50% 정도의 활성을 보이고 있으며「의 경우는 이보다 더욱 낮아 불과 25% 수준의 활성을 나타낸다. 염소화된 phenol red나 요오드화된 phenol red의 595 nm에서의 몰흡광계수는 알려진 바가 없으나 브롬화된 phenol red와 유사하다고 가정할 때 반응성이 50% 수준으로 낮게 나타나고 이에 따라 측정 감도가 낮아지므로 본 실험에서는 KBr을 기본 기질로 사용하였다. 그러나 할로겐 원소들의 전자친화력 때문에 chloroperoxidase는 Cl", Br「, F 모두를 기질로 이용할 수 있는 반면 bromoperoxidase는 Br- 및 I", 그리고 iodoper- oxidase는「만을 기질로 이용할 수 있다.
크로마토그라피용 resin 들은 명시한 제품을 사용하였다.
이론/모형
효소활성 검색은 Hunter-Cevera와 Sotos의 방법(6)을 따라 phenol red를 hydrogen peroxide와 KBr을 이용하여 용액의 색깔이 주황색에서 청자색으로 변하는 것을 595nm에서 흡광도를 이용하여 검색하였다. 이 방법은 96-microwell plate를 사용할 수 있어 검색 단계에서 뿐 아니라 효소정제 단계에서도 유용하게 사용할 수 있는 방법이다.
성능/효과
red가 되는 것으로 알려져 있다(6). Halogen족 이온을 제공하는 기질로는 주로 KBr을 사용하였으나 KC1 이나 KI도 기질로 작용할 수 있음을 확인하였다. 그러나 CT의 경우 Br-에 비하여 595 nm에서의 흡광도 기준으로 약 50% 정도의 활성을 보이고 있으며「의 경우는 이보다 더욱 낮아 불과 25% 수준의 활성을 나타낸다.
5), lOg/L NaCl 대신 75% 해수를 함유하는 변형 LB 배지를 사용하여 성장과 단위 균체 당 HPase 활성을 검사한 growth curve 를 구한 결과 SWC 배지가 최적으로 결정되어 이를 주배지로사용하였다. 본 HPase는 cell mass에 따라 그 함량이 비례하여 증가하는 양상을 보였으며 stationary phase에 도달한 후 급속히 활성이 낮아지는 현상을 보였다. 이에 따라 효소생산을 위한 균주회수의 시기는 초기 stationary phase에서 수행하였다.
여러 pH에서의 효소 활성 안정성은 pH 8에서 가장 잘 유지되었으나 pH 4에서 pH 10의 범위에서 비교적 안정성이 잘 유지되는 현상을 보였다(Fig. 3). 본 HPase는 sodium azide와 sodium cyanide에 의해 농도 의존적 저해현상을 나타내는 점으로 미루어 cofactor로서 Heme의 유무에 관계없이 Fe2+ ion을 갖고 있는 것으로 추정된다(Fig.
생존하지 못했다. 운동성은 없었으며 효소 생산에서는 p- galactosidase, urease, gelatinase, amylase 등 분해 효소 활성이 뛰어난 것으로 나타났으며 HPase 활성 이외에 catalase 활성도 있는 것으로 나타났다. 이 catalase 활성은 hydrogen peroxide 3% solution을 가할 때 거품(산소) 발생을 관찰한 것으로 HPase 시료에 Fe ion이 함유되어 있는 것으로 여겨진다.
이 catalase 활성은 hydrogen peroxide 3% solution을 가할 때 거품(산소) 발생을 관찰한 것으로 HPase 시료에 Fe ion이 함유되어 있는 것으로 여겨진다. 유일 탄소 원으로 서당 이용능력은 비교적 떨어지는 편으로 나타났으며 황산염이 다량 함유된 해수를 배지로 사용함에도 도 생성되지 않는 것으로 보아 혐기성 유기물 이용능력도 낮은 것으로 나타난다. 세균 유래 haloperoxidase는 주로 Pseudomonas 속과 방선균 중 Streptomyces 속에서 보고되고 있으며, 본 균주 A1460도 여러가지 측면에서 Streptomyces 속과 유사한 특성을 보이고 있다.
이 중 3종이 비교적 뚜렷한 HPase 활성을 보였으며 이중방선균 한 종류(A1460)가 가장 높은 활성을 나타내었다. 본 균주는 남해안 백도에서 채집한 동정되지 않은 해조류의 표면에서 분리된 방선균이다.
후속연구
이미 몇몇 Streptomyces amreo了acienm를 위시한 몇 종의 방선균과 Pseudomonas pyrrociniaee HPase 유전자가 보고된 바 있어(12, 16) 이들과의 연관성에 대한 연구가 향후 필요할 것이다. 또 비교적 높은 열 안정성을 이용하여 보다 빠르고 간편한 분리 정제 방법도 수행되어야 할 것이다.
4). 본 방선균 A1460 균주는 일반적인 배지에서 매우 잘 성장하며 HPase 활성도 높은 편이지만 그 유전적 특성을 연구하기 위해 해당 유전자의 분석이 향후 필요할 것으로 보인다. 이미 몇몇 Streptomyces amreo了acienm를 위시한 몇 종의 방선균과 Pseudomonas pyrrociniaee HPase 유전자가 보고된 바 있어(12, 16) 이들과의 연관성에 대한 연구가 향후 필요할 것이다.
본 방선균 A1460 균주는 일반적인 배지에서 매우 잘 성장하며 HPase 활성도 높은 편이지만 그 유전적 특성을 연구하기 위해 해당 유전자의 분석이 향후 필요할 것으로 보인다. 이미 몇몇 Streptomyces amreo了acienm를 위시한 몇 종의 방선균과 Pseudomonas pyrrociniaee HPase 유전자가 보고된 바 있어(12, 16) 이들과의 연관성에 대한 연구가 향후 필요할 것이다. 또 비교적 높은 열 안정성을 이용하여 보다 빠르고 간편한 분리 정제 방법도 수행되어야 할 것이다.
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