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문제 정의
- 산천어를 양식하는 경우 수컷이 암컷보다 일찍 성숙하여 암컷을 공격하는 문제가 있어 종묘생산에 어려움이 있다. 따라서 본 연구에서는 산천어의 인공 종묘생산시 활용할 수 있는 정자의 냉동보존 기술을 확보하고자, 산 천어 정자의 냉동 보존을 위한 적정 희석액과 동해방지제를 구-명하였다.
제안 방법
- 정액을 넣은 스트로는 평형 시간 없이 액체질소 증기 (-76°C)에서 two-step으로 냉동한 후, -196°C 액체질소에서 1일간 보관하였다. 냉동 보존한 정액의 수정 능력을 확인하기 위하여 20°C 증류수에서 빠르게 융해시킨 후 미리 준비한 알과 건식법으로 수정시켰다. 부화는 영동내수면연구소 부화동의 아트킨스 부화기 (47x265x80 cm)에 부화틀 (47x 5*8 5 cm)을 3단으로 쌓고 그 안에 각각의 실험 구별 3개의 부화 통을 설치하여 부화 시기까지 관리하였다.
- 4 g)를 사요하였다. 정액과 알을 채쥐하기 위하여 실험어를 200 ppm 농도의 3-aminobenzoic acid ethyl ester (MS-222, Sigma)에 마취시킨 다음해수와 배설물에 오염되지 않도록 주의하며 복부를 가볍게 문질러 정액과 알을 얻었다. 채취된 정액은 1.
- 103 g이었다. 정액의 spermatocrit는 micro-hematocrit법을 변형하여 즉정하였으며 정장의 pH와 삼투질농도 및 이온 농도를 측정을 위하여 정액을 12, 000rpm으로 15분간 원심분리한 후 그 상등액을 분리하여 분석하기 전까지 -80'C초저온냉동고에 보관하였다. 정장의 pH와 삼투질농도는 pH meter (Istek Model 735P, Korea)와 삼투압 즉정 기 (The Advanced™ Osmometer, USA)를 각각 이용하여 즉정하였으며, N*, a K+, CP, Ca 및 Mg 등의 이온과 glucose, protein은 생화학분석 기 (Fuji Dri-Chem 3500, Japan)로 조사하였다.
- 정액의 spermatocrit는 micro-hematocrit법을 변형하여 즉정하였으며 정장의 pH와 삼투질농도 및 이온 농도를 측정을 위하여 정액을 12, 000rpm으로 15분간 원심분리한 후 그 상등액을 분리하여 분석하기 전까지 -80'C초저온냉동고에 보관하였다. 정장의 pH와 삼투질농도는 pH meter (Istek Model 735P, Korea)와 삼투압 즉정 기 (The Advanced™ Osmometer, USA)를 각각 이용하여 즉정하였으며, N*, a K+, CP, Ca 및 Mg 등의 이온과 glucose, protein은 생화학분석 기 (Fuji Dri-Chem 3500, Japan)로 조사하였다. 산천어 정자의 냉동 보존에 적합한 희석액을 선정하기 위해 1차 실험에서는 무지개 송어에서 주로 사용되었던 Erdhal and Graham #6 (E&G#6; Erdhal and Graham, 1980)와 300 mM 잉ucose 용액을 DMSO와 함께 사용하였다.
대상 데이터
- 정장의 pH와 삼투질농도는 pH meter (Istek Model 735P, Korea)와 삼투압 즉정 기 (The Advanced™ Osmometer, USA)를 각각 이용하여 즉정하였으며, N*, a K+, CP, Ca 및 Mg 등의 이온과 glucose, protein은 생화학분석 기 (Fuji Dri-Chem 3500, Japan)로 조사하였다. 산천어 정자의 냉동 보존에 적합한 희석액을 선정하기 위해 1차 실험에서는 무지개 송어에서 주로 사용되었던 Erdhal and Graham #6 (E&G#6; Erdhal and Graham, 1980)와 300 mM 잉ucose 용액을 DMSO와 함께 사용하였다. 산천어정자의 냉동보존에 적합한 동해 방지제를 찾기 위한 2차 실험에서는 1 차 실험에서 결과가 좋았던 300 mM 이ucose 용액을 각기 다른 동해 방지제 [dimethyl sulfoxide (DMSO), methanol, glycerol]와 농도별로 혼합하여 사용하였다.
- 산천어 정자의 냉동 보존에 적합한 희석액을 선정하기 위해 1차 실험에서는 무지개 송어에서 주로 사용되었던 Erdhal and Graham #6 (E&G#6; Erdhal and Graham, 1980)와 300 mM 잉ucose 용액을 DMSO와 함께 사용하였다. 산천어정자의 냉동보존에 적합한 동해 방지제를 찾기 위한 2차 실험에서는 1 차 실험에서 결과가 좋았던 300 mM 이ucose 용액을 각기 다른 동해 방지제 [dimethyl sulfoxide (DMSO), methanol, glycerol]와 농도별로 혼합하여 사용하였다.
- 정액과 알을 채취하기 위한 실험어는 국립수산과학원 영동 내수면연구소에서 사육한산천어 어미로 암컷 10마리 (체장 26.0±2.7 cm, 체중 294.9±74.0 g)와 수컷 25마리(체장 25.6± 1.8 cm, 체중 219.7±38.4 g)를 사요하였다. 정액과 알을 채쥐하기 위하여 실험어를 200 ppm 농도의 3-aminobenzoic acid ethyl ester (MS-222, Sigma)에 마취시킨 다음해수와 배설물에 오염되지 않도록 주의하며 복부를 가볍게 문질러 정액과 알을 얻었다.
데이터처리
- 2°C 였다. 모든 실험은 3반복으로 실시하였으며, 각 실험 결과로부터 얻어진 모든 측정값들은 평균土표준 오차로 표시하였다. 측정값들 사이의 유의차 유무는 SPSS-통계 패키지 (version 10.
- 모든 실험은 3반복으로 실시하였으며, 각 실험 결과로부터 얻어진 모든 측정값들은 평균土표준 오차로 표시하였다. 측정값들 사이의 유의차 유무는 SPSS-통계 패키지 (version 10.5)를 사용하여 95%의 신뢰 수준에서 ANOVA와 Tukey's multiple range test 또는/-test로 검정하였다.
성능/효과
- 1一3과 같다. DMSO를 동해 방지제로 사용한 경우 발안율 및 부화율은 10% 농도가 다른 농도에 비해 유의하게 높았으며 (Fig. 1), methan이을 사용하였을 때 역시 10% 농도에서 가장 높은 발안율 및 부화율을 보였다 (Fig. 2). Glycer이을 사용하였을 경우 발안율 및 부화율은 농도에 따른 유의한 차이를 보이지 않았다 (Fig.
- 8%로 매우 높았다. E&G#6 희석액을 이용하여 냉동 보존한 경우 5% DMSO에서 발안율이 3.2± 0.5%로 가장 높았으나, 다른 DMSO 농도와 유의한 차이는 보이지 않았으며 대조구와 비교해볼 때 매우 낮은 수준이었다. 그러나 300 mM glucose를 사용하였을 때 5% 및 10% DMSO에서 각각 14.
- 5%로 가장 높았으나, 다른 DMSO 농도와 유의한 차이는 보이지 않았으며 대조구와 비교해볼 때 매우 낮은 수준이었다. 그러나 300 mM glucose를 사용하였을 때 5% 및 10% DMSO에서 각각 14.7±1.7%, 32.1±3.9%로 대조구를 제외한 나머지 실험 구보다 높았으며, E&G#6를 사용했을 때 보다 유의하게 높은 값을 보였다 (Table 2). 부화율은 발안율과 비슷한 경향이 었으며, 희석액으로 300 mM glucose를 사용하였을 때가 E&G#6를 사용했을 때보다 높았다 (Table 3).
- 3). 동해 방지 제별로 가장 높았던 발안율 및 부화율을 비교해보면 DMSO (10%)는 각각 25.6±1.8%, 19.3士 3.8%, methanol (10%)은 37.3±8.4%, 33.9±6.5%, glycerol (20%) 은 15.3±5.8%, 13.2±4.3%로 methanol이 산천어의정자 냉동보존 시 가 장 적합한 동해 방지제로 확인되었다.
- 5 mL 튜브에 넣어 밀봉한 후 실험에 사용될 때까지 얼음을 채운 ice box에서 보관하였다. 발안율과 부화율을 조사하기 위해 수정실험에 이용한 알은 평균 난경이 0.49 mm였고 무게는 0.103 g이었다. 정액의 spermatocrit는 micro-hematocrit법을 변형하여 즉정하였으며 정장의 pH와 삼투질농도 및 이온 농도를 측정을 위하여 정액을 12, 000rpm으로 15분간 원심분리한 후 그 상등액을 분리하여 분석하기 전까지 -80'C초저온냉동고에 보관하였다.
- , 1990).본 연구에서는 300 mM glucose를 희석 액으로 사용하였을 때가 E&G#6보다 냉동보존 효과가 좋은 것으로 나타났다. 이것은 일반적으로 glucose나 sucrose, trehalose와 같은 당류는 정자의 냉동과정 중 세포막의 인지질을 안정시키기 때문이다 (Gwo, 1994).
- 지금까지 동해 방지제로서 DMSO, glycerol 및 methanol 등이 주로 사용되어 왔으나, 이것들은 어종별로 종 특이성을 나타내기 때문에, 모든 어류에 적용될 수 있는 단일한 동해방지제는 아직 없는 것으로 보인다.본 연구에서는 산천어 정자보존을 위하여 동해방지제로methanol을 사용하였을 때 가장 좋은 결과를 보였다. 이것은 일본의 산천어와 amago salmon, O.
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