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문제 정의
- 본 연구는 한천 올리고당 혼합물의 기능성식품 소재로의 활용을 위해 저농도 유기산으로 한천을 가수분해하여 제조된 올리고당이 다량 함유된 한천 가수분해물의 생리활성 여부를 시험하여 그 결과를 보고하고자 한다.
제안 방법
- , USA)을 구입하여 이용하였다. 0.3～0.5% 농도의 유기산 용액에 한천을 1% 농도로 첨가하여 80～120℃의 가열 조건에서 각 반응시간에 따라 가수분해 처리하여 얻어진 시료를 실험에 사용하였다.
- Tyrosinase 활성 저해 작용은 tyrosine을 멜라닌으로 산화시키는 phenoloxidase의 활성을 저해하는 능력을 측정하였다(13). 즉, 시료용액 1 mL에 0.
- 그 다음으로 실험하고자하는 시료를 적절한 농도(20 μL/100 μL media/well)로 처리하고, 세포의 성장속도에 따라 36～48시간 정도 경과하면 배양액에 직접 WST-1용액을 처리하여, 1～2시간 incubation한 후 plate reader로 흡광도(450 nm/700 nm)를 측정하였다.
- 기능 특성이 확인된 시료는 활성 획분을 확인하기 위해 Sephadex G-15를 이용하여 겔 크로마토그래피를 행하였다. 유리칼럼(Φ2.
- 용출된 시료를 fraction collector를 이용하여 튜브에 각각 6 mL씩 분획하였다. 얻어진 획분별로 전당과 환원당 함량을 측정하였고, 전당과 환원당 함량에 따라 용출 획분을 분리하여 생리활성을 재측정하였다.
- 여기에 paper disk를 놓고 0.45 μm filter paper로 여과한 시험 용액을 일정량 분주한 다음 4℃에서 1시간 방치한 후, 37℃로 조절된 CO2 배양기(Sanyo Co., Japan)에서 48시간 배양한 다음 투명환을 관찰하였다.
- 여기에 기질로써 Hippuryl-His-Leu 용액(25 mg/2.5 mL sodium borate buffer) 100 μL를 가하여 다시 37℃에서 30분간 반응시킨 후 1 N HCl 500 μL를 가하여 반응을 정지시켰다(공시험은 시료 대신에 증류수를 사용하였으며, 대조구는 1 N HCl 500 μL를 가한 다음 ACE 조효소액 200 μL를 가함).
- 여기에 몰리브덴용액 1 mL를 가하여 발색시킨 다음, 520 nm에서 흡광도를 측정하여 표준 검량선으로부터 환원당을 정량하였다. 전당은 페놀-황산법(10) 즉, 시료 용액 0.5 mL에 5% phenol 용액 1 mL를 첨가하여 섞은 후 황산 5 mL를 직하시켜 20분간 상온 방치하여 발색시킨 후 470 nm에서 흡광도를 측정하여 표준 검량선으로부터 전당 함량을 측정하였다.
- 즉, 멸균 petri dish에 nutrient agar를 15 mL씩 부어 평판을 만들고 시험 균주들을 37℃에서 12시간 배양시킨 균액을 면봉을 이용하여 petri dish 상에 도말하여 접종하고, 25℃에서 2시간 전배양시킨 후 paper disk(8 mm, Advance Toyo, Japan)를 평판위에 올려놓고 그 위에 0.45 μm membrane filter로 여과한 가수분해물 25 및 50 μL를 멸균 마이크로피펫으로 가한 후 37℃로 조절된 배양기에서 배양하였다.
- 8) 1 mL를 가하여서 25℃에서 5분간 반응시킨 후 475 nm에서 흡광도를 측정하였다(D1). 한편, 가열하여 실활시킨 효소를 이용하여 동일한 실험을 행한 것(D2)과 시료 무첨가 실험(D3)으로부터 저해율을 산출하였다.
- 항충치능은 충치균 배양 배지인 BHI(brain heart infusion) broth에 1.5% agar를 첨가하여 기층용 배지를 만들어 멸균 petri dish에 분주하여 미리 평판을 제조하였고, 중층용 배지(0.75% agar 함유)를 2.5 mL씩 시험관에 분주한 다음 멸균한 후 50℃ 정도로 식힌 후 시험균액을 0.1 mL씩 가하여 잘 혼합하고 기층 배지용 평판에 도포한 다음 응고시켰다. 여기에 paper disk를 놓고 0.
대상 데이터
- Joo 등(8)이 보고한 한천 가수분해물의 제조 조건, 즉 한천(agar-agar)과 초산, 구연산, 젖산, 사과산, 숙신산 등의 유기산은 시판 제품(Sigma Co., USA)을 구입하여 이용하였다. 0.
- 45 μm membrane filter로 여과한 가수분해물 25 및 50 μL를 멸균 마이크로피펫으로 가한 후 37℃로 조절된 배양기에서 배양하였다. 배양 12시간과 24시간 경과 후 paper disk 주위의 투명환의 생성 여부로 항균성 유무를 판별하였고, 대조실험은 0.5% 유기산 용액에 1% 농도로 한천을 용해한 것을 사용하였다. 본 실험에 사용한 균주는 B.
- 5% 유기산 용액에 1% 농도로 한천을 용해한 것을 사용하였다. 본 실험에 사용한 균주는 B. cereus KCTC3674, B. subtilis KCTC3729, E. coli KCTC1039, Staphylococcus aureus KCTC1928 및 Entrobacter aerogenes KCTC2190 등으로 유전자은행(KCTC)로부터 분양받아 사용하였다.
- , Japan)에서 48시간 배양한 다음 투명환을 관찰하였다. 사용된 균주는 Streptococcus mutans KCTC3065로 KCTC로부터 분양받아 사용하였다.
- 005% L-cysteine 함유)가 들어있는 시험관에 가하여 37℃, 48시간 배양한 다음 성장 정도를 650 nm에서 흡광도를 측정하여 상대값으로 나타내었다(12). 사용한 비피더스균은 Bifidobacterium infantis KCTC3127, Bifidobacterium longum KCTC3128로 유전자은행에서 분양받은 것이었다.
데이터처리
- 4)Values with different superscripts within the same column are significantly different at p<0.05 by Duncan's multiple range test.
- 실험의 결과는 평균(mean)±표준편차(SD)로 나타내었으며, 유의성을 검증하기 위해 ANOVA 분석을 행한 후 p=0.05 수준에서 Duncan's multiple range test를 실시하였다.
이론/모형
- 세포성장 억제작용은 WST-1(4-[3-(4-iodophenyl)-2- (nitrophenyl)-2H-5-tetrazolia]-1,3-benzene disulfonate) 방법을 이용하여 측정하였다(Roche Applied Science Inc.). U-937 세포를 96 well plate에 104 cells/mL 농도로 심은 후 10% fetal bovine serum이 포함된 DME 배양액에서 키웠다.
- 한천의 분해조건별로 얻어진 유기산 가수분해물의 항균활성을 paper disk 법으로 측정하였다(11). 즉, 멸균 petri dish에 nutrient agar를 15 mL씩 부어 평판을 만들고 시험 균주들을 37℃에서 12시간 배양시킨 균액을 면봉을 이용하여 petri dish 상에 도말하여 접종하고, 25℃에서 2시간 전배양시킨 후 paper disk(8 mm, Advance Toyo, Japan)를 평판위에 올려놓고 그 위에 0.
- 환원당은 Somogyi법(9), 즉 시료용액 1 mL와 동(銅)시약 1 mL를 test tube에 각각 취하고 water bath에서 20분간 가열하여 산화 제1동(Cu2O)을 생성시켰다. 여기에 몰리브덴용액 1 mL를 가하여 발색시킨 다음, 520 nm에서 흡광도를 측정하여 표준 검량선으로부터 환원당을 정량하였다.
성능/효과
- 15(A450 nm/A700 nm)로 가수분해물 무첨가 구에 비해 90% 정도의 세포 성장을 억제하는 것으로 나타났다. C2와 C4 획분은 농도가 증가함에 따라 세포 억제능이 증가하여 3% 농도에서 약 90% 정도의 세포 성장 억제능을 나타내었다. 한편, 0.
- aureus에 대해서도 항균활성을 나타내었다. Citrate와 malate로 가수분해된 시료에서 55～80%의 tyrosinase 활성을 저해하는 것으로 나타났으나 전체적으로 활성이 낮았다. 한천 가수분해물의 비피더스균 증식 효과는 온도에 관계없이 lactate, citrate 및 malate로 가수분해된 시료에서 B.
- subtilis에 강한 항균활성을 나타내었고, 특히 malate 가수분해물에서 활성이 높은 것으로 나타났다. E. coli에 대해서도 확실한 항균 효과를 나타내었고, S. aureus에 대해서도 항균활성을 나타내었다. 한편, 효소적으로 가수분해된 한천가수분해물 혼합액의 경우 상기한 균들에 대해 미약한 항균활성을 나타내었고, 각 올리고당 획분으로 분획된 시료에서는 B.
- aureus에 대해서 항균활성이 확인된 바 있다(7). 가수분해 온도가 낮아 가수분해가 적은 시료에서는 상대적으로 항균활성이 낮은 것으로 나타났고, 높은 온도에서 처리된 시료가 항균활성이 높았다. 이러한 항균활성의 차이는 한천 가수분해물의 크기 즉, 올리고당의 크기에 따른 것으로 여겨지며, 구균보다는 Bacillus속과 같은 간균에 대해 항균 효과가 큰 것으로 나타났다.
- 올리고당류는 충치를 예방하거나 병원균의 생육을 억제하는 효과가 알려져 있는데, 이를 확인하기 위해 한천 가수분해물의 항균활성을 시험한 결과(Table 1), 가수분해 효율이 가장 좋았던 citrate와 malate 가수분해 시료의 경우(8), 100℃ 이상의 온도에서 가수분해된 시료에서 B. cereus와 B. subtilis에 강한 항균활성을 나타내었고, 특히 malate 가수분해물에서 활성이 높은 것으로 나타났다. E.
- 가수분해 온도가 낮아 가수분해가 적은 시료에서는 상대적으로 항균활성이 낮은 것으로 나타났고, 높은 온도에서 처리된 시료가 항균활성이 높았다. 이러한 항균활성의 차이는 한천 가수분해물의 크기 즉, 올리고당의 크기에 따른 것으로 여겨지며, 구균보다는 Bacillus속과 같은 간균에 대해 항균 효과가 큰 것으로 나타났다. 한편, St.
- 일반적으로 ACE 저해능이 있는 물질은 고혈압의 유발을 억제하는 효과가 있는 것으로 알려져 있으며, 특정의 저분자 peptide에서 그 효과가 발현되는 것으로 널리 알려져 있고, 몇몇 천연 물질에서도 발현되는 것으로 알려져 있다(17). 한천 가수분해물도 ACE 저해능을 가지는지를 실험한 결과(Table 4), 유기산의 종류와 처리 조건에 관계없이 저해능은 30% 이하로 활성이 거의 나타나지 않았다.
- 한천 가수분해물의 각종 생리활성을 실험한 결과, 100℃이상의 조건에서 가수분해된 시료에서 B. cereus와 B. subtilis에 강한 항균활성을 나타내었는데 특히, malate 가수분해물에서 활성이 높은 것으로 나타났으며, 일부 획분에서는 E. coli에 대해서도 확실한 항균 효과를 나타내었고, 약하지만 S. aureus에 대해서도 항균활성을 나타내었다. Citrate와 malate로 가수분해된 시료에서 55～80%의 tyrosinase 활성을 저해하는 것으로 나타났으나 전체적으로 활성이 낮았다.
- 한천 가수분해물의 갈변방지 효과를 확인하기 위해 tyrosinase 활성 저해능을 실험한 결과(Table 3), citrate와 malate로 가수분해된 시료에서 55～80%의 tyrosinase 활성을 저해하는 것으로 나타났다. 한편, 가수분해 처리 시간과 처리 온도에 따라 tyrosinase 활성 저해능의 차이를 보였는데, 특히 처리 시간에 따라 활성의 차이가 나타났다.
- Citrate와 malate로 가수분해된 시료에서 55～80%의 tyrosinase 활성을 저해하는 것으로 나타났으나 전체적으로 활성이 낮았다. 한천 가수분해물의 비피더스균 증식 효과는 온도에 관계없이 lactate, citrate 및 malate로 가수분해된 시료에서 B. infantis 균에 대해 증식효과가 확인되었다. 한천 가수분해물 에서는 ACE 저해능이 확인되지 않았으며, 항혈액응고활성도 거의 나타나지 않았다.
- 한천 가수분해물이 가지고 있는 특정 암세포에 대한 성장 억제나 저해효과를 통해 항암효과의 유무를 확인하기 위해각 조건에서 가수분해되어진 한천 가수분해물들의 세포 증식 억제능 실험을 행한 결과(Fig. 1), 가수분해물 무첨가구에서는 세포수가 약 1.2(A450 nm/A700 nm)였고, 0.5% 유기산 농도로 110℃에서 180분 처리된 시료 중에서 citrate와 lactate로 분해된 시료 획분에서 각각 70 및 60% 정도의 세포증식을 억제하는 것으로 나타났고, 그 외의 시료 획분은 세포 증식 억제효과가 그다지 높지 않았다. 한편, 세포 증식 억제 효과가 강하게 나타났던 두 시료(No.
- 이러한 항균활성의 차이는 한천 가수분해물의 크기 즉, 올리고당의 크기에 따른 것으로 여겨지며, 구균보다는 Bacillus속과 같은 간균에 대해 항균 효과가 큰 것으로 나타났다. 한편, St. mutans 균을 이용한 한천 가수분해물의 항충치 효과를 시험한 결과, 전 시험 시료에서 충치균 증식 억제 효과가 나타나지 않았다.
- 한천 가수분해물의 갈변방지 효과를 확인하기 위해 tyrosinase 활성 저해능을 실험한 결과(Table 3), citrate와 malate로 가수분해된 시료에서 55～80%의 tyrosinase 활성을 저해하는 것으로 나타났다. 한편, 가수분해 처리 시간과 처리 온도에 따라 tyrosinase 활성 저해능의 차이를 보였는데, 특히 처리 시간에 따라 활성의 차이가 나타났다. 한천 가수분해물의 tyrosinase 활성 저해능은 그다지 크지 않았고, 특히 120℃에서 처리된 시료에서 활성이 전반적으로 나타났으나 110℃ 이하의 온도에서 처리된 시료에서는 tyrosinase 활성 저해 정도가 미약하였다.
- 한편, 세포 증식 억제 효과가 강하게 나타났던 두 시료(No.17 & 18)에 대해 각각 Sephadex G-15 겔 크로마토그래피를 행하여(Fig. 2), 0.5% citrate로 110℃에서 180분 처리된 시료에서 7개의 획분으로 분획하였고, 얻어진 각 citrate 획분의 U-937 monocytic cell line을 이용한 세포 성장 억제능을 확인한 결과(Fig. 3), C3 획분은 1～3% 농도로 주입한 모두에서 세포수가 약 0.12～0.15(A450 nm/A700 nm)로 가수분해물 무첨가 구에 비해 90% 정도의 세포 성장을 억제하는 것으로 나타났다.
- 한천 가수분해물 에서는 ACE 저해능이 확인되지 않았으며, 항혈액응고활성도 거의 나타나지 않았다. 한편, 세포증식 억제능은 0.5%의 citrate와 lactate로 110℃에서 180분간 가수분해되어진 시료에서 강한 활성이 확인되었으며, 이들 시료를 정제하여 얻어진 특정 획분(C3과 L3)에서도 강한 세포 증식 억제능이 확인되었다.
- 황산기를 함유한 다당류가 일반적으로 가지는 항혈액응고활성(15,18)을 가지는 것으로 알려져 있는데, 본 한천 가수분해물의 혈액응고방지 효과가 있는지를 실험한 결과(Table 5), 본 연구에서 제조한 한천 가수분해물의 조건별 시료의 종류에 관계없이 35～50초의 APTT를 나타내어 대부분의 시료가 항혈액응고활성이 거의 없는 것으로 나타났다.
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