[논문]황금 추출물이 조골세포와 파골세포의 활성에 미치는 영향

신정민; 박찬경; 신은주; 조태형; 황인경

황금 추출물이 조골세포와 파골세포의 활성에 미치는 영향
Effects of Scutellaria radix Extract on Osteoblast Differentiation and Osteoclast Formation 원문보기

한국식품과학회지 = Korean journal of food science and technology, v.40 no.6 = no.202, 2008년, pp.674 - 679

신정민 (서울대학교 식품영양학과 생활과학연구소) , 박찬경 (서울대학교 식품영양학과 생활과학연구소) , 신은주 ((주)유니베라) , 조태형 ((주)남양에코넷기업본부) , 황인경 (서울대학교 식품영양학과 생활과학연구소)

초록
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황금 추출물이 조골세포와 파골세포에 미치는 영향을 세포수준에서 관찰하고자 하였다. 조골세포에 미치는 영향을 관찰하기 위하여, mouse calvaria 유래의 MC3T3-E1 osteoblastic cells를 이용하여 세포 생존률, 염기성 인산분해효소 활성, 골석회화 형성능을 측정하였다. 또한 미분화된 파골세포 전구세포로부터 파골세포의 생성 및 활성에 미치는 영향을 관찰하기 위하여, murine macrophage 유래인 Raw 264.7 cells를 이용하여 M-CSF와 RANKL을 처리하여 파골세포의 분화를 유도하였고, TRAP에 양성인 다핵세포의 형성을 관찰하여 황금추출물이 파골세포의 형성에 미치는 영향을 알아보았다. 황금 추출물이 MC3T3-E1 세포의 증식에 미치는 영향을 MTT assay로 측정한 결과, MC3T3-E1 세포는 처리한 황금 추출물의 농도에 의존적으로 세포의 증식이 촉진되는 경향을 나타내었으며 특히 $1{\mu}g/mL$ 농도에서 130.4%의 증식 효과를 나타내었다. 또한 황금 추출물이 세포에 독성을 나타내지 않는 범위($0.01-1{\mu}g/mL$)에서 MC3T3-E1 세포의 ALP activity를 측정한 결과, 농도에 의존적으로 ALP activity가 증가하였으며 $1{\mu}g/mL$ 농도에서 152.0%의 ALP 활성 증가효과를 나타내었다. 황금 추출물의 최적 작용 농도 $1{\mu}g/mL$에서 골석회화 형성능을 측정한 결과, 배양 시간에 따라 계속 증가하여 배양 20일째는 대조군에 비해 223.3%의 석회화 형성능을 나타내었다. 황금 추출물의 파골세포 분화억제 효과를 알아보기 위해 황금 추출물이 세포에 독성을 나타내지 않는 범위($0.01-10{\mu}g/mL$)에서 TRAP staining한 결과, 황금 추출물은 $0.0{1\mu}g/mL$ 농도에서 대조군에 비해 파골세포 분화를 50% 이상 감소시켰으며 농도 의존적으로 TRAP 양성 세포가 감소함을 관찰하였다. 이상의 결과로 미루어 볼 때, 황금 추출물이 골다공증을 포함한 골질환 예방에 효과가 있을 것으로 사료된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Scutellaria radix (SR) has been utilized as a traditional medicine for a variety of diseases including Rheumatoid arthritis and its major flavonoids - baicalein, baicalin, and wogonin - have been reported to exert beneficial health effects, including anti-bacterial, anti-viral, anti-inflammatory, and free-radical scavenging. However, the mechanisms underlying this effect remain poorly understood. The principal objective of this study was to determine the effect of SR on osteoblast and osteoclast cells. SR extract was prepared using 70% ethanol solvent. Osteoblastic MC3T3-E1 cells and osteoclast precursor Raw 264.7 macrophage cells were utilized. SR extract increased MC3T3-E1 cell proliferation and stimulated alkaline phosphatase activity dose-dependently, 152.0% of the control at concentration $1{\mu}g/mL$. Additionally, SR extract ($1{\mu}g/mL$) stimulated Bone nodule formation activity in MC3T3-E1 cells, approximately 223.3% of the control, 20 days after the exposure. In addition, SR extract significantly reduced the number of tartrate-resistant acid phosphatase-positive (TRAP+) multinucleated cells from Raw 264.7 cells. In conclusion, SR extract stimulates the proliferation and bioactivities of boneforming osteoblasts, and inhibits the activities of bone-resorbing osteoclasts to a certain degree.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

이 효소는 기질 특이성과 염기성 pH에서 최적의 활성을 나타내며 세포외막과 석회화 조직에서 높은 농도로 발견되어 석회화 과정 동안 무기인산의 운반, 세포분열이나 분화의 조절자로써 역할을 하므로 Stein 등(27)은 조골세포 활성표지인자로 ALP 활성도를 측정하도록 추천하였고, 여러 논문에서도 ALP 활성을 검색하였다(14,15,24,27,28). 그러므로 본 연구에서는 황금 추출물의 조골 세포 활성 및 분화 효과를 검사하는 방법으로 조골세포의 ALP 활성을 측정하였다. 황금 추출물을 처리한 MC3T3-E1 세포의 ALP 활성은 배양액만 처리한 대조군에 대한 비율로 나타냈으며 그 결과는 Fig.
따라서 본 연구는 황금 추출물이 골조직의 대표적인 세포인 조골세포와 파골세포에 미치는 영향을 세포수준에서 관찰하고자 하였다. 조골세포에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 MC3T3-E1 세포를 이용하였고, 미분화된 파골세포 전구세포로부터 파골세포의 생성 및 활성에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 Raw 264.
파골세포의 생성을 위해서는 receptor activator of NF-κB ligand(RANKL)와 macrophage colony stimulating factor(M-CSF)와 같은 두 종류의 cytokine이 필수적인데, 이러한 cytokine이 파골세포의 분화를 유도한다. 따라서 본 연구에서는 미부화된 파골세포 전구세포로부터 파골세포의 생성 및 활성에 미치는 영향을 관찰하기 위하여, murine macrophage 유래인 Raw 264.7 세포를 이용하여 M-CSF와 RANKL을 처리하여 파골세포의 분화를 유도하였고, TRAP에 양성인 다핵세포의 형성을 관찰하여 황금추출물이 파골세포의 형성에 미치는 영향을 알아보았다. 황금 추출물이 파골세포 전구세포인 Raw 264.
3%로 조골세포의 석회화 증가 효과를 관찰할 수 있었다. 따라서 본 연구에서는 황금 추출물이 MC3T3-E1 조골세포의 분화를 촉진하고, 석회화 형성능이 있음을 확인하였다.
황금 추출물이 조골세포와 파골세포에 미치는 영향을 세포수준에서 관찰하고자 하였다. 조골세포에 미치는 영향을 관찰하기 위하여, mouse calvaria 유래의 MC3T3-E1 osteoblastic cells를 이용하여 세포 생존률, 염기성 인산분해효소 활성, 골석회화 형성능을 측정하였다.
황금 추출물이 조골세포의 활성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 조골세포의 표지 효소로 알려진 ALP 활성을 측정하였다. 조골세포는 골 표면에 근접해 있으며 세포막에 당단백 효소인 alkaline phosphatase(ALP)를 가지고 있다.

제안 방법

세포의 현탁액을 4℃에서 10분간 shaking incubator에서 180 rpm의 속도로 흔들어준 후, 10분간 2,500×g에서 원심분리하여 상층액만 취하였다. ALP kit(EnzoLyte^TM pNPP Alkaline Phosphatase Assay Kit, Sigma Chemical Co.)을 이용하여 p-nitrophenyl phosphate로부터 가수분해된 p-nitrophenol (p-NP)의 생성량을 측정하여 활성도를 도출하였고, 단백질량으로 나누어 단위단백질 함량 당 효소 활성도를 산출하였다. 즉, 상층액 1 mL 중 50 µL를 96 well plate에 넣은 후 미리 만들어 둔 pNPP reation mixture(pNPP stock solution을 2X assay buffer로 100배 희석한 것, pNPP stock solution: pNPP vial에 증류수 250 µL 넣어서 녹인 용액)를 모든 well에 50 µL씩 넣어서 30분간 상온에서 반응시키고 다음 마지막에 stop solution을 모든 well에 50 µL씩 넣어 반응을 종결시켰고, microplate reader(Bio-rad)를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.
MC3T3-E1 세포를 6 well plate에 1×105 cells/well 농도로 분주한 후, 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양 후, 배지를 제거하고 석회화 유도를 위해 50 µg ascorbic acid, 10 mM β-glycerol phosphate가 첨가된 배지에 앞의 실험에서 결정된 황금 추출물의 최적작용 농도(1 µg/mL)를 맞춘 배양액을 분주하고 5일부터 20일까지 incubator에서 배양하였다.
MC3T3-E1 세포를 6 well plate에 각 1×105 cells/well 농도로 분주한 후, 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양 후, 배지를 제거하고 10% FBS, 1% 항생제(penicillin-streptomycin)가 첨가된 배지에 황금 추출물 농도를 배분시켜 만든 새로운 배양액을 분주하였다.
즉, 상층액 1 mL 중 50 µL를 96 well plate에 넣은 후 미리 만들어 둔 pNPP reation mixture(pNPP stock solution을 2X assay buffer로 100배 희석한 것, pNPP stock solution: pNPP vial에 증류수 250 µL 넣어서 녹인 용액)를 모든 well에 50 µL씩 넣어서 30분간 상온에서 반응시키고 다음 마지막에 stop solution을 모든 well에 50 µL씩 넣어 반응을 종결시켰고, microplate reader(Bio-rad)를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 단백질 양은 bovine serum albumin protein assay reagent를 이용하여 측정하였으며 효소 활성은 대조군에 대한 백분율로 나타내었다.
05 mg/mL농도의 MTT시약(10 µL/well)을 분주한 다음, 4시간 더 배양 후 배양액을 제거하고 침전물을 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 용해시켜 microplate reader(Bio-rad, Benchmark, Hercules, CA, USA)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 시료를 첨가하지 않은 배지만 넣고 배양시켰고, 대조군의 흡광도를 기준으로 세포생존률을 산출하였다.
alizarin은 무기질화된 세포의 기질에 염색되므로 석회화된 양과 염색 정도가 상호 비례한다. 따라서 시간에 따른 석회화 형성도를 확인하기 위해 염색된 석회화물을 10% cetylpyridinium chloride로 녹여 흡광도 값을 측정하여 상대활성을 나타낸다. 황금 추출물의 최적 작용농도(1 µg/mL)에서 alizarin red 염색법으로 골석회화 형성능을 측정한 결과, Fig.
조골세포에 미치는 영향을 관찰하기 위하여, mouse calvaria 유래의 MC3T3-E1 osteoblastic cells를 이용하여 세포 생존률, 염기성 인산분해효소 활성, 골석회화 형성능을 측정하였다. 또한 미분화된 파골세포 전구세포로부터 파골세포의 생성 및 활성에 미치는 영향을 관찰하기 위하여, murine macrophage 유래인 Raw 264.7 cells를 이용하여 M-CSF와 RANKL을 처리하여 파골세포의 분화를 유도하였고, TRAP에 양성인 다핵세포의 형성을 관찰하여 황금추출물이 파골세포의 형성에 미치는 영향을 알아보았다. 황금 추출물이 MC3T3-E1 세포의 증식에 미치는 영향을 MTT assay로 측정한 결과, MC3T3-E1 세포는 처리한 황금 추출물의 농도에 의존적으로 세포의 증식이 촉진되는 경향을 나타내었으며 특히 1 µg/mL 농도에서 130.
배지를 제거하고 FBS가 첨가된 α-MEM배지에 분화인자(receptor activator of NF-κB ligand 100 ng/mL, macrophage colony-stimulating factor 25 ng/mL)와 황금 추출물의 농도를 배분시켜 만든 새로운 배양액을 분주하여 5일간 배양하였다. 배양이 끝난 후 배양액을 제거하고 PBS로 세척 후 fixative solution(citrate solution 25 mL+acetone 65 mL+formaldehyde 8 mL)으로 30초간 고정한 후 증류수로 세척 후 acid phosphatase leukocyte kit(Sigma Chemical Co.)를 이용하여 tartrate-resistant acid phosphatase(TRAP) 염색을 시행하였다. TRAP 염색은 기질로 naphthol AS-BI phosphate (Sigma Chemical Co.
배지를 제거하고 FBS가 첨가된 α-MEM배지에 분화인자(receptor activator of NF-κB ligand 100 ng/mL, macrophage colony-stimulating factor 25 ng/mL)와 황금 추출물의 농도를 배분시켜 만든 새로운 배양액을 분주하여 5일간 배양하였다.
세포를 고정시킨 후, AR solution(2 mL/well)으로 10분간 염색하고 증류수로 5번 세척한 뒤 염색되지 않은 부분은 PBS로 씻어주면서 제거하고 표면이 너무 마르지 않게 PBS로 조금 적셔주면서 현미경으로 석회화 형성 정도를 관찰하였다. 석회화형성 확인 후 10% cetylpyridinium chloride를 첨가한 10 mM sodium phosphate(pH 7.0) 용액을 well에 2 mL씩 첨가하여 15분간 녹이고 염색된 정도를 microplate reader(Bio-rad)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였고 대조군의 흡광도를 기준으로 골 석회화 형성능을 계산하였다.
2로 조정하였다. 세포를 고정시킨 후, AR solution(2 mL/well)으로 10분간 염색하고 증류수로 5번 세척한 뒤 염색되지 않은 부분은 PBS로 씻어주면서 제거하고 표면이 너무 마르지 않게 PBS로 조금 적셔주면서 현미경으로 석회화 형성 정도를 관찰하였다. 석회화형성 확인 후 10% cetylpyridinium chloride를 첨가한 10 mM sodium phosphate(pH 7.
) 용액을 사용하였다. 염색이 끝난 후 광학현미경을 이용하여 핵이 3개 이상인 TRAP-양성 다핵세포를 계수하여 파골세포의 생성지표로 삼았다.
황금 추출물이 조골세포와 파골세포에 미치는 영향을 세포수준에서 관찰하고자 하였다. 조골세포에 미치는 영향을 관찰하기 위하여, mouse calvaria 유래의 MC3T3-E1 osteoblastic cells를 이용하여 세포 생존률, 염기성 인산분해효소 활성, 골석회화 형성능을 측정하였다. 또한 미분화된 파골세포 전구세포로부터 파골세포의 생성 및 활성에 미치는 영향을 관찰하기 위하여, murine macrophage 유래인 Raw 264.
즉, MC3T3-E1 세포를 1×104 cells/well 농도로 96 well plate에 100 µL씩 분주한 후 24시간동안 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양 후, 배지를 제거하고 FBS가 첨가되지 않은 배지에 황금 추출물을 농도(0.01, 0.1, 1, 10, 100, 1000 µg/mL)를 배분시켜 만든 새로운 배양액을 분주하였다.
황금 추출물은 황금 100 g에 70% 에탄올 1L를 첨가 후 60℃ 항온수조에서 3시간 동안 진탕하는 과정을 3회 반복하였으며 여과, 감압, 농축 후 동결건조하여 분말의 시료를 얻었고, −80℃ 냉동고에 보관하면서 실험에 사용하였다.
그러므로 본 연구에서는 황금 추출물의 조골세포 증식효과를 검색하고자 배양 시 안정성을 보이는 MC3T3-E1 세포주를 이용하였다. 황금 추출물이 조골 세포의 증식에 미치는 영향을 알아보기 위해 MTT assay를 실시하였고, MC3T3-E1 세포의 생존률은 배양액만 처리한 대조군에 대한 백분율로 나타내었으며 그 결과는 Fig. 1과 같다. MC3T3-E1 세포는 처리한 황금 추출물의 농도에 의존적으로 세포의 증식이 촉진되는 경향을 나타내었으며 특히 1 µg/mL 농도에서 130.

대상 데이터

10% Fetal bovine serum과 1% 항생제(penicillin/streptomycin)가 첨가된 Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)을 배양액으로 5% CO2 incubator를 이용하여 37℃에서 배양하면서 세포가 70-80% 정도 증식되었을 때, 2-3일 간격으로 계대 배양하면서 실험에 사용하였다.
MC3T3-E1 세포는 10% fetal bovine serum과 1% 항생제(penicillin-streptomycin)가 포함된 α-MEM 배지에서 배양하였다. 37℃, 5% CO₂ 조건을 유지하는 incubator(Sanyo Electric Biochemical Co., Sanyo, Ora-gun, Japan)에서 배양하였으며, 세포가 충분한 증식이 일어나는 2-3일 간격으로 계대 배양하면서 실험에 사용하였다.
Murine macrophage 유래인 Raw 264.7 cells은 서울대학교 한국세포주 은행에서 분양받았다. 10% Fetal bovine serum과 1% 항생제(penicillin/streptomycin)가 첨가된 Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)을 배양액으로 5% CO₂ incubator를 이용하여 37℃에서 배양하면서 세포가 70-80% 정도 증식되었을 때, 2-3일 간격으로 계대 배양하면서 실험에 사용하였다.
)를 이용하여 tartrate-resistant acid phosphatase(TRAP) 염색을 시행하였다. TRAP 염색은 기질로 naphthol AS-BI phosphate (Sigma Chemical Co.)를 사용하였고, 염색제로는 fast garnet GBC(Sigma Chemical Co.) 용액을 사용하였다. 염색이 끝난 후 광학현미경을 이용하여 핵이 3개 이상인 TRAP-양성 다핵세포를 계수하여 파골세포의 생성지표로 삼았다.
확립된 골조직유래 여러 가지 세포주 중 골세포의 세포활성과 관련된 연구에서 유용하게 이용되고 있는 mouse calvaria 유래의 MC3T3-E1 osteoblastic cell은 in vivo 뼈 형성 과정 중 세포의 증식, 분화, 석회화 등 골아세포와 유사한 대사적 특징을 가지고 있으며 적절한 자극 하에 골수의 stromal cell이나 결합조직의 mesenchymal stem cell이 분화되어 생긴 것으로, 조골세포 전구체(osteoprogenitor)로부터 전조골세포(pre-osteoblast)와 조골세포, 그리고 골내막 세포(bone lining cell) 또는 골세포(osteocyte)로 분화되는 과정에 속하는 세포이며(23,24) 특히 기질에 무기질을 형성(mineralization of matrix)하는 성질도 가지고 있다(25). 그러므로 본 연구에서는 황금 추출물의 조골세포 증식효과를 검색하고자 배양 시 안정성을 보이는 MC3T3-E1 세포주를 이용하였다. 황금 추출물이 조골 세포의 증식에 미치는 영향을 알아보기 위해 MTT assay를 실시하였고, MC3T3-E1 세포의 생존률은 배양액만 처리한 대조군에 대한 백분율로 나타내었으며 그 결과는 Fig.
본 실험에 사용한 황금은 러시아에서 재배하여 세절 후 자연건조 시킨 러시아산 황금((주)유니베라에서 제공)을 사용하였다. 황금 추출물은 황금 100 g에 70% 에탄올 1L를 첨가 후 60℃ 항온수조에서 3시간 동안 진탕하는 과정을 3회 반복하였으며 여과, 감압, 농축 후 동결건조하여 분말의 시료를 얻었고, −80℃ 냉동고에 보관하면서 실험에 사용하였다.
본 연구에 사용한 MC3T3-E1 세포는 mouse calvaria 유래의 조골세포로서 ATCC(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)로부터 구입하였고, 세포배양에 필요한 α-MEM(α-minimum essential medium)배지, FBS(fetal bovine serum), penicillin-streptomycin 등은 GIBCO(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)사로부터 구입하였다.
따라서 본 연구는 황금 추출물이 골조직의 대표적인 세포인 조골세포와 파골세포에 미치는 영향을 세포수준에서 관찰하고자 하였다. 조골세포에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 MC3T3-E1 세포를 이용하였고, 미분화된 파골세포 전구세포로부터 파골세포의 생성 및 활성에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 Raw 264.7 세포를 이용하였다.

데이터처리

Values with different letters were significantly different at p<0.05 by Duncan’s multiple range test.
1판 프로그램을 이용하여 평균과 표준편차, 대조군에 대한 백분율과 표준편차 등을 표시하였다. 분산분석(ANOVA) 후 Duncan의 다중범위 유의성 검증을 실시하였다. 이때 α값은 p<0.
통계처리는 SAS/STAT TM User’s guide 9.1판 프로그램을 이용하여 평균과 표준편차, 대조군에 대한 백분율과 표준편차 등을 표시하였다.

이론/모형

10% Fetal bovine serum과 1% 항생제(penicillin/streptomycin)가 첨가된 Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)을 배양액으로 5% CO₂ incubator를 이용하여 37℃에서 배양하면서 세포가 70-80% 정도 증식되었을 때, 2-3일 간격으로 계대 배양하면서 실험에 사용하였다. 세포 생존률은 MTT assay(20)로 측정하였다.
조골세포의 성장정도는 Green 등의 방법(20)에 따라 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide(MTT, Sigma Chemical Co. St. Louis, MO, USA) 시약을 사용하여 MTT tatrazolium이 자주색의 불용성 formazan으로 환원되는 정도를 570 nm에서 측정함으로써 살아있는 세포의 생존율을 구하는 MTT assay로 측정하였다. 즉, MC3T3-E1 세포를 1×10⁴ cells/well 농도로 96 well plate에 100 µL씩 분주한 후 24시간동안 37℃, 5% CO₂ incubator에서 배양 후, 배지를 제거하고 FBS가 첨가되지 않은 배지에 황금 추출물을 농도(0.
7 세포를 이용하여 M-CSF와 RANKL을 처리하여 파골세포의 분화를 유도하였고, TRAP에 양성인 다핵세포의 형성을 관찰하여 황금추출물이 파골세포의 형성에 미치는 영향을 알아보았다. 황금 추출물이 파골세포 전구세포인 Raw 264.7 세포의 증식에 미치는 영향을 알아보기 위해 MTT assay(20)를 실시하였다. 세포 생존률은 배양액만 처리한 대조군에 대한 백분율로 나타내었으며 그 결과는 Fig.

성능/효과

MC3T3-E1 세포는 처리한 황금 추출물의 농도에 의존적으로 세포의 증식이 촉진되는 경향을 나타내었으며 특히 1 µg/mL 농도에서 130.4%의 증식 효과를 나타내었고 그 이상의 농도에서는 조골세포의 증식이 억제되었다.
또한 황금 추출물이 세포에 독성을 나타내지 않는 범위(0.01-1 µg/mL)에서 MC3T3-E1 세포의 ALP activity를 측정한 결과, 농도에 의존적으로 ALP activity가 증가하였으며 1 µg/mL 농도에서 152.0%의 ALP 활성 증가효과를 나타내었다.
본 연구에 사용된 황금 추출물의 수율은 30.4%이었으며 추출물 중 baicalin, baicalein, wogonin, melatonin의 함량은 각각 162.16, 10.60, 7.19, 2.15 ppm이었다. 골기질의 성분을 주로 합성하는 조골세포는 미분화간엽세포로부터 유래하며(21), 활발한 대사 작용으로 석회화과정에 중요한 역할을 하고(22), 세포막에 당단백 효소인 염기성인산분해효소를 갖고 있다.
이상의 실험결과를 통해서 황금 추출물이 조골세포의 증식 및 분화를 촉진시키며, 파골세포 분화를 억제하는 효과가 있음을 알 수 있었다. 따라서 황금 추출물은 골흡수 관련 질환 및 골질환 예방에 효과가 있을 것으로 사료된다.
즉, 대조군에서는 TRAP 양성 세포가 한 well당 평균 134개가 관찰되었는데 비해 황금 추출물 0.01 µg/mL 농도에서는 TRAP 양성 세포가 평균 69.6개, 0.1 µg/mL 농도에서는 평균 36.6개, 1 µg/mL 농도에서는 평균 33.0개, 10 µg/mL 농도에서는 평균 7.0개가 관찰되었다(Table 1, Fig. 5)
황금 추출물의 최적 작용 농도 1 µg/mL에서 골석회화 형성능을 측정한 결과, 배양 시간에 따라 계속 증가하여 배양 20일째는 대조군에 비해 223.3%의 석회화 형성능을 나타내었다.
황금 추출물의 최적 작용농도(1 µg/mL)에서 alizarin red 염색법으로 골석회화 형성능을 측정한 결과, Fig. 3에서와 같이 추출물 처리 후 5일째는 대조군에 비해 106.6%, 10일째는 130.8%, 15일째는 167.0%, 20일째는 223.3%로 조골세포의 석회화 증가 효과를 관찰할 수 있었다.
황금 추출물의 파골세포 분화억제 효과를 알아보기 위해 황금 추출물이 세포에 독성을 나타내지 않는 범위(0.01-10 µg/mL)에서 TRAP staining한 결과, 황금 추출물은 0.01 µg/mL 농도에서 대조군에 비해 파골세포 분화를 50% 이상 감소시켰으며 농도 의존적으로 TRAP 양성 세포가 감소함을 관찰하였다.
황금 추출물이 MC3T3-E1 세포의 증식에 미치는 영향을 MTT assay로 측정한 결과, MC3T3-E1 세포는 처리한 황금 추출물의 농도에 의존적으로 세포의 증식이 촉진되는 경향을 나타내었으며 특히 1 µg/mL 농도에서 130.4%의 증식 효과를 나타내었다.
황금 추출물이 세포에 독성을 나타내지 않는 범위(0.01-1 µg/mL)에서 ALP activity를 측정한 결과, 황금 추출물은 농도 의존적이고 유의적으로 ALP activity가 증가하였으며 1 µg/mL 농도에서 152.0%의 ALP 활성 증가효과를 나타내었다.
황금 추출물이 세포에 독성을 나타내지 않는 범위(0.01-10 µg/mL)에서 TRAP 염색한 결과, 황금 추출물은 0.01 µg/mL 농도에서 대조군에 비해 파골세포 분화를 50%이상 감소시켰으며(Table 1, Fig. 5), 농도 의존적이었다.

후속연구

이상의 실험결과를 통해서 황금 추출물이 조골세포의 증식 및 분화를 촉진시키며, 파골세포 분화를 억제하는 효과가 있음을 알 수 있었다. 따라서 황금 추출물은 골흡수 관련 질환 및 골질환 예방에 효과가 있을 것으로 사료된다.
1 mg/mL 농도에서 조골세포주 MG-63의 증식을 유의적으로 증가시켰다. 본 연구에서도 황금 추출물에 함유된 페놀 화합물의 작용에 의한 조골세포 증식효과의 가능성이 있으므로 이는 추후 연구를 통하여 baicalein, baicalin, wogonin, melatonin 성분이 조골 세포의 증식에 미치는 효과를 분석하여 검증해야 할 것으로 사료된다.
ALP는 조골 세포의 분화에 발현되는 표식인자(biomarker)이므로 이 결과에 의해 황금 추출물이 조골세포의 분화를 촉진하는 가능성이 있음을 유추할 수 있다. 이런 분화 촉진 효과가 황금에 함유된 유효성분 중 단일 성분에 의한 영향인지, 복합적 상승 작용에 의한 것인지는 향후의 연구로 규명하여야 할 것이다.
이상의 결과로 미루어 볼 때, 황금 추출물이 골다공증을 포함한 골질환 예방에 효과가 있을 것으로 사료된다.
이러한 연구로 미루어 보아 황금에 존재하는 폴리페놀 물질이 파골세포의 분화억제 효과를 보이는 것으로 유추할 수 있다. 이에 황금 추출물 중 폴리페놀계통의 화합물 각각에 대한 파골 세포 분화 억제에 관한 더 많은 연구가 이루어져야 할 것이다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	황금 추출물의 세포에 독성을 나타내지 않은 범위에서 조골세포 표지 효소인 alkaline phosphatase 활성을 측정한 결과는?	황금 추출물이 세포에 독성을 나타내지 않는 범위(0.01-1 µg/mL)에서 ALP activity를 측정한 결과, 황금 추출물은 농도 의존적이고 유의적으로 ALP activity가 증가하였으며 1 µg/mL 농도에서 152.0%의 ALP 활성 증가효과를 나타내었다. ALP는 조골 세포의 분화에 발현되는 표식인자(biomarker)이므로 이 결과에 의해 황금 추출물이 조골세포의 분화를 촉진하는 가능성이 있음을 유추할 수 있다.
	뼈의 재형성에 관여하는 두 종류 세포는 어떤 역할을 하는가?	이러한 뼈의 재형성(bone remodeling)에는 두 종류의 특수한 기능을 하는 세포가 관여한다. 파골세포는 뼈를 흡수하는 반면, 조골세포는 뼈기질을 합성하고 채우는 역할을 한다. 따라서 골량은 이러한 세포의 상대적인 기능에 의존하게 된다.
	황금에 함유된 페놀 화합물 중 가장 많이 함유된 물질은?	뿌리에는 35% 이상의 페놀화합물을 포함하며 노란색을 띄기 때문에 황금(黃芩: golden root)이라 한다. 황금은 baicalin, baicalein, wogonin이 많이 함유되어 있으며, 그 중 baicalin이 가장 많이 함유되어 있다. 오래전부터 우리나라, 중국, 일본 등에서 황금을 항산화 효과와 함께 소염성 해열, 진통, 지사, 염증성 결막염, 두통, 위염, 장염 등에 사용되어 왔으며 최근에는 고혈압, 동맥경화, 피부질환, 불면, 감기, 상습유산에도 사용되고 있다(16).

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용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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