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문제 정의
- 또한 한국인의 HCV genotypee 1 b가 주로 많은 것으로 보고되었다(H). 그러므로 본 연구에서는 한국인의 HCV genotype에 적용 가능하면서, RNA 검출에 영향을 미치는 여러 조건들의 검증을 통한 혈장분획물 질에서 최적의 민감도와 특이도를 보이는 HCV RNA를 검출할 수 있는 방법을 확립하고자 하였다.
- 하지만 연구들 간의 HCV RNA 검출의 민감도와 특이도의 차이를 보이고 있다. 또한 최대의 민감도와 특이도를 보이는 방법을 개발함으로서 혈액 내에 있는 한 개의 HCV genome까지 검출하는 것이 여러 연구자들의 목표라 할 수 있다. 본 연구의 목표 중 하나는 한국인에게 주로 분포하고 있는 HCV genotype을 최대한으로 검출할 수 있는 방법의 확립이다.
- 본 실험에서는 RNA 추출 방법이 HCV RNA 검출감도에 미치는 영향을 확인하여 민감도와 특이도가 높은 방법을 선별하고자 하였다. 실험에 사용한 RNA 추출 방법은 컬럼을 이용하는 방법과 guanidine salts lysis 방법이다.
- 또한 최대의 민감도와 특이도를 보이는 방법을 개발함으로서 혈액 내에 있는 한 개의 HCV genome까지 검출하는 것이 여러 연구자들의 목표라 할 수 있다. 본 연구의 목표 중 하나는 한국인에게 주로 분포하고 있는 HCV genotype을 최대한으로 검출할 수 있는 방법의 확립이다. 이전의 연구 결과에 의하면 한국인이 가장 많이 가지고 있는 HCV genotypee 1 b로서 약 70% 이상의 분포를 보이고있는 것으로 나타났다(11).
- 수행하였다. 우선 각 primer의 적절한 결합(annealing) 온도를 결정하고자 하였다. 앞의 방법으로 추출한 RNA를 이용하여 여러 온도에서 PCR을 수행한 결과, primer 4의 경우, 결합온도 48。(2에서 250 IU/ml까지 검출할 수 있었으며, primer 5의 경우, 결합 온도 481와 52。<3에서 역시 250 IU/ml까지 검출할 수 있었다(Table 2).
- 최적의 민감도와 특이도를 보이는 nested PCR을 조건을 확립하기 위하여 primer의 농도와 1차 PCR 산물의 농도를 결정하고자 하였다. 10 pmol, 30 pmol, 50 pmol의 primer 농도와 1 gl, 5 |il, 10 山의 1차 PCR 산물을 실험에 이용하였다.
제안 방법
- HCV RNA 검출을 위한 PCR 반응은 2단계 반응인 nested PCR을 수행하였다. 우선 각 primer의 적절한 결합(annealing) 온도를 결정하고자 하였다.
- 온도 조건은 1차 PCR, nested PCR 모두 pre-denaturation은 95℃ 3분, denaturation 95℃ 30 추로 하였고, primer template에 결합하는 온도는 각각 42℃, 48℃, 52℃, 5YC를 사용하여 30회 반복하여 증폭하였다. Nested PCR 시가장 높은 감도를 나타내는 적절한 primer 양과 1차 PCR 산물의 농도를 결정하기 위하여, 10 pmol, 30 pmol, 50 pmol 의 primer와 1 ㎕, 5 ㎕, 10 ㎕의 1 차 PCR 산물을 이용하였다. PCR의 산물은 2% agarose gel (Sigma chemical Co.
- Nested PCR 시가장 높은 감도를 나타내는 적절한 primer 양과 1차 PCR 산물의 농도를 결정하기 위하여, 10 pmol, 30 pmol, 50 pmol 의 primer와 1 ㎕, 5 ㎕, 10 ㎕의 1 차 PCR 산물을 이용하였다. PCR의 산물은 2% agarose gel (Sigma chemical Co., USA)에 전기영동하여 ethidim bromide로 염색하여 관찰하였다.
- cDNA 합성 및 first PCR, nested PCRe GeneAmp TCR system 9700 (Perkin Elmer Co.. USA)을 사용하여, RNA TCR kit Ver. 2.1. (TaKaRa Shuzo Co.
- Japa효)을 이용하여 실시하였다. cDNA 합성은 AMV (Avian Myeloblastosis Virus) 역전사효소(reverse transciiptase)를 이용하였으며, 42℃S 50℃’ 58℃의 조건 중에서 최적 역전사 효소 반응 온도를 결정하였다. HCV RNA 10 ㎕를 포함하여 총반응 부피는 20 ㎕를 이용하였다.
- AW1 과 AW2 buffer를 이용하여 세척한 후 Spin column을 새로운 tube에 옮긴 후 70 ㎕ 혹은 140 ㎕의 buffer를 넣은 후 실온에서 1분 동안 반응시킨 후 원심분리하여 얻은 HCV RNA 용액을 핵산 증폭에 이용하였다. 그 외에 최적의 HCV RNA 추줄 조건을 확립하기 위하여 Accuprep Viral RNA Extraction Kit (Bioneer), Viral RNA premate (Bioneer), Ultraspec-II RNA Isolation System (Biotext) 등을 사용하여 RNA을 추출하였다. HCV RNA 추출은 각각의 킷트에서 제시하는 방법에 따라 수행하였다.
- 0 으로는 완제품에 대한 시험을 보증할 수 없으며, 일반적으로 항체의 농도가 높을수록 PCR에서 위음성이 나타난다고 보고하고 있다(14). 따라서 본 실험에서는 COBAS amplicor HCV 2.0과 핵산 증폭시험을 비교하여 실험하였다. 결과에서도 알 수 있듯이 COBAS amplicor HCV 2.
- 실험에 이용한 혈장분획제제는 알부민 (albumin), 근육주사용 항체 (IMUG), 정맥 주사용 항체 (IVIG), 혈액응고 팩터vm, 혈액응고 팩터IX, 그리고 안티트롬빈 m 이다. 또한 핵산 증폭시험의 효율성을 비교하기 위하여 본 실험에서 조건을 잡은 핵산 증폭시험과 HCV RNA 검출에 가장 많이 사용되고 있는 COBAS ampUcor HCV 2.0 (Roche)을 비교하여 실험하였다. 그 결과, 핵산 증폭시험의 경우 혈장분획물질에서 100 IU/ml 농도까지 HCV RNA를 검출할 수 있었으며, COBAS amplicor HCV 2.
- 실제로 혈장 분획물질에서 HCV RNA 검출의 민감도와 특이도를 확인하기 위하여 HCV를 여러 종류의 혈장 분획물질들에 주입하여 핵산 증폭시험을 수행하였다. 실험에 이용한 혈장분획제제는 알부민 (albumin), 근육주사용 항체 (IMUG), 정맥 주사용 항체 (IVIG), 혈액응고 팩터vm, 혈액응고 팩터IX, 그리고 안티트롬빈 m 이다.
- 핵산증폭시험은 outer primers와 inner primers# 이용한 두 단계를 통한 핵산 증폭 방법인 nested IPR올 이용하였다. 온도 조건은 1차 PCR, nested PCR 모두 pre-denaturation은 95℃ 3분, denaturation 95℃ 30 추로 하였고, primer template에 결합하는 온도는 각각 42℃, 48℃, 52℃, 5YC를 사용하여 30회 반복하여 증폭하였다. Nested PCR 시가장 높은 감도를 나타내는 적절한 primer 양과 1차 PCR 산물의 농도를 결정하기 위하여, 10 pmol, 30 pmol, 50 pmol 의 primer와 1 ㎕, 5 ㎕, 10 ㎕의 1 차 PCR 산물을 이용하였다.
- Primer 선별에 이용한 표준 유전자는 HCV-lb (accession number D5O485)를 이용하였다. 적은 양의 RNA를 검출해야 하는 한계를 극복하기 위하여 PCR을 nested PCR로 수행하고자 하였으며, 그에 맞추어 외부 PCR primers와 유전자 안쪽 부분에 외부 PCR primers와 겹치거나, 또는 겹치지 않도록 내부 PCR primers를 설계하였다.
- 처리된 검체는 working master mix가 담긴 mbe에 넣은 후 COBAS amplicor™ analyzer (Roche Diagnostic Systems, USA)에 장착하였다. 증폭과 검출은 자동적으로 수행되며, A660에서 측정하여 결과를 판정하였다. 마지막 단계에서 증폭된 biotinylated amplicons을 변성 시켜 반응하면 HCV 특이물질(ptobe)이 부착된 자석에 잡히게 된다.
- 5 ml의 DEPC를 처리한 증류수에 녹여 100, 0)0 IU/ml의 농도로 이용하였다. 핵산 증폭시험의 검출 한계를 측정하기 위한 실험에는 HCV RNA 표준품을 HCV RNA가 음성인 사람의 혈장에 주입하거나 희석하여 이용하였다.
대상 데이터
- 하였다. 10 pmol, 30 pmol, 50 pmol의 primer 농도와 1 gl, 5 |il, 10 山의 1차 PCR 산물을 실험에 이용하였다. 실험 결과, primer 농도가 10 pmol 보다는 30 pmol 이나 50 pmol일 때 밴드가 더 진한 것을 알 수 있었다 (Fig.
- cDNA 합성은 AMV (Avian Myeloblastosis Virus) 역전사효소(reverse transciiptase)를 이용하였으며, 42℃S 50℃’ 58℃의 조건 중에서 최적 역전사 효소 반응 온도를 결정하였다. HCV RNA 10 ㎕를 포함하여 총반응 부피는 20 ㎕를 이용하였다. 핵산증폭시험은 outer primers와 inner primers# 이용한 두 단계를 통한 핵산 증폭 방법인 nested IPR올 이용하였다.
- HCV RNA를 검출하기 위한 핵산 증폭시험에 이용한 HCV RNA는 NIBSC (National Institute for Biological StMidard and Control, England)로부터 분양받은 HCV RNA WHO 국제표준품(96/790), 50, 000 lU/ml을 사용하였다. 각 바이알을 0.
- 기존에 발표된 여러 자료들을 바탕으로 HCV genotype에서 가장 많이 분포하는 것으로 있는 알려진 5'-untranslated region에서 5개의 후보 primer set를 선별하였다(Table 1). Primer 선별에 이용한 표준 유전자는 HCV-lb (accession number D5O485)를 이용하였다.
- 왜냐 하면이 위치가 HCV 바이러스들 간에 가장 많이 일치하는 부분 (conserved region)说로 시료에 존재하는 HCV RNA 검출 시에 놓치는 HCV 바이러스가 없도록 하기 위하여 주로 사용된다(4). 본 실험에서도 5'-UTR 부분에 있는 5종류의 primer 중 여러 조건을 통한 실험 결과 가장 적절하다고 보여지는 primer를 선별하였다. 그러므로 적절한 핵산 증폭시험의 조건을 확립하기 위한 변수들로서, 역전사효소 반응의 최적 온도와 primer의 농도, 결합 온도, MgCl2 농도, 1차 PCR 산물의 양 등 다양한 조건들을 비교하여 실험하였으 며 그 결과 HCV RNA 검출에 최적화된 핵산 증폭시험을 확립하였다.
- 핵산 증폭시험을 수행하였다. 실험에 이용한 혈장분획제제는 알부민 (albumin), 근육주사용 항체 (IMUG), 정맥 주사용 항체 (IVIG), 혈액응고 팩터vm, 혈액응고 팩터IX, 그리고 안티트롬빈 m 이다. 또한 핵산 증폭시험의 효율성을 비교하기 위하여 본 실험에서 조건을 잡은 핵산 증폭시험과 HCV RNA 검출에 가장 많이 사용되고 있는 COBAS ampUcor HCV 2.
- 실험예 이용한 혈장 분획물질은 albumin, IVIG (intravenous immunoglobulin), IMIG (intramuscular immunoglobulin), angulation taor VHI, copulation factor IX, antithrombin HI으로서 녹십자 (Korea) 제품을 사용하였다. 냉동진 공동결된 물질을 DEPC가 처리된 증류수에 녹여 4℃ 보관하였다.
이론/모형
- 그 외에 최적의 HCV RNA 추줄 조건을 확립하기 위하여 Accuprep Viral RNA Extraction Kit (Bioneer), Viral RNA premate (Bioneer), Ultraspec-II RNA Isolation System (Biotext) 등을 사용하여 RNA을 추출하였다. HCV RNA 추출은 각각의 킷트에서 제시하는 방법에 따라 수행하였다.
- 하였다. 실험에 사용한 RNA 추출 방법은 컬럼을 이용하는 방법과 guanidine salts lysis 방법이다. 이들을 이용하여 실험한 결과, QIAGEN 희사의 RNA 추출 킷트가 가장 효율적인 것임을 확인할 수 있었다 (Fig.
- HCV RNA 10 ㎕를 포함하여 총반응 부피는 20 ㎕를 이용하였다. 핵산증폭시험은 outer primers와 inner primers# 이용한 두 단계를 통한 핵산 증폭 방법인 nested IPR올 이용하였다. 온도 조건은 1차 PCR, nested PCR 모두 pre-denaturation은 95℃ 3분, denaturation 95℃ 30 추로 하였고, primer template에 결합하는 온도는 각각 42℃, 48℃, 52℃, 5YC를 사용하여 30회 반복하여 증폭하였다.
- 혈장 분획물질로부터 HCV RNA 추출에는 주로 멤브레인 필터 법인 QIAamp Viral RNA Isolation Kit (QIAGEN)을 사용하였다 . 우선 140 gl 또는 280 yl의 검체를 lysis buffer 560(11 또는 1, 120 皿와 함께 넣어 잘 섞은 후 10분 동안 실온에서 반응시켰다.
성능/효과
- 더욱이, 많은 양의 항체 단백질로 인하여 COBAS amplicor HCV 2.0로는 검출이 어려운 근육주사용 항체에서도 10。IU/ml의 의 민감도를 보이고있으며 이는 핵산 증폭시험 방법이 기존에 주로 사용되고 있는 HCV RNA 검출 방법들과 함께 HCV RNA 검출에 매우 적절한 방법으로 개발되었다는 것을 확인할 수 있다.
- 0과 핵산 증폭시험을 비교하여 실험하였다. 결과에서도 알 수 있듯이 COBAS amplicor HCV 2.0의 경우는 일부 혈장 분획물질에서는 핵산 증폭시험보다 더 높은 민감도를 보이고 있지만, 근 육 주 사용 항체의 경우에는 검출 한계가 매우 낮아 검출이 매우 어려운 것을 알 수 있었다. 반면에 본 연구에서 확립한 핵산 증폭시험의 경우는 혈장 분획물질의 종류와 상관없이 100 IU/ml의 상당히 높은 민감도를 보이고 있는 것을 확인할 수 있었다.
- 0 (Roche)을 비교하여 실험하였다. 그 결과, 핵산 증폭시험의 경우 혈장분획물질에서 100 IU/ml 농도까지 HCV RNA를 검출할 수 있었으며, COBAS amplicor HCV 2.0의 경우는 혈장 분획물질에 따라 서로 다른 민감도를 보이고 있다(Table 3). 즉 혈액 응고 팩터와 안티스롬빈 m의 경우는 50 IU/ml의 가장 높은 민감도를 보이고 있다.
- 본 실험에서도 5'-UTR 부분에 있는 5종류의 primer 중 여러 조건을 통한 실험 결과 가장 적절하다고 보여지는 primer를 선별하였다. 그러므로 적절한 핵산 증폭시험의 조건을 확립하기 위한 변수들로서, 역전사효소 반응의 최적 온도와 primer의 농도, 결합 온도, MgCl2 농도, 1차 PCR 산물의 양 등 다양한 조건들을 비교하여 실험하였으 며 그 결과 HCV RNA 검출에 최적화된 핵산 증폭시험을 확립하였다.
- 5%로 상당히 많은 양이 들어있는 근육주사용 항체의 특징 때문으로 생각된다. 그러므로 항체의 양을 다양한 농도로 희석한 후, HCV를 주입하여 COBAS ampHcor HCV 2.0을 통하여 검출한 결과, 항체의 양이 적을 수로 HCV RNA 검출의 민감도가 높아지는 것을 확인할 수 있었다(Table 4). 즉 항체의 양이 2.
- Ultraspec의 경우, 가장 낮은 감도를 보이고 있는데, 그 이유는 아마도 바이러스 RNA처럼 적은 양의 RNA 분리 방법으로는 적절하지 않은 것으로 생각된다. 나머지 Accuprep이나 Premate kit 는 각각 chaotropic salt (guanidine salts and urea)와 guanidinium salt를 이용하여 RNA를 분리하는 것인데, 이킷트들도 HCV RNA 분리에는 별로 효율적이지 못한 것임을 알 수 있었다. 또한 이 실험을 통하여 RNA 추출방법에 따라 RT-PCR을 이용한 HCV RNA 검출의 민감도와 특이도가 영향을 받는다는 것을 확인 할 수 있었다.
- 나머지 Accuprep이나 Premate kit 는 각각 chaotropic salt (guanidine salts and urea)와 guanidinium salt를 이용하여 RNA를 분리하는 것인데, 이킷트들도 HCV RNA 분리에는 별로 효율적이지 못한 것임을 알 수 있었다. 또한 이 실험을 통하여 RNA 추출방법에 따라 RT-PCR을 이용한 HCV RNA 검출의 민감도와 특이도가 영향을 받는다는 것을 확인 할 수 있었다.
- 0의 경우는 일부 혈장 분획물질에서는 핵산 증폭시험보다 더 높은 민감도를 보이고 있지만, 근 육 주 사용 항체의 경우에는 검출 한계가 매우 낮아 검출이 매우 어려운 것을 알 수 있었다. 반면에 본 연구에서 확립한 핵산 증폭시험의 경우는 혈장 분획물질의 종류와 상관없이 100 IU/ml의 상당히 높은 민감도를 보이고 있는 것을 확인할 수 있었다. 더욱이, 많은 양의 항체 단백질로 인하여 COBAS amplicor HCV 2.
- 특히 바이러스 유래 RNA는 시료에 소량으로 존재하는 특성으로 인하여 더욱 민감도가 높은 방법을 사용하여야 한다. 본 실험에서도 RNA 를 추출하는 여러 가지 방법들을 비교하여 실험하였고, 그 결과 가장 민감도가 높은 방법을 선별하였다. 다음으로는 primer의 선별에 달려 있다.
- 또한 혈장 분획물질에 첨가되는 안정제, 보존제 및 고농도의 단백질도 핵산 증폭의 억제제로 작용할 수 있다. 본 실험에서도 높은 농도의 항체가 COBAS ampUcor HCV 2.0을 사용한 HCV RNA 검출에 억제제로 작용하여 항체를 희석하였을 경우에만 높은 민감도를 보이며 검출 할 수 있다는 결과를 얻었다.
- 10 pmol, 30 pmol, 50 pmol의 primer 농도와 1 gl, 5 |il, 10 山의 1차 PCR 산물을 실험에 이용하였다. 실험 결과, primer 농도가 10 pmol 보다는 30 pmol 이나 50 pmol일 때 밴드가 더 진한 것을 알 수 있었다 (Fig. 2). 1차 PCR 산물의 양 역시 1 μ1보다는 5 μ1이나 10 )11에서 더 진한 밴드를 관찰할 수 있었다.
- 위의 결과들을 토대로 최적의 조건을 갖춘 핵산 증폭시험의 특이도를 검증하기 위하여 100개의 사람의 혈장검체를 이용하여 nested PCR을 수행한 결과, 모두 음성으로 확인되었다(자료 미제시). 이러한 결과는 우리가 HCV RNA를 검출하기 위하여 개발한 핵산 증폭시험이 HCV RNA를 특이적으로 검출할 수 있다는 것을 알 수 있다.
- 실험에 사용한 RNA 추출 방법은 컬럼을 이용하는 방법과 guanidine salts lysis 방법이다. 이들을 이용하여 실험한 결과, QIAGEN 희사의 RNA 추출 킷트가 가장 효율적인 것임을 확인할 수 있었다 (Fig. 1). 그림에서 볼 수 있듯이 으lAamp viral RNA mini kit (QIAGEN)의 경우는 100 lU/ml의 감도를 보이고있으며 Accuprep viral RNA extration kit (Bioneer, Koreg)의 경우는 500 lU/ml의 감도를 보이고 있다.
- 이러한 결과는 우리가 HCV RNA를 검출하기 위하여 개발한 핵산 증폭시험이 HCV RNA를 특이적으로 검출할 수 있다는 것을 알 수 있다.
- 5%로 들어있는 경우는 500 IU/ml에서도 검출이 불가능하였다. 이러한 결과로서 알 수 있는 것은 핵산 증폭시험이 COBAS ampHcor HCV 2.0에 비하여 민감도가 낮지 않으며, 근육주사용 항체의 경우에는 COBAS ampHcor HCV 2.0에 비하여 매우 높은 민감도를 보이고 있어 향후 혈장 분획물질에서 HCV RNA검출에 유용한 방법으로 쓰일 수 있다는 것을 보여준다.
- 혈액을 통한 HCV의 감염을 방지하기 위하여 수혈한 혈액에 HCV 항체검사를 도입함으로서 감염의 가능성은 상당히 감소하였다. 그러나 바이러스가 인체에 감염되면 항체가 생성되기까지는 일정기간(window period)이 필요하다.
후속연구
- 이 기간은 바이러스에 따라 다르지만, HCV는 평균 82일로 상당히 길며 이 기간의 혈중 바이러스 양은 107 genome equivalents per ml (gEq/ml) 까지올라가는 경우도 있다 (10). 또한 항체가 생성되었다고 하더라도 그 양이 작아 항체실험에서 검출될 수 있는 수준 이하라면 혈액에 감염되어 있는 HCV를 기존의 항체 검출 방법으로 완벽하게 검출하는데 한계가 있다 (1). 그러므로 핵산증폭시험(nucleic acid amplification tests, NAI)이 혈액에서 HCV RNA를 검출할 수 있는 새로운 방법으로 시도되고 있으며, 항체 생성 이전 기간에 있는 혈액에서도 HCV를 검출함으로서 감염에 대한 위험을 상당히 감소시킬 수 있을 것으로 예상하고 있다(10).
- 그러므로 본 연구에서 이용한 여러 유전정보 및 프라이머들은 HCV genotype 1 b를 reference로 이용하였다. 비록이 연구에서는 한국인의 혈청을 이용한 실험까지 진행하지 못하였지만, 향후 한국인의 HCV RNA를 검출하는데 많은 도움이 될 것으로 생각된다.
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