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문제 정의
- HASMC의 유주와 증식에 관여하는 MMP-9과 MMP-2의 활성에 미치는 영향을 알아보았다. TNF- a 에 의해 증가된 MMP-9을 二妙散 및 그 구성 약재인 黃柏, 蒼朮이 효과적으로 감소시키는지 알아보기 위하여 100 ng/ml의 二妙散, 黃柏, 蒼朮을 1시간 전처리하고 100 ng/ml 의를TNF-a를 24시간 처리한 후 세포 배양액을 수거하여 gelatin zymography assay 를 수행하였다.
- 관심이 있었다. 그의 일환으로 二妙散 및 그 구성약재가 TNF-a에 의해 유도된 평활근 세포의 염증반응으로 발현되는 동맥 경화관련 지표인자인 MMPs에 작용기전을 파악하였기에 보고하는 바이다.
- 증가한다』皿). 따라서 본 실험에서는 TNF-a에 의해 유도된 MMP-9을 二妙散 및 구성약재인 黃柏과 蒼朮이 효과적으로 감소시키는지 알아보았다. 100 u g/ml 의 二妙散, 黃柏, 蒼朮을 1시간 전처리하고 100 ng/ml의 TNF-a를 처리하여 24시간 후 세포 배양액을 얻어 gelatin zymography assay를 수행하였다.
- 따라서 저자는 염증으로 인한 사람 동맥 평활근 세포의 migration의 증가와 함께 MMP-2, MMP-9의 발현이 증가한다는 보고& 를 근거로 천연물로서의 MMPs 억제제에 관심이 있었다. 그의 일환으로 二妙散 및 그 구성약재가 TNF-a에 의해 유도된 평활근 세포의 염증반응으로 발현되는 동맥 경화관련 지표인자인 MMPs에 작용기전을 파악하였기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 1. HASMC에 대한 세포독성을 알아보기 위하여 二妙散, 黃柏, 蒼朮을 농도별로 18시간 처리한 후, MTS assay를 수행하여 二妙散, 黃柏, 蒼朮 모두 세포 생존율에 영향을 주지 않는 농도인 100 ng/曲으로 다음 실험을 진행하였다. 이는 二妙散과 그 구성 약재들이 나타내는 항유주 및 MMPs 활성 억제 효과가 세포 생존율의 감소에 의한 것이 아니라 각각 약재들의 고유한 특성임을 말한다.
- 따라서 본 실험에서는 TNF-a에 의해 유도된 MMP-9을 二妙散 및 구성약재인 黃柏과 蒼朮이 효과적으로 감소시키는지 알아보았다. 100 u g/ml 의 二妙散, 黃柏, 蒼朮을 1시간 전처리하고 100 ng/ml의 TNF-a를 처리하여 24시간 후 세포 배양액을 얻어 gelatin zymography assay를 수행하였다. 그 결과, Fig.
- 2. 二妙散, 黃柏, 蒼朮이 TNF-a 처리 시 증가하는 세포의 유주능에 미치는 영향을 알아보기 위하여 migration assay를 수행하였다. H&E 염색을 하여 광학현미경으로 관찰하였다.
- 배양하였다. 24시간 후 upper chamber 에서 lower chamber로 유주한 세포를 관찰하기 위하여 upper chamber의 matrigel filter를 H-E 염색을 하여 광학 현미경으로 관찰하였다. 그 결과 TNF-a 를 처리에 의해 세포의 유주가 약 5.
- upper chamber의 matrigel filter를 H-E 염색을 하여 광학 현미경으로 관찰하였다. 그 결과 TNF-a 를 처리에 의해 세포의 유주가 약 5.
- HASMC의 유주능은 transwell 산lambed 사용하여 측정하였다. 먼저 HASMC에 100 ng/mM의 TNF- a를 처리하여 24시간 배양한 후 배양액을 얻어 세포의 주를 유도하는 conditioned medium을 준비한다.
- MMP activity 측정을 위하여 24 well plate 에 lxl0P/ml로 세포를 분주하여 배양한 후 serum free medium으로 교체하여 16시간 동안 starvation 하였다 여기에 각각의 약재를 1시간 동안 전처리한 후 100 ng/ml의 TNF-a를 24시간 처리하였다. 각각의 세포 배양액을 수거하여 gratin zymography를 수행하였다 20 以의 배양액을 reducing agent가 없는 SDS- sample buffer에 섞은 후 전기영동을 한 후 g신을 2.
- MMP-2의 활성을 알아보기 위하여 100 ng/ml의 二妙散, 黃柏, 蒼朮을 1시간 전처리하고 100 ng/ml의 TNF-a를 처리하여 24시간 후 세포 배양액을 얻어 gelatin zymography assay를 수행하였다. 그 결과 TNF-a 에 의해 MMP-2가 13.
- TNF- a 에 의해 증가된 MMP-9을 二妙散 및 그 구성 약재인 黃柏, 蒼朮이 효과적으로 감소시키는지 알아보기 위하여 100 ng/ml의 二妙散, 黃柏, 蒼朮을 1시간 전처리하고 100 ng/ml 의를TNF-a를 24시간 처리한 후 세포 배양액을 수거하여 gelatin zymography assay 를 수행하였다. 그 결과 TNF-a에 의해 유도되는 MMP-9이 二妙散, 黃柏, 蒼朮에 의해 효과적으로 감소되었으며, 녹차에 많이 함유되어 있는 성분인 catechin의 유도체로서 MMP inhibitor로 잘 알려져있는 E* GCG 처리한 경우와 비교해 본 결과에서도 E明CG의 MMP-9 저해 활성과 거의 비슷한 에것으로 나타났다.
- 00을 이용하여 one-way ANOVA를 실시하였다. Western blot를 통해 얻은 band의 density 분석은 GelDoc-It BioImaging System (UVP, USA) 을 사용하여 측정하였다.
- 에서 24시간 동안 반응시킨 후 0.1% coomassie brilliant blue 용액으로 30분간 염색하여 gelatin。] 분해되는 정도를 관찰하였다.
- MMP-9。] 중요한 역할을 하고, 이는 많은 혈관질환의 원인이 되며 동맥경화를 더욱 심화시킨다는 사실에 착안하여, 한방 처방 중 蒼朮과 黃柏, 두 가지로 구성된 二 妙散의 항염증작용 상승효과 가능성을 실험적으로 조사하여 항동맥 경화활성을 탐색하였다.
- upper chamber의 matrigel filter를 H-E 염색을 하여 광학 현미경으로 관찰하였다. 그 결과 TNF-a 를 처리에 의해 세포의 유주가 약 5.
- 二妙散 및 그 구성약재인 黃柏, 蒼朮이 혈관 평활근 세포의 유주와 MMP 활성에 미치는 영향을 조사하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
- 二妙散, 黃柏, 蒼朮이 TNF-a 처리시 증가하는 세포의 유주능에 미치는 영향을 알아보기 위하여 migtation assay를 수행하였다 HASMC에 100 ng/ml의 TNF-a를 24시간 처리하여 얻은 conditioned medium 을 transwell의 lower chamber에 넣고, 100 ug/m义의 二妙散, 黃柏, 蒼朮을 1시간 동안 전처리한 후 100 ng/ml의 TNF-a를 24시간 처리한 HASMC를 upper chamber에 넣은 후 24시간 동안 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다. 24시간 후 upper chamber 에서 lower chamber로 유주한 세포를 관찰하기 위하여 upper chamber의 matrigel filter를 H-E 염색을 하여 광학 현미경으로 관찰하였다.
- 二妙散, 黃柏, 蒼朮이 TNF-a 처리시 증가하는 세포의 유주능에 미치는 영향을 알아보기 위하여 migtation assay를 수행하였다. matrigel filter를 H&E 염색을 하여 광학현미경으로 관찰하였다.
- 7 세포를 분주하고 약재를 농도별(0, 100, 300, 500, 700 μg/ml) 로 24시간 동안 처리하였다 Well 당 20 以의 MTS solution을 첨가하여 37G 5% g 배양기에서 4시간 동안 반응시킨 후 microplate reader (DYNEX, Opsys MR, USAX 이용하여 450 nm에서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군에 대한 세포생존율을 백분율로 표시하였다. 각 농도별 약재가 갖는 흡광도를 보정하기 위하여 세포를 뺀 배지를 같이 배양하여 대조군과 실험군의 흡광도를 비교 보정하여 세포 생존율을 백분율로 표시하였다.
- TNF-a를 24시간 처리하였다. 각각의 세포 배양액을 수거하여 gratin zymography를 수행하였다 20 以의 배양액을 reducing agent가 없는 SDS- sample buffer에 섞은 후 전기영동을 한 후 g신을 2.5% Triton X-100에서 30분간 2회 soaking 시킴으로써 SDS를 제거하고 3차 증류수로 20분간 2회 세척하였다. 세척된 g 신은 incubation buffer (50 mM Tris-HCl ; pH 7.
- 蒼朮은 700 u g/做까지 세포 독성이 나타나지 않았다. 따라서 二妙 散, 黃柏, 蒼朮 모두 세포 생존율에 영향을 주지 않는 농도인 100 ug/做으로 다음 실험을 진행하였다.
- 蒼 朮은 700 ng/曲까지 세포 독성이 나타나지 않았다. 따라서 二妙散, 黃柏, 蒼朮 모두 세포 생존율에 영향을 주지 않는 농도인 100 ng/曲로 다음 실험을 진행하였다. 이는 二妙散과 그 구성 약재들이 나타내는 항유주 및 MMPs 활성억제효과가 세포 생존율의 감소에 의한 것이 아니라 각각 약재들의 고유한 특성임을 말한다.
- 먼저 사람 평활근 세포 HASMC에 대한 세포독성을 알아보기 위하여 二妙散, 黃柏, 蒼朮을 농도별(0~ 700 ng/1政로 처리한 후, MTS assay를 수행하였다. 二妙散의 경우, 농도별로 18시간 동안 처리한 경우 100 ng/曲의 농도까지 세포독성이 거의 없었고 그 이상의 농도에서 세포독성을 가지는 것으로 확인되었다.
- 사람 평활근 세포 HASMC에 대한 세포독성을 알아보기 위하여 二妙散, 黃柏, 蒼朮을 농도별 (0-700 Hg側)로 처리한 후, MTS assay를 수행하였다. Fig.
대상 데이터
- Corn!血g사 (CA, USA)에서 구입하였다. Aqueous One Solution Cell Priliferation Assay (MTS) kit는 Promega사 (WI, USA)에서 구입하였다 실험에 사용된 모든 시약은 분석용 등급 이상으로 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 약재는 동국대학교 한의과대학 방제학교 실에서 선별된 것을 정선하여 사용하였으며, 二妙散의 구성 및 총량은 Table 1과 같다. 약재 3배량의 80% methamol을 가한 다음 48시간 동안 추출하였다.
- 사람의 대동맥 평활근 세포주인 Human Aortic Smooth Muscle Cells (HASMC) 은 ScienG曲사 (Sandro, CA)에서 분양받아 SMC growth si軍p値rmnt와 2% FBS과 1% penicillin- streptomycin을 포함하는 SMCM에서 배양하였다. 세포는 37G 5% CO2 조건에서 배양하였다.
- 세포 배양액인 Smooth Muscle Cell Medium (SMCM), SMC growth supplement는 ScienGell사 (Sandiego, USA)에서 구입하였다. 실험에 사용된 시으扌 중 sodium dodesyl sulfate (SDS), acrylamide, bis는 Bio-Rad 사(CA, USA)에서 구입하였고, gelatin 은 Sigma (CA, USA)에서, traswelle Corn!血g사 (CA, USA)에서 구입하였다.
- 약재 3배량의 80% methamol을 가한 다음 48시간 동안 추출하였다. 이 과정을 2회 반복한 후 여과하여 농축한 것을 동결 건조하여 분말을 얻어 실험에 사용하였다 (수율 : 15.2%). 이 분말은 세포배양액인 Dulbeccos Madified Eagle Medium (DMEM) 에 녹여 사용하였다
- 2%). 이 분말은 세포배양액인 Dulbeccos Madified Eagle Medium (DMEM) 에 녹여 사용하였다
데이터처리
- 실험결과는 means土SEM으로 표시하고 유의성 검증은 Prism 4.00을 이용하여 one-way ANOVA를 실시하였다. Western blot를 통해 얻은 band의 density 분석은 GelDoc-It BioImaging System (UVP, USA) 을 사용하여 측정하였다.
이론/모형
- MMPs는 혈관을 형성하는 내막, 중막, 외막의 구성성분인 세포외 기질이나 기저막을 분해시킴으로써평활근 세포의 유주에 영향을 주는데, 이러한 MMPs 의 활성을 조사하기 위해 gelatin zymography assay 를 수행하였다.
성능/효과
- 3. 二妙散, 黃柏, 蒼朮이 HASMC의 유주와 증식에 관여하는 MMP-9과 MMP-2의 활성에 미치는 영향을 알아보기 위해 gelatin zymography를 수행한 결과, TNF-a에 의해 유도되는 MMP-9이 二妙散, 黃柏, 蒼朮에 의해 현저히 감소되었다. 또한 二妙散 의 MMP-9 저해 활성은 MMP inhibitor로 잘 알려져 있는 EGCG의 MMP-9 저해 활성과 거의 비슷하게 나타났다.
- TNF-a에 의해 증가되는 MMP-2가 二妙 散, 黃柏, 蒼朮에 의해 효과적으로 감소되었고 그 중복합방인 二妙散의 MMP-2 저해 활성이 가장 좋은 것으로 나타났다. EGCG를 처리한 경우와 비교해 본 결과, EGCG] MMP-2 저해 활성보다 더욱 뛰어난 것으로 나타났다.
- Fig. 1에서 보듯이 二妙散의 경우, 농도별로 24시간 동안 처리한 경우 100 Hg/曲의 농도까지 세포독성이 거의 없었고 300, 500, 700 Hg/曲의 농도에서 각각 59.6%, 41.8%, 30.7%까지 세포 생존율이 감소하는 것으로 보아 300 Hg/曲이상의 농도에서 세포독성을 가지는 것으로 확인되었다. 黃柏은 300 Hg/曲까지 세포의 생존율의 감소가 없었고 500, 700 Hg側의 농도에서 각각 90.
- MMP-2는 TNF-a 에 의해 13.5배 증가되었고 二 妙散, 黃柏, 蒼朮에 의해 효과적으로 감소되는 것으로 나타났다. 그 중 복합 방인 二妙散의 MMP-2 저해 활성이 가장 좋은 것으로 나타났다.
- 그 결과 TNF-a에 의해 유도되는 MMP-9이 二妙散, 黃柏, 蒼朮에 의해 효과적으로 감소되었으며, 녹차에 많이 함유되어 있는 성분인 catechin의 유도체로서 MMP inhibitor로 잘 알려져있는 E* GCG 처리한 경우와 비교해 본 결과에서도 E明CG의 MMP-9 저해 활성과 거의 비슷한 에것으로 나타났다. TNF-a에 의해 증가되는 MMP-2가 二妙 散, 黃柏, 蒼朮에 의해 효과적으로 감소되었고 그 중복합방인 二妙散의 MMP-2 저해 활성이 가장 좋은 것으로 나타났다. EGCG를 처리한 경우와 비교해 본 결과, EGCG] MMP-2 저해 활성보다 더욱 뛰어난 것으로 나타났다.
- 2). 二妙散 및 黃机 蒼朮 모두 TNF-a로 증가되는 HASMC의 유주를 감소시켰고 특히 복합방인 二妙散이 가장 탁월한 유주 억제 효과를 나타내었다.
- 24시간 후 upper chamber 에서 lower chamber로 유주한 세포를 관찰하기 위하여 upper chamber의 matrigel filter를 H-E 염색을 하여 광학 현미경으로 관찰하였다. 그 결과 TNF-a 를 처리에 의해 세포의 유주가 약 5.4배 증가하는 것을 관찰할 수 있었고, 증가된 세포의 유주를 二妙散, 黃机 蒼朮이 각각 75.3%, 34.1%, 44.3% 감소시켰다 (Fig. 2). 二妙散 및 黃机 蒼朮 모두 TNF-a로 증가되는 HASMC의 유주를 감소시켰고 특히 복합방인 二妙散이 가장 탁월한 유주 억제 효과를 나타내었다.
- zymography assay를 수행하였다. 그 결과 TNF-a 에 의해 MMP-2가 13.5배 증가되었고 二妙 散, 黃柏, 蒼朮에 의해 각각 65.3%, 34.9%, 52.7% 감소되는 것으로 나타났다(Fig. 4A). 그 중 복합방인 二妙散의 MMP-2 저해 활성이 가장 좋은 것으로 나타났다.
- matrigel filter를 H&E 염색을 하여 광학현미경으로 관찰하였다. 그 결과 TNF-a 처리에 의해 세포의 유주가 약 5.8배 증가 하는 것을 관찰할 수 있었고, 증가된 세포의 유주를 二妙散, 黃柏, 蒼朮이 효과적으로 감소시켰다. 그 중 복합 방인 二妙散의 항유주 활성이 가장 탁월한 것으로 나타났다.
- H&E 염색을 하여 광학현미경으로 관찰하였다. 그 결과 TNF-a를 처리에 의해 세포의 유주가 약 5.8배 증가하는 것을 관찰할 수 있었고, 증가된 세포의 유주를 二妙散, 黃柏, 蒼朮이 효과적으로 감소시켰다. 그 중 복합방인 二妙 散의 항유주 활성이 가장 탁월한 것으로 나타났다.
- TNF- a 에 의해 증가된 MMP-9을 二妙散 및 그 구성 약재인 黃柏, 蒼朮이 효과적으로 감소시키는지 알아보기 위하여 100 ng/ml의 二妙散, 黃柏, 蒼朮을 1시간 전처리하고 100 ng/ml 의를TNF-a를 24시간 처리한 후 세포 배양액을 수거하여 gelatin zymography assay 를 수행하였다. 그 결과 TNF-a에 의해 유도되는 MMP-9이 二妙散, 黃柏, 蒼朮에 의해 효과적으로 감소되었으며, 녹차에 많이 함유되어 있는 성분인 catechin의 유도체로서 MMP inhibitor로 잘 알려져있는 E* GCG 처리한 경우와 비교해 본 결과에서도 E明CG의 MMP-9 저해 활성과 거의 비슷한 에것으로 나타났다. TNF-a에 의해 증가되는 MMP-2가 二妙 散, 黃柏, 蒼朮에 의해 효과적으로 감소되었고 그 중복합방인 二妙散의 MMP-2 저해 활성이 가장 좋은 것으로 나타났다.
- 100 u g/ml 의 二妙散, 黃柏, 蒼朮을 1시간 전처리하고 100 ng/ml의 TNF-a를 처리하여 24시간 후 세포 배양액을 얻어 gelatin zymography assay를 수행하였다. 그 결과, Fig. 3A에서 보듯이 TNF-a에 의해 유도되는 MMP-9 이 二妙散 및 그 구성약재인 黃机 蒼朮 에 의해 현저히 감소되는 것으로 나타났다. 또한 녹차에 많이 함유되어 있는 성분인 catechin의 유도체로 MMP inhibitor로 잘 알려져 있는 EGOG를 처리한 경우와 비교해 본 결과, EGQG의 MMP-9 저해 활성과 거의 비슷한 것으로 나타났다(Fig.
- 4A). 그 중 복합방인 二妙散의 MMP-2 저해 활성이 가장 좋은 것으로 나타났다. 녹차에 많이 함유되어 있는 성분인 catechin 의 유도체로서 MMP inhibitor로 잘 알려져 있는 EGCG를 처리한 경우와 비교해 본 결과, 二妙散, 黃 柏, 蒼朮은 EGCG의 MMP-2 저해 활성보다 더 뛰어난 것으로 나타났다(Fig.
- 8배 증가 하는 것을 관찰할 수 있었고, 증가된 세포의 유주를 二妙散, 黃柏, 蒼朮이 효과적으로 감소시켰다. 그 중 복합 방인 二妙散의 항유주 활성이 가장 탁월한 것으로 나타났다.
- 8배 증가 하는 것을 관찰할 수 있었고, 증가된 세포의 유주를 二妙散, 黃柏, 蒼朮이 효과적으로 감소시켰다. 그 중 복합 방인 二妙散의 항유주 활성이 가장 탁월한 것으로 나타났다.
- 4A). 그 중 복합방인 二妙散의 MMP-2 저해 활성이 가장 좋은 것으로 나타났다. 녹차에 많이 함유되어 있는 성분인 catechin 의 유도체로서 MMP inhibitor로 잘 알려져 있는 EGCG를 처리한 경우와 비교해 본 결과, 二妙散, 黃 柏, 蒼朮은 EGCG의 MMP-2 저해 활성보다 더 뛰어난 것으로 나타났다(Fig.
- 그 중 복합방인 二妙散의 MMP-2 저해 활성이 가장 좋은 것으로 나타났다. 녹차에 많이 함유되어 있는 성분인 catechin 의 유도체로서 MMP inhibitor로 잘 알려져 있는 EGCG를 처리한 경우와 비교해 본 결과, 二妙散, 黃 柏, 蒼朮은 EGCG의 MMP-2 저해 활성보다 더 뛰어난 것으로 나타났다(Fig. 4B).
- 二妙散, 黃柏, 蒼朮이 HASMC의 유주와 증식에 관여하는 MMP-9과 MMP-2의 활성에 미치는 영향을 알아보기 위해 gelatin zymography를 수행한 결과, TNF-a에 의해 유도되는 MMP-9이 二妙散, 黃柏, 蒼朮에 의해 현저히 감소되었다. 또한 二妙散 의 MMP-9 저해 활성은 MMP inhibitor로 잘 알려져 있는 EGCG의 MMP-9 저해 활성과 거의 비슷하게 나타났다.
- 3A에서 보듯이 TNF-a에 의해 유도되는 MMP-9 이 二妙散 및 그 구성약재인 黃机 蒼朮 에 의해 현저히 감소되는 것으로 나타났다. 또한 녹차에 많이 함유되어 있는 성분인 catechin의 유도체로 MMP inhibitor로 잘 알려져 있는 EGOG를 처리한 경우와 비교해 본 결과, EGQG의 MMP-9 저해 활성과 거의 비슷한 것으로 나타났다(Fig. 3B).
- 이러한 결과로 보아 二妙散에 의한 HASMC의 유주는 MMP-2, MMP-9의 활성 저해에 의한 것으로 볼 수 있으며, 二妙散이 동맥경화 치료제 및 예방물질로서 가능성을 가지는 것으로 보인다.
- 이러한 결과로 보아 黃柏과 蒼朮의 복합방인 二妙 散에 의한 HASMC의 유주는 MMP-2, MMP-9의 활성 저해에 의한 것으로 볼 수 있으며, 二妙散이 동맥경화 치료제 및 예방물질로서 가능성을 가지는 것으로 보인다.
후속연구
- 또한 Park】41은 항암 활성을 갖는 黃柏열수추출 다당류 분획에 대해 암컷의 생쥐(C57BL/6XC3H) Fl (B6C3F1)의 비장을 이용한바 강한 B-임파구 자극활성을 나타내었다고 밝혔다. 그 외에 Kin尹은 黃柏이 PC-12세포에서 ILT。, IL-6, amyloid precursor proteins (APP), acetylcholinesterase (AChE), glial fibrillary acidic protein (GFAP)의 mRNA의 발현과 ACOE의 활성을 억제하여 치매의 치료와 예방에 활용할 수 있을 것이라고 하였다. 한편 蒼朮에 대해서 11询는 蒼朮의 주성분인 atractylenolide I, HI이 LPS로 유도된 복강대식세포염증에 대한 TNF-a와 NO의 생성을 강력하게 저해함으로써 항염 증인 자로 효과적이라고 주장하였다.
- 상승효과를 기대할 수 있다. 더 나아가 지금까지 시도되지 않은 혈관염증에 대한 억제 효과를 나타낸다면 항동맥경화 활성제로서의 가능성을 예견할 수 있다.
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