[논문]초대 배양한 닭 간세포 증식에 대한 estradiol-<tex>$17{\\beta}$</tex>의 효과

백결; 장주원

초대 배양한 닭 간세포 증식에 대한 estradiol-$17{\\beta}$의 효과
Effect of estradiol-$17{\\beta}$ on proliferation in primary cultured chicken hepatocytes 원문보기

韓國家畜衛生學會誌 = Korean journal of veterinary service, v.31 no.4, 2008년, pp.457 - 463

백결 (전남대학교 수의과대학) , 장주원 (전남대학교 수의과대학)

Abstract ▼ AI-Helper

The sex steroid hormone estradiol-$17{\beta}(E_2)$ mediate their biological effects on development, differentiation and maintenance of reproductive tract and other target tissue through gene regulation by nuclear steroid receptors. Although the importance of $E_2$ in many physiological process has been reported, but little is known about the effects of $E_2$ on primary cultured chicken hepatocyte. therefore, in the present study, we have examined the effect of $E_2$ on cell proliferation and it's related signal cascades. $E_2$ increase $[^3H]$-thymidine incorporation in time-(${\leq}8hr$) and dose-($10^{-10}M$)dependent manner and treatment of $E_2$ increased the phosphorylation of p44/43 MAPKs(p44/42 mitogen-activated protein kinase) and JNK(c-Jun N-terminal kinase) in a time dependent manner. In addition, PD98059(p44/42 blocker, $10^{-5}M$), SP600125(JNK blocker, $10^{-6}M$) blocked the estrogen-induced increase in $[^3H]$-thymidine incorporation. In conclusion, $E_2$ stimulates the proliferation of primary cultured chicken hepatocytes and this action is mediated by p44/42 MAPKs and JNK signal transduction pathway.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

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문제 정의

그러나 최근 연구에 의하면 E2가 DNA에 직접적으로 작용하지 않고 세포막의 ER을 경유하는 신호전달체계를 통하여 non-genomic action으로 영향을 미치기도 한다고 보고하고 있다15) 이러한 경우 e2 과 결합한 ERe G proteins 활성을 통해서 adenylate cyclase, PLC, PKC, ERK 등을 활성화 시킨다고 알려져 있다16). 본 연구에서는 E2가 초대 배양한 닭 간세포의 증식에 미치는 영향을 확인하기 위하여 [3H]-Thymidine incorporation assay을 실시하였다. 쥐의 간세포에서 에스트로겐이 세포의 성장조절인 자로 영향을 미친다는 보고*)와 마찬가지로 본 연구에서는 E2를 처리한 후 8-12 시간이 경과하면 간세포 증식 이 유의성있게 나타났으며, 10-9-10-11m의 농도에서는 세포증식이 농도의존적으로 유의성있게 촉진되는 것을 확인하였다.
것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 E2이 세포성장에 미치는 영향을 초대배양한 닭 간세포를 이용하여 조사하였고, E2의 영향과 이와 관련된 세포 신호전달체계에 대해서 알아보았다.
본 연구에서는 초대 배양한 닭 간세포에 대한 E2의 세포증식 효과와 이에 대한 신호 경로에 대해서 알아보았다.
연구에 이용되어 왔다. 본 연구에서는 초대 배양한 닭 간세포의 특성을 이용하여 의한 간세포 증식 효과를 조사화 였고, E2의 영향과 이와 관련된 신호전달체계에 대해서 알아보았다.

제안 방법

p44/42 MAPK와 JNK의 신호전달경로를 경유한 세포의 증식 효과를 확인하기 위하여 PD 98059 (p44/42 blocker, 10%4), SP600125 (JNK blocker, 10"6M)< 전 처리 하여 [3H]- thymidine 자가 방사 측정법을 실시하였다. E2 만을 단독으로 처리할 때는 세포증식이 증가되었지만, pW42 와 JNK 억제약물인 PD98059 와 SP600125을 혼합 투여하였을 경우에는 E2 영향에 의한 세포증식이 억제되었다(Fig 3).
간세포를 추출하기 위한 닭은 12시간 전부터 절식을 시켰다. 닭을 개복한 후 간을 노출시키고, 간 내의 혈액을 제거하기 위하여 먼저 Ca"이 함유되지 않는 완충용액을 대동맥을 통해 관류시켰으며, 이때 압력이 과도하게 상승되지 않기 위해서 간 문맥을 절단하였다. 혈액이 제거된 것을 확인한 후 0.
이후 생사염색을 통해서 간세포의 90% 이상의 생육력을 검증한 뒤 배양접시에 분주하였다. 간세포를 75 U/㎖ penicillin, 75 U/㎖ streptomycin, 5% 송아지 혈청이 함유된 배양액 (basal medium eagle supplemented with essential amino acids)과 함께 배양 접 (5x105cells/60 nim collagen-coated dish)에 분주하고, 37℃, 5% CO₂ 분압의 조건하에서 4시간 동안 배양한 후 새로운 배양액으로 교체하고 20시간 이상 배양하여 간세포가 단층을 형성하도록 하였다.
2N NaOH를 넣고 23℃에서 12시 간 동안 처리 하여 산에 불용성인 물질을 용해시켰다. 그 다음 scintillation counter를 이용하여 방사선 활성도를 측정하였다. 모든 결과는 대조군에 대한 백분율로 환산하였다.
간이 부풀어 오른 것을 확인하고, 간 조직을 절제하여 80/zm 나일론 메쉬에서 걸른 다음 50g의 속도로 원심분리 하여 세포를 3회 세척하였다. 이후 생사염색을 통해서 간세포의 90% 이상의 생육력을 검증한 뒤 배양접시에 분주하였다. 간세포를 75 U/㎖ penicillin, 75 U/㎖ streptomycin, 5% 송아지 혈청이 함유된 배양액 (basal medium eagle supplemented with essential amino acids)과 함께 배양 접 (5x105cells/60 nim collagen-coated dish)에 분주하고, 37℃, 5% CO₂ 분압의 조건하에서 4시간 동안 배양한 후 새로운 배양액으로 교체하고 20시간 이상 배양하여 간세포가 단층을 형성하도록 하였다.
초대 배양을 위한 닭 간세포는 Hou 등이 보고한 방법8)을 응용하여 분리한 후 단층배양 (monolayer culture)을 실시하였다. 간세포를 추출하기 위한 닭은 12시간 전부터 절식을 시켰다.

대상 데이터

실험시약의 구입처는 아래와 같다. Class IV collagenase와 soybean trypsin inhibitor는 Life Technologies (Grand Island, NY), fetal bovine serume Biowhit- taker (Walkersville, MD), Estradiol- 17p, PD 98059, SP600125은 Sigma (St. Louis, _MO),Fh]_-thymidine은 _{NEN (Boston, MA),} Phospho-p44/42 MAPKs, p44/42 MAPKs, phospho-JNK, JNK 항체는 New England Biolabs (Herts, UK), 그리고 토끼 IgG에 대 한산 양의 항체는 Jackson Immunoresearch (West- Grove, PA, USA)로부터 각각 구입하였다.
실험에 사용된 2주령의 레그혼은 대한 실험 동물사(청주, 한국)로부터 구입하였다. 모든 실험동물은 서울대학교의 동물관리 기준 방침을 적용하여 관리하였다.

데이터처리

그 다음 scintillation counter를 이용하여 방사선 활성도를 측정하였다. 모든 결과는 대조군에 대한 백분율로 환산하였다.
모든 실험은 ANOVA를 이용해서 분석한 후, Bonnferroni Dunn test를 이용하여 대조군과 평균을 비교해서 분석하였다. p <0.

이론/모형

E2가 초대 배양한 닭 간세포 증식에 미치는 영향을 확인하기 위해서 [3H]-thymidine 자가 방사 측정법을 실시하였다. E2을 10-10M 농도로 처리한 후 8시간, 12시간이 경과하면 시간 의존적으로 세포의 증식이 촉진되어, [3H]- thymidine 자가 방사 측정값은 대조군에 비해 유의성 있게 증가하였다(Fig 1A).
[3H]-thymidine incorporation 실험은 Brett 등의 방법11)을 적용하였다. 요약하면, methyl- [3H]-thymidine IjaCi를 배양 세포에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 배양했다.
모든 실험동물은 서울대학교의 동물관리 기준 방침을 적용하여 관리하였다. 실험시약의 구입처는 아래와 같다.

성능/효과

방사 측정법을 실시하였다. E2 만을 단독으로 처리할 때는 세포증식이 증가되었지만, pW42 와 JNK 억제약물인 PD98059 와 SP600125을 혼합 투여하였을 경우에는 E2 영향에 의한 세포증식이 억제되었다(Fig 3). E2에 의한 간세포의 증식은 p44/42와 JNK 단백질 활성화 경로를 경유하여 촉진되었다.
본 연구의 결과는 MAPKs에 의해 CDK2와 CDK4 및 cyclin 이과 E의 활성화를 통해 세포 증식을 촉진하고, 이러한 세포주기 단백질의 활성화가 PD98059(MEK 억제재)에 의해 억제되었다는 선행 연구 결과와 일치하였으며 25), 마우스 배아줄기에서도 에스트로젠은 세포의 증식을 촉진시키며, 이러한 작용은 MAPKs, CDKs, protooncogenes를 경유하여 세포의 분화가 이루어진다는 보고26) 및 유방암세포에서 MAPK/ERK의 활성을 촉진시켰다는 연구결과 와도 일치하였다27). 결론적으로 &는 p44/42 MAPKs와 JNK 활성화를 통한 신호전달 체계를 경유하여 초대배양한 닭 간세포의 증식을 촉진시켰다.
결론적으로 초대 배양한 닭 간세포는 p44/42 MAPKs (p44/42 mitogen-activated protein kinase) 와 JNK(c-Jun N-terminal kinase)의 신호전달경로를 통해 세포의 증식을 활성화시켰다. 이와 같은 신호전달체계의 규명은 호르몬에 의해 발생되는 병태생리학적인 기능변화를 예측할 수 있으며, 질병의 예방과 치료대책을 강구하기위한 기초자료로 활용이 가능할 것이다.
그리고 p44/42와 JNK 활성에 따라 인산화된 단백질은 시간이 경과함에 따라 증가되었다가 감소하는 경향을 나타냈다. 그러나 total form 의 p44/42 MAPKs 와 JNK 단백질은 시간경과와는 무관하게 그 양상이 변화하지 않았다.
그러나 total form 의 p44/42 MAPKs 와 JNK 단백질은 시간경과와는 무관하게 그 양상이 변화하지 않았다. 그리고 신호전달체계를 확인하기 위해 E2만을 단독처리할 때는 세포증식이 증가되었지만, p44/42와 JNK 억제약물인 PD98059와 SP600125을 혼합 투여하였을 경우에는 세포증식이 억제되었다.
이 신호전달체계는 세포질이나 핵 내에서 coregulators나 여러 가지 전사 인자들을 인산화 시킴으로써 세포 내의 유전자 발현을 조절한다. 세포증식에 대한 신호전달경로를 조사한 결과 Eg] 의해 p44/42 MAPKs와 JNK가 활성화되는 것을 확인하였으며, PD 98059(p44/42 blocker), SP600125 (JNK blocker)를 전 처리하였을 경우 E?의 영향에 의한 세포증식 효과가 억제되었다. 따라서 E2에 의한 간 세포증식은 p44/42와 JNK의 신호전달 단백질 활성화경로를 경유해서 증가된다고 할 수 있다.
본 연구에서는 E2가 초대 배양한 닭 간세포의 증식에 미치는 영향을 확인하기 위하여 [3H]-Thymidine incorporation assay을 실시하였다. 쥐의 간세포에서 에스트로겐이 세포의 성장조절인 자로 영향을 미친다는 보고*)와 마찬가지로 본 연구에서는 E2를 처리한 후 8-12 시간이 경과하면 간세포 증식 이 유의성있게 나타났으며, 10-9-10-11m의 농도에서는 세포증식이 농도의존적으로 유의성있게 촉진되는 것을 확인하였다.

후속연구

이와 같은 신호전달체계의 규명은 호르몬에 의해 발생되는 병태생리학적인 기능변화를 예측할 수 있으며, 질병의 예방과 치료대책을 강구하기위한 기초자료로 활용이 가능할 것이다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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