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문제 정의
- 따라서, 본 연구는 불가식 체지방이 감소된 한우 쇠고기 생산을 위해, 현재까지 나타난 다클론 항체들의 단점을 극복 호}는 부위별 지방 특이 다클론 항체를 개발하고자 실시되었다.
- 본 연구는 국내 고유종인 한우의 부위별 불가식 체지방감소를 위한 특이 다클론 항체의 개발 및 타장기 안전성을 확인하고자 실시되었다. Collagenase digestion 방법으로 한우의 복강 및 피하지방세포 원형질막 단백질을 분리하여 면양에 3회에 걸쳐 수동면역 주사하고, 면역 주사 전 및 후에 비면역혈청과 항혈청(항체)을 생산하였다.
제안 방법
- 수컷 면양 (Corriedale, 60)의 피하 3 부위(목 뒷부분과 양쪽 서혜부) 에 지방세포 원형질막 단백질을 면역주사 하였으며, 최초면역 주사 이후 2차례 더 boosting 면역주사를 3주 간격으로 실시하였다. 1차 접종에는 지방세포 원형질막 단백질1 mL(250 μg/mL), Freund's incomplete adjuvant(Sigma F5881, USA) 1, 750 gL 그리고 Freund's complete adjuvant (Sigma F5506, USA) 250 μL를 3-way stopcock(성원 메디칼(주), 대한민국)을 사용해 충분히 혼합한 뒤 1 mL씩 나누어 전술한 피하 3부위에 주사하였으며, 2차와 3차 접종에는 지방세포 원형질막 단백질의 농도를 반으로 줄인 항원 1 mL(125 μg/mL)에 Freund's incomplete adjuvant만 2mL 첨가하여 전술한 방법과 동일하게 면역 접종하였다.
- 위한 특이 다클론 항체의 개발 및 타장기 안전성을 확인하고자 실시되었다. Collagenase digestion 방법으로 한우의 복강 및 피하지방세포 원형질막 단백질을 분리하여 면양에 3회에 걸쳐 수동면역 주사하고, 면역 주사 전 및 후에 비면역혈청과 항혈청(항체)을 생산하였다. 생산된 한우 부위별 지방 항체의 역가와 한우의 주요 장기 조직인 심장, 신장, 간장, 폐, 근육 및 비장세포의 원형질막 단백질에 대한 타장기 교차반응성과 한우의 부위별 지방 조직에서 지방세포를 분리하고 각각 배양시킨 후 개발된 한우 지방 항체를 직접 주입한 뒤 LDH 수준을 조사하였다.
- 1% collagenase (Sigma, C6885), 30% bovine serum albumin(BSA, Sigma A2153))와 지방의 비율을 2:1 로 하여 shaking water bath 에서 collagenase digestion(42℃, 90 min)을 실시하였다. Digestion 후 collagenase로 인해 유리된 지방세포들만을 따로 취하기 위해 250 μm 나일론 망으로 걸러주었으며, 37℃에서 5분간 정치하여 미성숙한 지방세포들로 구성된 하층을 제거함으로써 지방입자를 함유하고 있는 성숙한 지방세포들을 선택적으로 추출하였다. 그 후 보다 순수한세포를 얻기 위해 collagenase를 제거한 digestion media (washing media)로 2-3회 세척하였다.
- Gel의 제조 및 전기영동 등 일련의 과정은 Mini-PROTEAN® 3 Cell(Bio-rad, USA)을 사용하였으며, Instruction Manual에 따라 단백질을 분리하였다. SDS-PAGE로 전개한 gel에 대한 분석은 Quantity-One(Bio-Rad, USA) program을 이용해 matched test를 실시하였으며, all lane on 상태에서 rolling disk size를 50으로 설정해 분석하였다.
- 분리하였다. 또한, 마지막 면역접종이 끝난 후 12일째에 채혈한 후 비면 역 혈청 분리 시와 동일한 방법으로 항혈청(항체)을 분리하였다. 위의 방법으로 생산한 한우 부위별 지방에 대한 항혈청들은 각각 한우 복강지방 항체(NIAS-H101) 및 피하지방 항체(NIAS-H201)로 명명하였다.
- 본 연구에서 항원으로 사용될 한우 복강 및 피하 지방세포 원형질막 단백질은 특이한 질병유무가 발견되지 않은 건강한 한우 거세 및 비거세우 26두의 도축시 Kestin 등(1993)의 방법을 이용하여 약 3개월에 걸친 반복적인 수집과정을 통해 분리하였다. 도축은 국립 축산과학원 도축 관행에 따라 비거세우 24.
- 부위별로 추출한 한우 지방세포(복강 및 피하) 원형질막단백질의 패턴을 비교해 보기 위해 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)를 실시하였다. Gel의 제조 및 전기영동 등 일련의 과정은 Mini-PROTEAN® 3 Cell(Bio-rad, USA)을 사용하였으며, Instruction Manual에 따라 단백질을 분리하였다.
- 원심분리관에 형성된 protein band를 확인한 뒤, 조심스럽게 band만을 취하고 MEM을 첨가한 뒤 최종적으로 4℃, 148, 000xg에서 1시간동안 초고속 원심분리하여 단백질 pellet을 분리하였다. 분리된 pellet의 량에 따라 적당량의 MEM을 첨가한 뒤 지방세포 원형질막 단백질과동일하게 DC Protein assay kit(Bio-rad 500-0116, US A)를이용해 단백질 농도를 측정하였다. 본 연구에서 분리된 한우 장기 원형질막 단백질은 한우 부위별 지방세포 원형질막 단백질에 대한 항혈청과의 교차반응성 측정 시 사용되었으며, 사용 시까지 -20℃에서 보관하였다.
- Collagenase digestion 방법으로 한우의 복강 및 피하지방세포 원형질막 단백질을 분리하여 면양에 3회에 걸쳐 수동면역 주사하고, 면역 주사 전 및 후에 비면역혈청과 항혈청(항체)을 생산하였다. 생산된 한우 부위별 지방 항체의 역가와 한우의 주요 장기 조직인 심장, 신장, 간장, 폐, 근육 및 비장세포의 원형질막 단백질에 대한 타장기 교차반응성과 한우의 부위별 지방 조직에서 지방세포를 분리하고 각각 배양시킨 후 개발된 한우 지방 항체를 직접 주입한 뒤 LDH 수준을 조사하였다. 복강 및 피하지방세포 원형질막 단백질들은 서로 유사하면서도 특이적인 단백질을 가지고 있는 것으로 SDS-PAGE 분석을 통해 확인할 수 있었다.
- 등(2005)의 방법에 따라 실시하였다. 수컷 면양 (Corriedale, 60)의 피하 3 부위(목 뒷부분과 양쪽 서혜부) 에 지방세포 원형질막 단백질을 면역주사 하였으며, 최초면역 주사 이후 2차례 더 boosting 면역주사를 3주 간격으로 실시하였다. 1차 접종에는 지방세포 원형질막 단백질1 mL(250 μg/mL), Freund's incomplete adjuvant(Sigma F5881, USA) 1, 750 gL 그리고 Freund's complete adjuvant (Sigma F5506, USA) 250 μL를 3-way stopcock(성원 메디칼(주), 대한민국)을 사용해 충분히 혼합한 뒤 1 mL씩 나누어 전술한 피하 3부위에 주사하였으며, 2차와 3차 접종에는 지방세포 원형질막 단백질의 농도를 반으로 줄인 항원 1 mL(125 μg/mL)에 Freund's incomplete adjuvant만 2mL 첨가하여 전술한 방법과 동일하게 면역 접종하였다.
- 충분히 coating되도록 해 주었다. 전체적인 실험의 방법은 지방 특이 항체의 역가 측정법과 동일하게 진행되었으며(예 : 1차 또는 2차 항체의 종류, 1차 및 2차 항체의 농도 및 양, substrate의 종류 등), 암실에서 약 30분간 발색 반응시킨 후 405nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 9% saline(70±5oC)에 넣어 지방조직이 굳지 않게 유지하면서 실험실로 이동했다. 지방조직에서 혈관 및 결체조직등을 최대한 제거하면서 가위로 잘게 세절한 후, digestionmedia(DMEM(Hyclone SH30243.01), 0.1% collagenase (Sigma, C6885), 30% bovine serum albumin(BSA, Sigma A2153))와 지방의 비율을 2:1 로 하여 shaking water bath 에서 collagenase digestion(42℃, 90 min)을 실시하였다. Digestion 후 collagenase로 인해 유리된 지방세포들만을 따로 취하기 위해 250 μm 나일론 망으로 걸러주었으며, 37℃에서 5분간 정치하여 미성숙한 지방세포들로 구성된 하층을 제거함으로써 지방입자를 함유하고 있는 성숙한 지방세포들을 선택적으로 추출하였다.
대상 데이터
- 34kg이었다. 도축장에서 도축즉시 굳지 않은 한우 복강 및 피하지방 조직을 채취하여 0.9% saline(70±5oC)에 넣어 지방조직이 굳지 않게 유지하면서 실험실로 이동했다. 지방조직에서 혈관 및 결체조직등을 최대한 제거하면서 가위로 잘게 세절한 후, digestionmedia(DMEM(Hyclone SH30243.
- 도축장에서 장기조직을 채취하여 50mL tube에 5g 씩 넣고 MEM 25mL와 0.2 M PMSF 60μL를 첨가한 뒤 homogenizer(WiseMix HG-15D, 대한과학, 한국)를 이용하여 분쇄하였다. 분쇄한 현탁액을 새로운 50 mL tube에 옮겨 넣고 4℃, 3, 000rpm, 30분간 원심분리한 뒤, 상층액만취하여 다시 4℃, llQOOOxg에서 1시간동안 초고속 원심분리하였다.
- 분리된 pellet의 량에 따라 적당량의 MEM을 첨가한 뒤 지방세포 원형질막 단백질과동일하게 DC Protein assay kit(Bio-rad 500-0116, US A)를이용해 단백질 농도를 측정하였다. 본 연구에서 분리된 한우 장기 원형질막 단백질은 한우 부위별 지방세포 원형질막 단백질에 대한 항혈청과의 교차반응성 측정 시 사용되었으며, 사용 시까지 -20℃에서 보관하였다.
데이터처리
- 역가, 교차반응성 및 세포독성 등 각각의 자료에 대한유의성 검증은 Duncan(1955)의 다중검정법으로 95% 신뢰수준에서 검증하였다.
- 한우 부위별 지방 특이 항체의 역가 연구의 통계분석eSAS 통계 package에 포함된 일반선형모형 (general linear model)로 상호작용 효과가 있는 이원 분산분석을 실시하였고, 통계 모형을 다음과 같다.
이론/모형
- gel electrophoresis(SDS-PAGE)를 실시하였다. Gel의 제조 및 전기영동 등 일련의 과정은 Mini-PROTEAN® 3 Cell(Bio-rad, USA)을 사용하였으며, Instruction Manual에 따라 단백질을 분리하였다. SDS-PAGE로 전개한 gel에 대한 분석은 Quantity-One(Bio-Rad, USA) program을 이용해 matched test를 실시하였으며, all lane on 상태에서 rolling disk size를 50으로 설정해 분석하였다.
- 본 연구에서 생산한 부위별 지방 특이항체가 한우의 주요장기(심장, 신장, 간장, 폐, 근육 및 비장) 원형질막 단백질과 나타내는 교차반응성 즉, 타장기 cross-reactivities 는 Baek 등(2000)의 방법에 따라 ELISA법으로 실시하였다.
- 본 연구에서 생산한 한우 부위별 지방 항체의 역가는Kestin 등(1993)고} Choi 등(1997)의 ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)법에 따라 측정하였다. 역가 측정 하루 전 한우 복강 및 피하지방 원형질막 단백질을 1 gg/mL의 농도로 TBS(Tris-buffered saline, pH 7.
- 한우 복강지방 특이항체 및 피하지방 특이항체를 이용한 타장기 안전성 연구 결과 또한 ELISA법으로 측정되었으며 각각 Fig. 4와 5에 나타난 바와 같다. 또한 Table 1 과 2는 타장기 안전성 연구 결과의 실측치(O.
- 한우 부위별 지방 특이 항체의 생산을 위한 면역주사는 Baek 등(2005)의 방법에 따라 실시하였다. 수컷 면양 (Corriedale, 60)의 피하 3 부위(목 뒷부분과 양쪽 서혜부) 에 지방세포 원형질막 단백질을 면역주사 하였으며, 최초면역 주사 이후 2차례 더 boosting 면역주사를 3주 간격으로 실시하였다.
- 한우 부위별 지방세포 원형질막에 대한 특이항체들(NIAS- H101 및 NIAS-H201)의 in vitro 세포배양 및 세포독성 효과 검증을 위해 Baek(2003)의 방법에 따라 세포배양 후 LDH(lactate dehydrogenase) assay를 실시하였다.
성능/효과
- 1), 피하지방 특이 항체의 항원성 부위 (epitope)가 복강지방 특이 항체보다 많기 때문에 보다 높은 수준의 교차반응을 나타낸 것으로 추측된다. 1:3, 000배의 희석배율에서 매우 미미하지만 복강지방 및 피하지방 특이 항체와 주요장기세포 원형질막 단백질들과의 교차반응성은 항혈청 내 함유된 혈청 단백질들이 ELISA 시 coating된 항원 단백질들과 결합해 발생하는 일종의 비특이적 반응으로 알려져 있어 (Baek, 2003), 본 연구에서 개발된 항체와 주요장기세포 간의 교차반응 정도는 매우 미약하거나 없는 것으로 판단된다. Nassar와 Hu(1992)는 면양의 지방세포 원형질막에 대해 개발된 다클론 항체의 교차반응성을 간장, 신장, 심장 및 적혈구의 원형질막 단백질을 이용하여 측정해본 결과, 생산된 항체는 지방세포에 특이적으로 작용한다고 보고하여본 연구와 유사한 결과를 나타내었으며, 국내에서도 Choi 등(1997)이 한우 전체 지방세포 원형질막에 대한 항체가 지방세포에 특이적으로 강한 반응을 나타내는 반면, 간장, 비장, 심장, 신장 등의 조직과 매우 미약한 반응을 나 타낸다고 보고하였다.
- 001). Fig. 2에서 나타난 바와 같이 항원을 주사하지 않은 비면 역 혈청과 비교하여 한우 복강지방세포 특이 항체는 한우복강지방세포에 대해 전 희석배율에서 유의적으로 높은 항원-항체 반응을 나타내었다(1:1,000에서 1:64, 000배 희석배율까지는 p<0.01, 1:128, 000배 희석배율에서는 p<0.05). 특히 비면역혈청의 경우 1:1,000배 이상의 희석배율에서는 거의 반응이 감지되지 않았으나, 복강지방 항체의 경우는 1:128, 000배의 희석배율에서도 반응이 감지되었다.
- Fig. 4와 Table 1에서 나타난 바와 같이 Duncan 다중검정(유의수준 95%)을 이용하여 유의성 분석을 실시한 결과, 복강지방 특이항체는 주요장기들과는 달리 지방세포에 대해 전 희석배율에서 유의적으로 강한 항원-항체 반응을 나타내었다. 또한 한우 복강지방 특이 항체는 3 k 및 9k 희석배율에서 피하지방세포에 비해 유의적으로 높은 반응을 나타내어 부위별 지방세포 간에도 차이가 있는 것으로 나타났다.
- 5는 피하지방 특이항체와 주요장기 간의 교차반응성을 측정한 결과이며 실측치는 Table 2 에 제시한 바와 같다. Fig. 5와 Table 2에 나타난 바와 같이 피하지방 특이항체는 주요장기세포 단백질들과는 달리전 희석배율에서 지방세포 원형질막 단백질에 대해 유의적으로 강한 반응을 나타내고 있으며, 예상했던 바와 같이 피하지방 특이항체는 피하지방세포와 3k 및 9k 희석배율에서 복강지방세포와도 유의적인 차이를 나타내어 복강 지방 항체와 유사한 특성을 가지는 것으로 확인되었다.
- SDS-PAGE를 통해 확인한 복강 및 피하지방세포의 원형질막 단백질들은 유사한 분자량의 단백질들도 존재하고 있었으나(복강 57.24와 피하 54.71 kDa 및 복강 22.54와 피하 22.70), 특이적으로 한우 피하지방세포 원형질막에만 존재하는 단백질이 있음을 확인할 수 있었다(170.53, 100.39, 60.78 및 13.24 kDa). 이미 특정 지방세포 원형질막 단백질은 동일한 축종에서 뿐만 아니라 서로 다른 축종 간에도 공통적으로 존재하고 있음이 밝혀졌는데(Tume, 1991), 특히 서로 다른 세 종(소, 토끼 및 흰쥐)의 지방세포 원형질막 단백질 중 74 kDa에서 79 kDa 크기 사이에 공통적으로 존재하는 당단백질이 있다고 알려져 있다(Kawai and Spiro, 1977a, b).
- 6은 한우 복강지방 특이 항체가 실제 살아있는 복강지방세포에게 미치는 in vitro 지방세포 감소효과를 나타낸 것이다. Triton X-100의 지방세포 감소효과를 기준으로 측정한 한우 복강지방 특이 항체는 비면역혈청 대비 유의적으로 높은 LDH 수준을 나타내었다(p<0.05). 비면 역 혈청 대비 항체처리구에서 나타난 유의적으로 높은 LDH 수준은 결국 복강지방 특이 항체가 살아있는 복강지방 세포에 직접적으로 작용을 하여 궁극적으로 지방세포를 용해시켜 배지 내 LDH 수준을 증가시킨 것으로 보이며, 이는 지방세포에 대한 항체의 세포독성효과를 간접적으로 보여주고 있는 것이다.
- , 1997). 따라서 기존의 보고된 항체의 역가와 단순 비교해 보았을 때 본 연구에서 개발한 한우 부위별 지방 특이 항체는 지방세포에 대해 매우 강한 결합력을 가진 항체임을 확인할 수 있었다.
- 훨씬 낮아진 것으로 나타났다. 또한 LDH assay를 통해 실제 항체가 지방세포에 대해 가지는 강한 지방세포감소 효과를 검정할 수 있었다. 현재 생산된 항체 간의 cross-cytotoxicity 연구를 진행 중에 있으며, 향후 본 항체를 한우에 직접 적용하는 항체의 영양생리 및 대사 안전성에 관한 연구와 항체의 부위별 in vivo 세포독성 연구가 계속될 것이다.
- 4와 Table 1에서 나타난 바와 같이 Duncan 다중검정(유의수준 95%)을 이용하여 유의성 분석을 실시한 결과, 복강지방 특이항체는 주요장기들과는 달리 지방세포에 대해 전 희석배율에서 유의적으로 강한 항원-항체 반응을 나타내었다. 또한 한우 복강지방 특이 항체는 3 k 및 9k 희석배율에서 피하지방세포에 비해 유의적으로 높은 반응을 나타내어 부위별 지방세포 간에도 차이가 있는 것으로 나타났다. 복강지방 특이 항체는 주요장기(심장, 신장, 간장, 폐, 근육 및 비장) 세포 원형질막 단백질과 1:3, 000 배 희석배율에서 미약한 반응이 나타남을 확인할 수 있으나, 이는 다클론 항체의 일반적 특성으로 장기와 항체의 직접적인 교차반응이 아니더라도 항체 생산 축(畜)의 체내 단백질 등의 비특이적 반응으로도 나타날 수 있는 수준이라 할 수 있다.
- 생산된 한우 부위별 지방 항체의 역가와 한우의 주요 장기 조직인 심장, 신장, 간장, 폐, 근육 및 비장세포의 원형질막 단백질에 대한 타장기 교차반응성과 한우의 부위별 지방 조직에서 지방세포를 분리하고 각각 배양시킨 후 개발된 한우 지방 항체를 직접 주입한 뒤 LDH 수준을 조사하였다. 복강 및 피하지방세포 원형질막 단백질들은 서로 유사하면서도 특이적인 단백질을 가지고 있는 것으로 SDS-PAGE 분석을 통해 확인할 수 있었다. 희석배율 1:1,000배를 기준으로 비면역혈청은 항원-항체 결합 반응이 거의 측정되지 않았으나, 복강 및 피하지방 항체는 희석배율 1:128, 000 배 및 1:64, 000배까지 각각 항원-항체 반응이 감지되었으며, 이는 본 연구에서 생산한 부위별 지방 특이 다클론 항체가 지방세포 원형질막 단백질에 대해 매우 강한 역가를 가진 항체임을 시사한다.
- 또한 복강 및 피하지방 항체는 타 장기들과는 특이한 반응을 나타내지 않았다. 본 연구에서 개발한 두 항체들은 모두 항원으로 이용된 부위의 지방세포 원형질막 단백질과 가장 높은 반응을 나타내었으며, 복강 및 피하지방 특이항체는 비면역혈청에 비해 유의적으로 높은 세포독성 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 이상의 결과를 종합할 때 본 연구에서 개발된 복강 및 피하 지방 감소 다클론 항체는 높은 역가, 타 장기 안전성 및 세포 파괴 효과가 있었으며 생체 타장기 안전성 등 향후 기존의 전체 지방에서 생산한 항체의 단점을 보완할 수 있는 연구가 지속될 경우 불가식 체지방이 감소된 저지방 한우 고급육 생산이 가능하리라고 사료된다.
- 이러한 결과는 부위별 지방 특이 항체의 생산 시 서로 다른 두 항체 간 특이성을 나타나게 해 줄 항원성 단백질의 존재를 시사하는 것으로 사료된다. 본 연구에서는 한우 지방 부위별로 서로 다른 특성을 가지고 있는 다클론 항체들의 생산이 1차적 목표이기 때문에, SDS-PAGE를 통해 나타난 부위별 지방세포 원형질막 단백질의 서로 다른 패턴만으로도 충분히 지방 부위에 따라 특이적으로 작용하는 항체의 생산이 가능한 것으로 판단된다. 하지만 SDS-PAGE와 같은 1차원적 전기영동만을 통해서는 복강지방세포의 원형질막 단백질과 피하지방세포 원형질막 단백질이 차이가 있다고 단정 짓기에는 무리가 있으며, 향후 부위별 특이 항체 가서로 다른 부위에 선택적으로 작용할 수 있는 반응 기전의 이해를 위해서라도 보다 세분화된 단백질 연구(예: 2- D electrophoresis 등을 통한 특이 단백질 screening)가 필요할 것으로 생각된다.
- 역가 측정시와 동일하게 이원분산분석을 실시해본 결과, 두 실험결과는 공히 항원-항체반응으로 나타난 주요 장기별 흡광도가 희석배율에 따라 유의적인 차이를 나타내었으며(p<0.001), 처리에 따라서도 유의적인 차이가 있는 것으로 나타났다(p<0.001). 또한 희석배율과 처리간의 상호작용도 유의한 것으로 나타났다(p<0.
- 닭의 경우, Dong 등(1991)은 면양을 통해 생산한 닭 지방세포에 대한 항체가 심장, 신장, 간 및 근육세포 원형질막 단백질에 대해 전반적으로 높은 교차반응성을 가진다고 보고하였으며, 특히 심장에서 매우 강한 교차반응이 일어난다고 밝혔다. 이러한 결과들을 종합해볼 때, 본 연구에서 생산한 항체들은 한우 지방세포에 매우 특이적으로 작용을 하고 있으며, 궁극적으로 전체 지방조직을 대상으로 생산한 기존의 연구들에서 개발된 항체들과 비교해 본 연구에서 개발된 부위별 지방 특이 항체는 타 장기와의 교차반응성을 크게 감소시킨 것으로 판단된다.
- 비면 역 혈청 대비 항체처리구에서 나타난 유의적으로 높은 LDH 수준은 결국 복강지방 특이 항체가 살아있는 복강지방 세포에 직접적으로 작용을 하여 궁극적으로 지방세포를 용해시켜 배지 내 LDH 수준을 증가시킨 것으로 보이며, 이는 지방세포에 대한 항체의 세포독성효과를 간접적으로 보여주고 있는 것이다. 피하지방 특이 항체의 경우 또한 항혈청 처리구의 LDH 수준이 비면역혈청 처리구와 비교해 유의적으로 증가해 (p<0.05), 피하지방 세포에 강한 세포독성 효과를 나타내고 있음을 확인할 수 있었다(Fig. 7). Flint 등(1986)은 흰쥐 지방세포에 대한 항체를 혈청에 1.
- 한우 불가식 체지방 감소육 생산을 위한 연구의 첫 단계로 실시된 본 연구에서 한우 부위별 지방 특이 항체의 개발에 성공하였으며, 생산된 항체가 가지는 타 장기와의 교차 반응성 또한 기존의 연구들에서 보고되었던 항체들보다 훨씬 낮아진 것으로 나타났다. 또한 LDH assay를 통해 실제 항체가 지방세포에 대해 가지는 강한 지방세포감소 효과를 검정할 수 있었다.
- 001) 모두 유의적인 것으로 나타났다. 한우 피하 지방 세 보 특이 항체는 한우 피하지방세포에 대해 1:64, 000배 희석배율까지 유의적으로 높은 반응력을 나타내었으나(1:1,000에서 1:32,000배 희석배율까지는 p<0.01, 1:64, 000배 희석배율에서는 p<0.05), 희석배율에 따라 역가가 순차적으로 감소하는 경향을 나타내면서 1:128, 000배 희석배율에서는 항혈청과 비면역혈청간의 역가 차이는 나타나지 않았다.
- 특히 비면역혈청의 경우 1:1,000배 이상의 희석배율에서는 거의 반응이 감지되지 않았으나, 복강지방 항체의 경우는 1:128, 000배의 희석배율에서도 반응이 감지되었다. 한우 피하지방세포 특이 항체의 역가 또한 ELISA 법으로 동일하게 측정 되 었으며 (Fig. 3), 복강지 방세포 특이 항체와 동일하게 희석배율(p<0.001), 처리(p<0.001) 및 상호작용 (p<0.001) 모두 유의적인 것으로 나타났다. 한우 피하 지방 세 보 특이 항체는 한우 피하지방세포에 대해 1:64, 000배 희석배율까지 유의적으로 높은 반응력을 나타내었으나(1:1,000에서 1:32,000배 희석배율까지는 p<0.
- 복강 및 피하지방세포 원형질막 단백질들은 서로 유사하면서도 특이적인 단백질을 가지고 있는 것으로 SDS-PAGE 분석을 통해 확인할 수 있었다. 희석배율 1:1,000배를 기준으로 비면역혈청은 항원-항체 결합 반응이 거의 측정되지 않았으나, 복강 및 피하지방 항체는 희석배율 1:128, 000 배 및 1:64, 000배까지 각각 항원-항체 반응이 감지되었으며, 이는 본 연구에서 생산한 부위별 지방 특이 다클론 항체가 지방세포 원형질막 단백질에 대해 매우 강한 역가를 가진 항체임을 시사한다. 또한 복강 및 피하지방 항체는 타 장기들과는 특이한 반응을 나타내지 않았다.
- 희석배율과 처리에 따른 이원분산분석을 실시해 본 결과, 항원-항체반응으로 나타난 흡광도는 희석배율에 따라 유의적인 차이를 나타내었으며(/xO.OOl), 처리에 따른 유의적인 차이도 나타내었다(p<0.001) 또한 희석배율과 처리 간의 상호작용도 유의적인 것으로 나타났다3<0.001). Fig.
후속연구
- 현재 생산된 항체 간의 cross-cytotoxicity 연구를 진행 중에 있으며, 향후 본 항체를 한우에 직접 적용하는 항체의 영양생리 및 대사 안전성에 관한 연구와 항체의 부위별 in vivo 세포독성 연구가 계속될 것이다. 앞으로 본 면역학적 기술을 통한 한우 저지방 고급육의 생산의 산업화를 위해 적정 주사시기, 적정 항체량, 주사 부위, 개체 간 면역학적 변이(variation)에 대한 보정, 항체 운반체 (carrier) 및 항체의 저장기법 등과 관련된 지속적인 연구들이 수행되어야 할 것이다.
- 본 연구에서 개발한 두 항체들은 모두 항원으로 이용된 부위의 지방세포 원형질막 단백질과 가장 높은 반응을 나타내었으며, 복강 및 피하지방 특이항체는 비면역혈청에 비해 유의적으로 높은 세포독성 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 이상의 결과를 종합할 때 본 연구에서 개발된 복강 및 피하 지방 감소 다클론 항체는 높은 역가, 타 장기 안전성 및 세포 파괴 효과가 있었으며 생체 타장기 안전성 등 향후 기존의 전체 지방에서 생산한 항체의 단점을 보완할 수 있는 연구가 지속될 경우 불가식 체지방이 감소된 저지방 한우 고급육 생산이 가능하리라고 사료된다.
- 본 연구에서는 한우 지방 부위별로 서로 다른 특성을 가지고 있는 다클론 항체들의 생산이 1차적 목표이기 때문에, SDS-PAGE를 통해 나타난 부위별 지방세포 원형질막 단백질의 서로 다른 패턴만으로도 충분히 지방 부위에 따라 특이적으로 작용하는 항체의 생산이 가능한 것으로 판단된다. 하지만 SDS-PAGE와 같은 1차원적 전기영동만을 통해서는 복강지방세포의 원형질막 단백질과 피하지방세포 원형질막 단백질이 차이가 있다고 단정 짓기에는 무리가 있으며, 향후 부위별 특이 항체 가서로 다른 부위에 선택적으로 작용할 수 있는 반응 기전의 이해를 위해서라도 보다 세분화된 단백질 연구(예: 2- D electrophoresis 등을 통한 특이 단백질 screening)가 필요할 것으로 생각된다.
- 또한 LDH assay를 통해 실제 항체가 지방세포에 대해 가지는 강한 지방세포감소 효과를 검정할 수 있었다. 현재 생산된 항체 간의 cross-cytotoxicity 연구를 진행 중에 있으며, 향후 본 항체를 한우에 직접 적용하는 항체의 영양생리 및 대사 안전성에 관한 연구와 항체의 부위별 in vivo 세포독성 연구가 계속될 것이다. 앞으로 본 면역학적 기술을 통한 한우 저지방 고급육의 생산의 산업화를 위해 적정 주사시기, 적정 항체량, 주사 부위, 개체 간 면역학적 변이(variation)에 대한 보정, 항체 운반체 (carrier) 및 항체의 저장기법 등과 관련된 지속적인 연구들이 수행되어야 할 것이다.
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