선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 이 연구에서는 이런 가능성을 실제로 확인하기 위해 수정미소저울(quartz crystal microbalance, QCM) 표면에 형성된 자기조립단분자층 위에 항체 결합용 단백질로 protein G를 고정시킨 센서 칩을 만들었다. 그리고 정제되지 않은 혈청 상태의 항체를 이용하여 사람 헵토글로빈(human haptoglobin, hHp)과 트랜스페린(human transferrin, hTf)에 대한 면역분석을 시도하였다.
제안 방법
- protein G 센서 칩을 흐름형 셀에 장착한 후 면역분석 방법을 따라 일차항체인 anti-hHp Ab와 항원인 hHp를 차례로 주입하였을 때 시간에 따른 주파수 변화를 관찰하였다. 여기에서 anti-hHp Ab의 농도는 25µg/ml로 항상 일정하였고 항원의 농도는 0.
- protein G 센서 칩의 재현성을 확인하기 위해 단백질 G 센서 칩을 흐름형 셀에 장착한 후 100 µg/ml의 염소 IgG를 주입하여 결합시키고 해리 용액으로 표면을 재생시키는 과정을 9회 반복할 때 염소 IgG의 결합에 의한 주파수 변화를 측정하였다.
- protein G는 서로 다른 생물체의 IgG에 대해 결합력이 조금씩 차이를 보이는 것으로 알려져 있기 때문에 이 실험에서 만들어진 protein G 센서 칩이 염소, 소, 토끼, 생쥐 그리고 사람의 항체에 대해 어떻게 반응하는지 조사하기 위해 anti-goat IgG Ab를 고정시킨 면역센서 칩을 흐름형 셀에 장착한 후 100 µg/ml 농도의 소, 염소, 사람, 생쥐, 토끼의 IgG를 주입하여 결합에 의한 주파수 변화를 측정하였다.
- 이 연구에서는 이런 가능성을 실제로 확인하기 위해 수정미소저울(quartz crystal microbalance, QCM) 표면에 형성된 자기조립단분자층 위에 항체 결합용 단백질로 protein G를 고정시킨 센서 칩을 만들었다. 그리고 정제되지 않은 혈청 상태의 항체를 이용하여 사람 헵토글로빈(human haptoglobin, hHp)과 트랜스페린(human transferrin, hTf)에 대한 면역분석을 시도하였다. 헤모글로빈에 결합하는 활성을 가지고 있는 hHp은 염증 반응에 의해 나타나는 급성기 단백질(acute-phase protein) 가운데 하나로 동물의 감염여부를 진단하는 척도가 되며[8] 최근에는 암을 진단하는 마커 단백질들 가운데 하나로도 밝혀졌다[9].
- 의 7:3 혼합용액)으로 처리한 후 증류수와 알코올로 헹구고 질소 가스로 건조시켰다. 다음으로 알코올에 11-mercapto-undecanoic acid와 6-mercapto-1-hexanol을 각각 0.4 mM과 1.6 mM로 녹인 용액에 표면을 깨끗하게 처리한 수정미소저울을 담그고 12~15시간 동안 천천히 stirring하면서 자기조립단분자층이 형성 되도록 하였다. 마지막으로 자기조립단분자층이 형성된 수정미소저울을 알코올로 헹구고 질소 가스로 건조시켰다.
- 면역분석을 위해서는 항원을 포함하는 시료 용액이 흘러가면서 항체에 결합할 때의 주파수 변화를 실시간에 볼 수 있는 flow injection analysis (FIA)가 더 유리하기 때문에 셀의 위판을 교체하여 우물형 셀을 흐름형 셀로 바꿔주었다. 다음으로 운반 완충용액(carrier buffer)으로 사용된 PBS를 50 µl/min의 유속으로 흘려보내며 베이스라인을 안정시켰다.
- 다음으로 운반 완충용액(carrier buffer)으로 사용된 PBS를 50 µl/min의 유속으로 흘려보내며 베이스라인을 안정시켰다. 센서 칩 표면에는 protein G가 고정되어 있기 때문에 면역분석을 위해서는 먼저 항체를 주입하여 결합시키고 7~10분 후에 항원을 주입하여 주파수 변화를 측정하였다[그림 1]. 인간 헵토글로빈 항체(anti-human haptoglobin antibody, anti-hHp Ab)와 인간 트랜스페린 항체(anti-human transferrin antibody, anti-hTf Ab)는 모두 염소에서 생성되었으며 정제되지 않은 혈청 상태로 Sigma에서 구입하였다.
- 주입 밸브에서 sample loop의 부피는 200 µl로 조정하였다. 실험의 편의를 위하여 셀은 상하 두 개의 판으로 구성되어 있고 두 판 사이에 수정미소저울을 수용하도록 설계되었다. 위판은 수정미소저울 표면에 120 µl 부피의 정적인 반응용액을 접촉시킬 수 있는 우물형 셀(well cell)을 형성하거나 수정미소저울 표면에 액체가 흘러가며 측정을 할 수 있도록 해주는 흐름형 셀(flow cell)을 형성하도록 해준다.
- 여기에서 anti-hHp Ab의 농도는 25µg/ml로 항상 일정하였고 항원의 농도는 0.16, 0.8, 4, 20, 100 µg/ml의 다섯 농도로 주입하였다.
- 우물에 MES 완충용액 50 µl와 0.4 M N-ethyl-N'-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimide(EDC) 용액 25 µl 그리고 0.1 M NHS 용액 25 µl를 더하고 한 시간 동안 반응시켜 자기조립단분자층 표면의 카르복시기가 NHS 기로 전환되도록 하였다.
- 일차항체를 고정시켜 면역분석을 하는 일반적인 방법에 비해 protein G를 미리 고정시켜놓은 센서 칩이 갖는 장점으로는 일차항체의 고정과정이 없이도 빠른 시간에 측정을 할 수 있다는 점, 서로 다른 항원을 분석할 수 있다는 점, 그리고 정제되지 않은 항체를 사용할 때 유리하다는 점 등을 들 수 있다. 이와 같은 장점을 확인하기 위해 protein G 센서 칩과 정제되지 않은 혈청 상태의 두 일차항체 anti-hHp Ab와 anti-hTf Ab를 이용하여 면역분석을 시도하였다.
- 0) 100 µl를 더하였다. 주파수가 안정된 후 수정미소저울 표면을 탈이온수로 3회 헹궈주었다. 우물에 MES 완충용액 50 µl와 0.
- 이 연구에서 만들어진 protein G 센서 칩을 이용하여 면역분석을 하기 위해서는 먼저 항체를 결합시킨 후 항원 시료를 주입해야 한다. 측정할 수 있는 항원의 농도 범위를 넓히기 위해서는 가능하면 많은 양의 일차항체를 결합시키는 것이 유리하기 때문에 anti-goat IgG Ab를 고정시킨 protein G 센서 칩을 흐름형 셀에 장착한 후 서로 다른 농도의 염소 IgG를 주입하여 주파수 변화를 측정함으로써 protein G 센서 칩을 포화시키는데 필요한 염소 IgG의 농도를 평가하였다. 그 결과 그림 3에서 보는 것처럼 15 µg/ml 까지는 주파수 변화 값이 급격히 증가하다가 그 이상에서는 완만해지는 것을 알 수 있다.
대상 데이터
- 이 실험에서 사용한 수정미소저울은 Crystal Sun Life(Tokyo, Japan)에서 구입하였으며 한 변이 8 mm인 정사각형 모양의 AT-cut crystal이다. 고유진동수는 10 MHz이며 직경이 5 mm인 전극 표면은 금으로 코팅되어 있다.
- 센서 칩 표면에는 protein G가 고정되어 있기 때문에 면역분석을 위해서는 먼저 항체를 주입하여 결합시키고 7~10분 후에 항원을 주입하여 주파수 변화를 측정하였다[그림 1]. 인간 헵토글로빈 항체(anti-human haptoglobin antibody, anti-hHp Ab)와 인간 트랜스페린 항체(anti-human transferrin antibody, anti-hTf Ab)는 모두 염소에서 생성되었으며 정제되지 않은 혈청 상태로 Sigma에서 구입하였다. 항원인 hHp과 hTf 역시 Sigma에서 구입하였다.
- 인간 헵토글로빈 항체(anti-human haptoglobin antibody, anti-hHp Ab)와 인간 트랜스페린 항체(anti-human transferrin antibody, anti-hTf Ab)는 모두 염소에서 생성되었으며 정제되지 않은 혈청 상태로 Sigma에서 구입하였다. 항원인 hHp과 hTf 역시 Sigma에서 구입하였다. 각 분석 후에는 해리용액(0.
데이터처리
- Sample loop의 부피가 200 µl로 고정되어있기 때문에 주입되는 시료나 해리용액의 부피는 항상 200 µl로 일정하게 유지되었다. 각 측정 실험은 3회 반복하여 평균값을 산출하였다.
성능/효과
- 그 결과 첫 번째 재생에서는 주파수 변화가 비교적 큰 폭으로 감소하지만 두 번째부터는 서서히 감소하는 것을 볼 수 있었다[그림 4]. 이와 같이 주파수 변화가 감소한다는 것은 표면에 결합할 수 있는 항체의 양이 차츰 감소한다는 것을 의미한다.
- 이 연구에서 만들어진 protein G 센서 칩은 실험에 많이 사용되는 염소, 토끼, 사람, 생쥐, 소의 IgG 가운데 생쥐를 제외하고 나머지 동물의 IgG에 대해서는 충분히 높은 친화도를 보여주었다. 염소에서 만들어진 항혈청 상태의 일차항체를 이용하여 hHp와 hTf에 대한 면역분석을 시도한 결과 농도에 비례하여 주파수 변화 값이 증가하는 것을 확인할 수 있었으며 두 항원 모두 0.8 µg/ml 농도까지 검출할 수 있었다. 특히 정제되지 않은 항혈청을 사용하는 경우에는 EDC와 NHS로 항체를 직접 고정시키는 일반적인 방법에 비해 protein G 센서 칩이 우수한 민감도를 보여주었다.
- 이 연구에서 만들어진 protein G 센서 칩은 실험에 많이 사용되는 염소, 토끼, 사람, 생쥐, 소의 IgG 가운데 생쥐를 제외하고 나머지 동물의 IgG에 대해서는 충분히 높은 친화도를 보여주었다. 염소에서 만들어진 항혈청 상태의 일차항체를 이용하여 hHp와 hTf에 대한 면역분석을 시도한 결과 농도에 비례하여 주파수 변화 값이 증가하는 것을 확인할 수 있었으며 두 항원 모두 0.
- 일차항체를 고정시켜 면역분석을 하는 일반적인 방법에 비해 protein G를 미리 고정시켜놓은 센서 칩이 갖는 장점으로는 일차항체의 고정과정이 없이도 빠른 시간에 측정을 할 수 있다는 점, 서로 다른 항원을 분석할 수 있다는 점, 그리고 정제되지 않은 항체를 사용할 때 유리하다는 점 등을 들 수 있다. 이와 같은 장점을 확인하기 위해 protein G 센서 칩과 정제되지 않은 혈청 상태의 두 일차항체 anti-hHp Ab와 anti-hTf Ab를 이용하여 면역분석을 시도하였다.
- 이 두 그래프는 면역분석 실험에서 항원인 hHp 또는 hTf가 주입되었을 때의 주파수 변화를 농도에 대해 그린 것이다. 특히 그림 7에 있는 hTf의 면역분석 결과를 보면 EDC/NHS 방법으로 정제되지 않은 항혈청 상태의 일차항체를 직접 고정시킨 센서 칩에 비해 protein G 센서 칩이 더 민감하게 반응한다는 것을 알 수 있다. 그 이유는 EDC/NHS 방법으로 정제되지 않은 일차항체를 고정시킬 때는 IgG 외의 다른 단백질들도 함께 고정되어 표면에 고정된 일차항체의 양이 작고 또 고정된 일차항체의 방향이 일정하지 않기 때문일 것이다.
후속연구
- 특히 정제되지 않은 항혈청을 사용하는 경우에는 EDC와 NHS로 항체를 직접 고정시키는 일반적인 방법에 비해 protein G 센서 칩이 우수한 민감도를 보여주었다. 이와 같은 결과들을 볼 때 여러 종류의 항체를 사용해야 할 경우나 정제되지 않은 항체를 사용하는 경우에는 protein G 센서 칩을 사용하는 것 더 유리할 것으로 판단된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.