선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 본 연구에서는 신경재생에 중요한 역할을 하는 슈반세포를 순수분리하고 천연유래 고분자인 소장점막하조직을 사용하여 슈반세 포를 파종한 조직공학적 지지체를 절단된 말초 신경에 이식하여 시간이 경과하면서 신경축삭이 연결되어 말초 신경으로의 역할을 복원하는 것이 목적이다.
- 본 연구에서는 천연 생체 재료인 SIS를 스폰지 형태로 제조한 조직공학적 지지체와 슈반세포를 이용하여 완전히 절단되어 손상된 말초 신경의 재생에 응용하고자 하였다. 본 연구에서 채택한 좌골신경 모델은 단순 절단이 아닌 5 mm의 신경결손을 만들었다.
제안 방법
- 그리고, Group I과 Group Ⅱ는 몸쪽과 말단의 제거된 신경 사이에 5 mm의 제조된 SIS 스폰지를 넣고 4-0 Dexon 봉합사를 이용하여 신경과 스폰지를 연결하는 신경 외막 봉합을 한다(Figure 2(c)). Control Ⅱ는 제거된 신경 사이에 아무런 처리를 하지 않고 근막 봉합을 실시하였다. 근막 봉합은 신경 외막 봉합사와 동일한 봉합사를 이용하였고, 피부는 Nylon 5-0 Dermaion 단사로 봉합하였다 말초 신경 손상을 입은 쥐는 각별한 주의와 관리가 필요하기 때문에 수술 후에는 깨끗한 케이지와 새 베딩으로 옮기고 바닥을 따뜻하게 해주거나 열을 발산하는 적외선 광원으로 따뜻하게 해 주었다 6, 8, 14, 15, 30
- SIS 분리 및 스폰지 제조. SIS를 분리하기 위하여 돼지의 공장에 있는 지방조직을 우선 제거하고, 물로 깨끗이 공장 안과 밖을 세척한 다음, 공장을 대략 10 cm 정도의 길이로 잘라서 식염수에 넣고 세척하였다. 잘라낸 공장을 집게와 손을 이용하여 물리적 힘을 가해서 바깥층에 있는 치밀층을 제거하고 다시 뒤집어서 점막 근욕층을 제거하여 SIS 층만을 분리하였다.
- ) 와 1 : 500으로 희석한 rabbit anti—GFAP(glial fibrillary acidic protein) 항체 (DAKO Cytomation, Denmark)를 각각 처리하여 AEC 방법을 통하여 면역세포화학염색을 수행하였으며 상온에서 1시간 방치한 후, anti—rabbit immunoglobulin 항체를 첨가하여 다시 상온에서 30분 동안 반응시켰다. 그 후 아비딘-바이오틴-퍼록시데이즈 복합체를 첨가하여 다시 상온에서 30분 방치하고 크로모젠으로 발색 여부를 판단하였다.Z5J6J8
- 05% 트립신-EDTA (Gibco, BRL) 으로 떼어낸 후 배양 슬라이드에 세포를 각각 2X10, cells씩 분주하여 상기의 배양액으로 배양한 후 PBS로 세척하고 10% 포르말린으로 세포를 고정하여 4 ℃에서 하루동안 보관하였다. 그리고 슈반세포의 여부를 알아보기 위해 슈반세포의 마커의 일종인 1 : 2000으로 희석한 rabbit anti-S-100 항체 (Sigma Chem Co.) 와 1 : 500으로 희석한 rabbit anti—GFAP(glial fibrillary acidic protein) 항체 (DAKO Cytomation, Denmark)를 각각 처리하여 AEC 방법을 통하여 면역세포화학염색을 수행하였으며 상온에서 1시간 방치한 후, anti—rabbit immunoglobulin 항체를 첨가하여 다시 상온에서 30분 동안 반응시켰다. 그 후 아비딘-바이오틴-퍼록시데이즈 복합체를 첨가하여 다시 상온에서 30분 방치하고 크로모젠으로 발색 여부를 판단하였다.
- 조직학적 평가를 하기 위한 가장 기본적인 염색법인 H&E 염색은 세포의 핵에 특이적으로 염색이 되는 hematoxylin과 세포질에 염색이 되는 eosin을 이용한 염색법으로 핵과 세포질의 성상을 파악할 수 있게 하여 전체적인 형태를 관찰하였다. 그리고 신경 세포를 관찰하기 위해 신경 아교 세포에 특이적으로 발현하는 1 : 2000으로 희석한 rabbit anti-S-100 항체(Sigma Chem Co., ) 와 1 : 500으로 희석한 rabbit anti-GFAP 항체 (DAKO, USA)로 처리하여 확인할 수 있었다. 뉴런은 1 : 50으로 희석한 mouse anti-Neurofilaments 항체 (NF, Seytek, USA) 를 조직 처리하여 확인할 수 있었다.
- 본 연구에서 채택한 좌골신경 모델은 단순 절단이 아닌 5 mm의 신경결손을 만들었다. 그리고 우수한 재생 효과를 나타내는 슈반세포를 순수 배양하여 실험에 응용하였는데, 이는 액체 상태의 슈반세포 부유액을 넣는 경우 주변 조직으로 세포 부유액이 새어 원하는 부위에 세포조직을 유지시킬 수 없기 때문에 이를 막기 위하여 SIS를 스폰지를 사용하였다. 이번 실험 결과 SIS 스폰지는 신경 유도관으로 신경 영양물질 또는 신경 성장 물질이 존재하기 때문에 말초 신경의 재생을 촉진하고 생체 조직에 이식할 때 세포면역에 의한 거부 반응을 일으키지 않는다는 것을 확인했고, 조직공학적 결과로써 우수한 특성을 가짐을 보여주고 있었다.
- 세포의 증식 양상 관찰 및 면역세포화학 염색. 배양된 슈반세포를 6웰에 분주한 3일 후에 세포증식양상을 육안관찰하기 위하여 위상차 현미경 (Nikon TE-2000, Japan)으로 관찰하였다. 웰에 배양한 세포를 0.
- Figure 6은 SIS 스폰지에 대한 슈반세포의 반응을 살펴보고자 3, 7, 14 및 21일의 세포부착도 및 증식 도를 알아본 것이다. 부착도와 증식도의 정성적인 분석은 세포가 시료와 접촉한 특성 시간 후에 세포에 대한 MTT 분석을 수행함으로써 이루어 졌다. 슈반세포의 성장도를 보면, 3일 배양 후 측정한 MTT 결과, 시간이 지남에 따라 세포수가 점차적으로 증가함을 확인할 수 있었으며, 7일에서 14일로 지남에 따라 세포 분화가 이루어지면서 세포 성장률이 조금 지체되었지만 14일 이후에는 성장이 급격한 속도로 증가함을 알 수 있었다.
- 5 mm로 잘랐다. 실험군은 4개의 그룹으로 나누어 동일한 평가방법을 통하여 실험을 진행하였다 대조군으로 손상되지 않은 말초 신경 모델 (Control I, n=2) 과 손상된 말초 신경에 SIS 스폰지와 슈반세포를 넣지 않은 모델(Control, n=9)을 만들었으며, 실험군2로 SIS 스폰지만 넣은 모델 (Group I, n=9)과 SIS 스폰지와 슈반세포를 넣은 모델(Group Ⅱ, n=9)을 제조하였다. 본 연구에서 사용한 슈반세포는 2대 계대 배양 후 3 계 대째의 세포를 세포로 계산하여 SIS 스폰지에 파종하였다.
- 05% 콜라게나아제를 넣고 인큐베이터에서 6~10시간 동안 방치한 후 파스퇴르 피펫을 이용해서 신경의 기질을 제거하고 단일세포로 분리하였다. 이 과정에서 얻어낸 슈반세포를 새로운 용기에 옮긴 후 섬유아세포의 수를 감소시키는 역할을 하는 포스콜린(Sigma Chem. Co., USA) 을 배양액에 2 uM의 농도로 첨가하여 슈반세포의 순도를 높였으며, 성장 영양인자인 소 뇌하수체 추출물(Gibco BRL) 을 20 pg/mL의 농도로 첨가하여 슈반세포의 증식을 높이고자 하였다.
- 세포 배양액으로는 10% 우태아혈청 (FBS, Gibco BRL, USA) 및 항생제(100 unit/mL 페니실린과 100 ug/mL 스트럽토마이신, Gibco BRL, USA)를 첨가한 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, 고농도 글루코오스, Gibco BRL, USA)을 사용하였다. 이러한 방법으로 섬유아세포가 일차적으로 제거되면 신경조직을 수거하여 L25 unit/mL 디스파제 (Boehringer Mannheim, Germany) 와 0.05% 콜라게나아제를 넣고 인큐베이터에서 6~10시간 동안 방치한 후 파스퇴르 피펫을 이용해서 신경의 기질을 제거하고 단일세포로 분리하였다. 이 과정에서 얻어낸 슈반세포를 새로운 용기에 옮긴 후 섬유아세포의 수를 감소시키는 역할을 하는 포스콜린(Sigma Chem.
- SIS를 분리하기 위하여 돼지의 공장에 있는 지방조직을 우선 제거하고, 물로 깨끗이 공장 안과 밖을 세척한 다음, 공장을 대략 10 cm 정도의 길이로 잘라서 식염수에 넣고 세척하였다. 잘라낸 공장을 집게와 손을 이용하여 물리적 힘을 가해서 바깥층에 있는 치밀층을 제거하고 다시 뒤집어서 점막 근욕층을 제거하여 SIS 층만을 분리하였다. 이렇게 얻은 SIS 를 마지막으로 다시 식염수로 세척하고, -80 ℃ 극저온 냉각기에 보관하였다.
- -80 ℃에서 보관한 SIS를 동결 건조한 뒤 믹서기로 분쇄한 SIS를 동결 분쇄기를 이용하여 대략 20 um 크기의 고운 분말로 만들었다. 제조된 SIS 분말을 3% 아세트산에 0.1% 펩신(Sigma Chem. Co.)을 함유한 용액에 1 및 2 wt% 첨가시켜 상온에서 48시간 동안 방치한 후 직경 30 mm의 자체 제작된 원형 몰드에 담고 이를 급랭 후 동결 건조시켜 스폰지 형태의 SIS를 얻었다. 제조된 SIS 스폰지는 각각 95% 에탄올(탈이 온수 : 에탄올=5 : 95)에 EDC(l-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride, Sigma Chem.
- 세포 부착률은 MTT 분석법을 이용하여 관찰하였다. 제조된 SIS 스폰지에 슈반세포를 1X105 개로 계산하여 파종 후, 3, 5, 7 및 14일째 MTT(3-[4, 5- dimethylthiazol—2yl] —2, 5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma Co.) 용액 (50 pg/mL) 을 100 pL씩 넣고 4 시간 동안 37 ℃ 인큐베이터에서 배양한다. 보라색 결정이 생성되면 PBS로 결정이 떨어지지 않게 3번 행구고 디메틸설폭사이드(Sigma Co.
- 적출된 신경은 24시간 동안 10% 포르말린에 고정시키고, 고정된 지지체를 파라핀 블록으로 제작한 후에 3 pm로 자른 후 슬라이드 글라스에 고정한다. 조직학적 평가를 하기 위한 가장 기본적인 염색법인 H&E 염색은 세포의 핵에 특이적으로 염색이 되는 hematoxylin과 세포질에 염색이 되는 eosin을 이용한 염색법으로 핵과 세포질의 성상을 파악할 수 있게 하여 전체적인 형태를 관찰하였다. 그리고 신경 세포를 관찰하기 위해 신경 아교 세포에 특이적으로 발현하는 1 : 2000으로 희석한 rabbit anti-S-100 항체(Sigma Chem Co.
대상 데이터
- 말초 신경 손상 모델로 사용된 29마리의 F 344 Fischer 쥐는 동종간의 면역반응이 없어 세포치료 연구에 매우 유용한 동물로 말초 신경 재생 연구에 사용된다. 5주된 암컷 Fischer 쥐를 케타민과 럼푼을 1 : 1로 혼합한 마취제로 마취시켰다. 그런 후대퇴부의 피부를 절개한 후 근육 분리 절개를 하여 좌골신경을 드러내어(Figure 2(a)), 드러난 좌골신경 5 mm를 제거한다(Figure 2(b)).
- 실험군은 4개의 그룹으로 나누어 동일한 평가방법을 통하여 실험을 진행하였다 대조군으로 손상되지 않은 말초 신경 모델 (Control I, n=2) 과 손상된 말초 신경에 SIS 스폰지와 슈반세포를 넣지 않은 모델(Control, n=9)을 만들었으며, 실험군2로 SIS 스폰지만 넣은 모델 (Group I, n=9)과 SIS 스폰지와 슈반세포를 넣은 모델(Group Ⅱ, n=9)을 제조하였다. 본 연구에서 사용한 슈반세포는 2대 계대 배양 후 3 계 대째의 세포를 세포로 계산하여 SIS 스폰지에 파종하였다.
- 신경의 재생에 응용하고자 하였다. 본 연구에서 채택한 좌골신경 모델은 단순 절단이 아닌 5 mm의 신경결손을 만들었다. 그리고 우수한 재생 효과를 나타내는 슈반세포를 순수 배양하여 실험에 응용하였는데, 이는 액체 상태의 슈반세포 부유액을 넣는 경우 주변 조직으로 세포 부유액이 새어 원하는 부위에 세포조직을 유지시킬 수 없기 때문에 이를 막기 위하여 SIS를 스폰지를 사용하였다.
- 3 일에 한 번씩 배양액을 교체하고 7일에 한 번씩 새로운 용기로 신경조직을 옮겨주면서 5주 동안 배양하였다. 세포 배양액으로는 10% 우태아혈청 (FBS, Gibco BRL, USA) 및 항생제(100 unit/mL 페니실린과 100 ug/mL 스트럽토마이신, Gibco BRL, USA)를 첨가한 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, 고농도 글루코오스, Gibco BRL, USA)을 사용하였다. 이러한 방법으로 섬유아세포가 일차적으로 제거되면 신경조직을 수거하여 L25 unit/mL 디스파제 (Boehringer Mannheim, Germany) 와 0.
이론/모형
- SIS 스폰지에 슈반세포 부착도 실험. 세포 부착률은 MTT 분석법을 이용하여 관찰하였다. 제조된 SIS 스폰지에 슈반세포를 1X105 개로 계산하여 파종 후, 3, 5, 7 및 14일째 MTT(3-[4, 5- dimethylthiazol—2yl] —2, 5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma Co.
- 슈반세포의 분리 및 배양. 슈반세포의 배양 방법 중 안전하고 쉬우면서 순수한 세포 분리가 가능한 Morrissey의 방법을 이용하였다. 먼저 Fischer 쥐의 대퇴부에서 좌골신경을 분리하여 PBS가 담겨있는 페트리디쉬에 담그고 상피를 벗겨내었다.
- 뉴런은 1 : 50으로 희석한 mouse anti-Neurofilaments 항체 (NF, Seytek, USA) 를 조직 처리하여 확인할 수 있었다. 조직학적 평가를 위한 염색 방법도 면역 세포 화학적 염색과 동일한 방법인 AEC 방법을 통하여 발현 여부를 확인하였다.京8
성능/효과
- 하지만 이식 부위를 완전히 연결하지 못함을 확인하였다. SIS 스폰지와 슈반세포를 함께 이식한 군은 손상을 받지 않은 군과 별 차이가 없을 정도로 수초 화가 급격히 증가하는 양상을 보여 주었고 거동 시 손상을 받지 않은 군과 별 다른 차이점을 볼 수 없을 정도로 빠른 회복을 보여주었다. 이는 SIS 스폰지를 통하여 재생에 필요한 물질을 적절히 공급하고, 차단된 수송을 원활히 일어나게 한 것으로 추정된다.
- 좌골 신경에 손상을 주었을 경우 신경 섬유는 시간이 경과할수록 증가하고 재생된 신경 정도도 시간이 경과함에 따라 증가하는 것을 보였다. 그리고 8주 후 아무것도 이식하지 않은 군에서는 조직의 형성이 미미하였지만, SIS 스폰지만 이식한 군은 이식하지 않은 군보다 신경 재생이 더 많이 진행되었고 조직이 형성되었다. 하지만 이식 부위를 완전히 연결하지 못함을 확인하였다.
- 면역세포화힉염색 관찰. 슈반세포를 확인하기 위하여 슈반세포에서 발현되는 특정 단백질인 S-100 단백질과 GFAP 단백질로 면역세포화학 염색을 실시한 결과, 섬유이세포에서는 단백질이 발현되지 않았고(Figure 4), 슈반세포는 S-100 단백질과 GFAP 단백질이 붉은 색으로 강하게 발현됨을 확인하였다. 그리고 슈반세포들은 규칙적으로 배열되어 있고 긴 타원형의 더욱 짙게 염색된 슈반세포의 핵도 관찰되었다(Figure 5).
- 부착도와 증식도의 정성적인 분석은 세포가 시료와 접촉한 특성 시간 후에 세포에 대한 MTT 분석을 수행함으로써 이루어 졌다. 슈반세포의 성장도를 보면, 3일 배양 후 측정한 MTT 결과, 시간이 지남에 따라 세포수가 점차적으로 증가함을 확인할 수 있었으며, 7일에서 14일로 지남에 따라 세포 분화가 이루어지면서 세포 성장률이 조금 지체되었지만 14일 이후에는 성장이 급격한 속도로 증가함을 알 수 있었다. 이 결과로부터 SIS 스폰지 내에서 슈반세포가 잘 성장하고 생존함을 확인할 수 있었다.
- 그리고 Group Ⅱ는 Group I과 Control Ⅱ에 비해 Control I (Figures 8(e), 9(a), 10(e)) 과 유사하게 정상에 가까운 신경섬유 단면구조와 심경섬유를 형성하고 있는 것을 관찰되었다. 신경섬유는 주위의 신경외막에 의해 둘러싸이면서 규칙적인 다발을 형성하고 있는 것이 관찰되었고, 신경섬유 주위에 모여 있는 분화한 슈반세포의 핵으로 보이는 부분의 세포질 위에 뚜렷한 양성반응을 보이는 세포들이 다수 나타났으며 작은 신경섬유 주위의 슈반세포의 핵에도 반응이 나타났다. 정상적인 상태로 회복속도가 빠른 결과를 보인 것은 시간이 경과함에 따라 슈반세포가 신경재생에 관여하여 신경재생과정에 필요한 신경 영양 인자 자극에 영향을 끼친 것으로 사료된다.
- 슈반세포의 성장도를 보면, 3일 배양 후 측정한 MTT 결과, 시간이 지남에 따라 세포수가 점차적으로 증가함을 확인할 수 있었으며, 7일에서 14일로 지남에 따라 세포 분화가 이루어지면서 세포 성장률이 조금 지체되었지만 14일 이후에는 성장이 급격한 속도로 증가함을 알 수 있었다. 이 결과로부터 SIS 스폰지 내에서 슈반세포가 잘 성장하고 생존함을 확인할 수 있었다.
- 그리고 우수한 재생 효과를 나타내는 슈반세포를 순수 배양하여 실험에 응용하였는데, 이는 액체 상태의 슈반세포 부유액을 넣는 경우 주변 조직으로 세포 부유액이 새어 원하는 부위에 세포조직을 유지시킬 수 없기 때문에 이를 막기 위하여 SIS를 스폰지를 사용하였다. 이번 실험 결과 SIS 스폰지는 신경 유도관으로 신경 영양물질 또는 신경 성장 물질이 존재하기 때문에 말초 신경의 재생을 촉진하고 생체 조직에 이식할 때 세포면역에 의한 거부 반응을 일으키지 않는다는 것을 확인했고, 조직공학적 결과로써 우수한 특성을 가짐을 보여주고 있었다. 좌골 신경에 손상을 주었을 경우 신경 섬유는 시간이 경과할수록 증가하고 재생된 신경 정도도 시간이 경과함에 따라 증가하는 것을 보였다.
- 슈반세포의 육안적 증식 양상 관찰. 전술한 세포 분리의 방법을 이용하여 순수한 슈반세포를 얻을 수 있었다 세포 분리의 각 단계를 거치면서 섬유아세포를 제거하여 배양한 결과 95% 이상의 순도를 확인하였다. 이렇게 순수 배양된 슈반세포의 성장 형태를 알아보고자 3 일 동안 6웰에 배양하여 위상차 현미경으로 세포의 증식을 확인한 결과, 배양된 슈반세포는 방추형 모양의 형태를 보였다(Figure 3).
- 이번 실험 결과 SIS 스폰지는 신경 유도관으로 신경 영양물질 또는 신경 성장 물질이 존재하기 때문에 말초 신경의 재생을 촉진하고 생체 조직에 이식할 때 세포면역에 의한 거부 반응을 일으키지 않는다는 것을 확인했고, 조직공학적 결과로써 우수한 특성을 가짐을 보여주고 있었다. 좌골 신경에 손상을 주었을 경우 신경 섬유는 시간이 경과할수록 증가하고 재생된 신경 정도도 시간이 경과함에 따라 증가하는 것을 보였다. 그리고 8주 후 아무것도 이식하지 않은 군에서는 조직의 형성이 미미하였지만, SIS 스폰지만 이식한 군은 이식하지 않은 군보다 신경 재생이 더 많이 진행되었고 조직이 형성되었다.
후속연구
- 이는 SIS 스폰지를 통하여 재생에 필요한 물질을 적절히 공급하고, 차단된 수송을 원활히 일어나게 한 것으로 추정된다. 그리고 슈반세포가 말초 신경 손상시 자연 회복을 촉진시키는 효과가 있으므로 신경 손상 시 슈반세포를 임상에 적용한다면 신경 재생을 유도할 수 있을 것이라고 사료된다. 따라서 본 연구에서 사용한 같은 방법을 통해 손상된 척수신경재생을 위한 연구와 SIS 스폰지의 다공이 신경 재생에 있어 세포 성장 방향에 끼치는 영향을 확인할 예정이다.
- 그리고 슈반세포가 말초 신경 손상시 자연 회복을 촉진시키는 효과가 있으므로 신경 손상 시 슈반세포를 임상에 적용한다면 신경 재생을 유도할 수 있을 것이라고 사료된다. 따라서 본 연구에서 사용한 같은 방법을 통해 손상된 척수신경재생을 위한 연구와 SIS 스폰지의 다공이 신경 재생에 있어 세포 성장 방향에 끼치는 영향을 확인할 예정이다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.