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문제 정의
- 따라서 소고기 뿐 아니라 돼지고기나 소간 등의 내장 부위에 걸쳐 대부분의 육류식품에서 성장호르몬제의 분포 정도를 알아보고자 한다.
- 이러한 특성에 따라 천연형 호르몬의 잔류정도와 분석방법이 정해져야 한다. 또한 본 연구의 목적은 일반적으로 섭취하는 식품에 어느 정도의 스테로이드 호르몬이 분포하고 이를 기반으로 노출평가에 필요한 제반 정보를 제공하는 데 있다. 따라서 식품에 대한 이러한 정확한 정보를 얻기 위해서는 돼지고기, 소고기 등 식육 원료에 대한 지속적인 다양한 모니터링이 필요하다.
- 본 연구에서는 식품 중 극미량으로 존재하는 천연 및 합성 호르몬의 확인과 정확한 정 량을 위하여 동위원소 내부표준법을 적용하고, 간단하고 효율적인 추출 및 정제방법을 확립하여 실제 육류 식품 시료 중 존재할 수 있는 대상 호르몬들을 분석하고자하였다. 따라서 소고기 뿐 아니라 돼지고기나 소간 등의 내장 부위에 걸쳐 대부분의 육류식품에서 성장호르몬제의 분포 정도를 알아보고자 한다.
제안 방법
- 호르몬에 대한 검 량곡선을 구하였다. 8종의 호르몬에 대한 검 량곡선은 DL~5 jig/kg 범위에서 0.99 이상의 좋은 직선성을 나타내었고, 다른 호르몬에 비해 실제 검출 농도와 검출빈도가 높은 progesteronee 0.2 ~20 jxg/kg과 1-50 jxg/kg의 두 구간으로 나누어 검량곡선을 구하였다.
- 따라서 헥산 주줄과정을 생략하여 사용되는 용액의 양을 줄이고 호르몬제의 회수율을 높이며 여과 후 남은 triacylglycerol 성분을 효과적으로 제거하기 위해 Q cartridge의한 정제방법을 적용하였다. 9종의 천연 및 합성 호르몬을 분획 하여 따로 분리 하지 않고 G 카트리지로 한꺼번에 용리시키기 위하여 메탄올로 용리시키는 조건을 사용하였다. 따라서 1차 정제 과정과 지질분리를 위한 G 칼럼의 전체 성장 호르몬제에 대한 동시 분리 및 정제 조건을 확립하였고 이 조건에서 전체 9종의 성장호르몬제들이 모두 분리 용출되었으며 95% 이상의 매우 좋은 회수율을 보였다.
- 유지하였다. 검출모드로 정 량분석을 위하여 선택이온검색(selected ion monitoring, SIM)에서 각각의 정 량이온과 확인 이온을 선택하였다. 본 실험에서 선택한 정량 이온 및 대상물질의 머무름 시간을 Table 1에 실었다.
- 따라서 일반적으로 성장호르몬제류를 일괄 추출 후 극성에 따라 각각 다른 SPE를 사용하여 분획하여 나누고 계열별로 다른 정제과정을 거친다. 그러나 본 실험에서는 극성스테로이드 물질인 stilbenes이나 RAL's, estradiol 등의 페놀계 스테로이드 뿐 아니라 androgen이나 gestagen 같은 중성 스테로이드를 동시에 추출하는 방법을 적용하였다.
- 1 ~100 ng/mL)의 혼합표준액을 6단계 이상 조제하였다. 내부표준물질도 표준물질과 같이 메탄올에 녹여 1000 mg/L 표준원액을 조제하고 표준원액을 메탄올로 희석 혼합하여 소정농도(통상 1~10mg/L)의 혼합표준액을 조제하였다.
- 내부표준법을 이용하여 GC/MS로부터 얻어진 분석대상 물질과 내부표준물질과의 각각의 면적 비로부터 9종의 호르몬에 대한 검 량곡선을 구하였다. 8종의 호르몬에 대한 검 량곡선은 DL~5 jig/kg 범위에서 0.
- 본 연구에서 개발된 분석법은 육류 및 간 등의 내장에서 천연 및 합성 호르몬제 뿐 아니라 estrogen 대사체까지 그 성질에 따라 정제를 위한 분획을 나누지 않고 동시에 분석이 가능하다. 또한 액-액 주줄 법을 고체상추출법으로 대체하여 지질제거 용매인 헥산에 의해 유실되는 지용성 스테로이드인 progesterone 등의 회수율을 증가시킬 수 있었으며, 전체 분석 시간도 줄일 수 있었다.
- 또한 액-액 주줄 법을 고체상추출법으로 대체하여 지질제거 용매인 헥산에 의해 유실되는 지용성 스테로이드인 progesterone 등의 회수율을 증가시킬 수 있었으며, 전체 분석 시간도 줄일 수 있었다. 본 연구팀은 기존의 기기분석 방법을 사용하면서 전처리 방법으로 냉동 지질 여과법을 사용하고 최적의 유도체화방법과 동위원소 표지된 내부표준물질을 사용하여 목표검출한계를 낮출 수 있었다. 목표 검출한계 내에서 유럽의 공인 방법보다 사용 시료무게를 줄여서 사용함으로써 새로운 분석 방법에 의해 시약과 시간을 절약하였다.
- 성장호르몬제 중 가장 큰 bioactivity를 가지는 estrogen의 경우 상당한 양의 17a-estradiol와 estrone0] 존재하므로 각각 따로 분석하였다. 나머지 대부분의 성장호르몬제의 경우 각각의 대표적인 이성질체가 가장 높은 비율로 대사된다.
- 육류시료(소고기, 돼지고기, 소간)는 200 g 이상 분쇄기로 갈아 균질화한 후 냉동고(-20℃)에 보관하였다. 소고기 시료의 경우 기존에 발표했던 분석법을 일부 변형하여 사용하였다.9
- 시료별로 개발된 분석법의 회수율을 구하기 위해 호르몬제 표준품 10 μg/kg을 2종류의 육류 및 소간 시료에 첨가하여 회수 실험하고 정밀도를 구하였다. 각각의 시료에 대해서 9종의 성장 호르몬제는 66- 112%의 회수율을 보였다.
- 시료별로 실험 방법에 대한 검출 한계를 구하기 위하여, 소고기 및 소간을 200 g이상 균질화한 후 7개의 시료에 호르몬제를 첨가하여 회수 실험하였다. Progesteronee 1 jxg/kg, 그 외 8종의 호르몬은 0.
- 용기를 메탄올로 씻어낸 후 상층액과 세척액을 합한 후 회전식 감압 농축기로 고체상 추출을 하기위해 농축하였다. 시료의 정제를 위해 5 mL 메탄올과 5 mL 증류수로 C8 SPE 카트리지를 씻은 후 위의 액을 옮기고 5 mL 증류수로 용기와 카트리지를 세척한 후 세척액은 버리고 4 mL 메탄올로 분석물을 회수용 수기에 용출시킨 후 질소 농축기로 농축하였다.
- 68) 5 mL와 에틸아세테이트/메탄올(80:20) 5 mL 로 세척 한 NHjSPE에 올린 후 에틸아세테 이트/메탄올(80:20) 6 mL로 용출시킨 후 이 용출액을 질소 농축기에 농축시켜 용매를 완전히 날려 보내어 유도 체화하였다. 유도체화 방법은 시료를 완전히 건조시킨시 험관에 MSTFA/NH&DTE (1000:4:2, v/w/w) 80 μL 와 주사기표준물질 phenanthrene-dio (1 ppm) 20 μL를 넣고 밀봉한 후 io(rc에서 20분간 반응 후 상온에서 식히고, 1 pL를 GC/MS의 시료로 하였다. 전체적인 분석 개요도는 Fig.
- 지방조직에는 약 73%의 conjugation된 형태가 존재하는데 지방조직에서 발견되는 대사체는 약 62% 정도로 알려져 있으며 그 중 약 11%정도가 2O-0-hydroxy-4-pregnen-3-one이다"& 따라서 progesterone의 경우도 free steroid의 conjugation 형태는 존재하지 않는다. 유럽과 미국의 규제대상 호르몬과 그 대사체등을 참고하여 본 연구에서는 국내 규제대상 성장호르몬 2종(DES, zeranol)과 가장 많이 사용되는 천연형 성장호르몬들, 그리고 그 주대 사체를 중심으로 분석대상 9종의 호르몬과 대사체를 결정하였다.
- 칼럼은 DB-1MS 용융 실리카 캐피러리 컬럼 (30 mx0.25 mm, 0.25 pin film thickness)을 이온원과 직접 연결되는 직접 연결방식(direct interftice)을 사용하였다. 오븐 온도는 초기 120℃에서 2분간 머무른 후 분당 15℃/min의 승온 속도로 250℃까지 올린 후 다시 분당 kC/min의 승온 속도로 200℃까지 올린 후 5분 동안 머물게 하였다.
- 각 성분의 표준물질을 메탄올(estronee 아세톤)에 녹여 1000 mg/L 표준원액을 조제하였다. 표준원액을 조제한 용매로 희석 혼합하여 소정농도(0.1 ~100 ng/mL)의 혼합표준액을 6단계 이상 조제하였다. 내부표준물질도 표준물질과 같이 메탄올에 녹여 1000 mg/L 표준원액을 조제하고 표준원액을 메탄올로 희석 혼합하여 소정농도(통상 1~10mg/L)의 혼합표준액을 조제하였다.
대상 데이터
- 기체 크로마토그래피-질량분석기는 Agilent 6890 plus 기체 크로마토그래피와 Agilent 5973N 사중극자형 질 량분석기(Agilent, USA)를 사용하였다. 칼럼은 DB-1MS 용융 실리카 캐피러리 컬럼 (30 mx0.
- 후 사용하였다. 내부표준물질로는 DES-d% testosterone-d2는 CIL (Andover, MA, USA)을 사용하였으며 estmdiol-ds와 norprogesteronee Sigma (St Louis, MO, USA) 제품을 사용하였다. 각 성분의 표준물질을 메탄올(estronee 아세톤)에 녹여 1000 mg/L 표준원액을 조제하였다.
- 혼합하여 사용하였다. 분해효소제로 p-glucuro- nidase-atylsulfatase (Sigma, St Louis, MO, USA)를 사용하였다. 고체상 주출 칼럼은 Phenomenex (Torrance, CA, USA)사의 Strata C8(lg, 6 mL)와 Strata NH2 (0.
- 소비량이 큰 식육(소고기, 돼지고기) 및 소의 내장 중 섭취량이 많은 간을 대상 시료로 선정하여 서울 및 수도권 지역의 상점에서 구입하여 분석하였다. 육류시료(소고기, 돼지고기, 소간)는 200 g 이상 분쇄기로 갈아 균질화한 후 냉동고(-20℃)에 보관하였다.
- 우육, 돈육 및 소의 내장(간)에 대해 총 150건의 시료를 서울 및 수도권 지역의 상점에서 구입하여 분석하였다. 평균지방 함량은 국내산 등심은 13%, 국내산 돼지고기는 21%, 간은 5% 이었다.
- 유도체 화 시 약으로는 PIERCE (Rockford, 11, USA) 제품의 N-methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide (MSTFA), Merck (Darmstadt, Germany) 제품의 ammonium iodide (NH4l) 그리고 Sigma (St Louis, MO, USA) 제품의 dithioerythritol (DTE)를 1000:4:2 (v/w/w)로 혼합하여 사용하였다. 분해효소제로 p-glucuro- nidase-atylsulfatase (Sigma, St Louis, MO, USA)를 사용하였다.
- 표준물질로 사용된 diethylstilbestrol, 이3-estradiol, estrone, epitestosterone, zeranol, taleranol, progesterone 은 Sigma (St Louis, MO, USA)에서 , testosteronee Wako pure chemical industries (Japan)0, ] 구입 하여 희석 후 사용하였다. 내부표준물질로는 DES-d% testosterone-d2는 CIL (Andover, MA, USA)을 사용하였으며 estmdiol-ds와 norprogesteronee Sigma (St Louis, MO, USA) 제품을 사용하였다.
이론/모형
- 또한 추출용매인 메탄올은 헥산과 어느 정도 서로 섞이므로 여기에서도 추출효율이 감소하게 된다. 따라서 헥산 주줄과정을 생략하여 사용되는 용액의 양을 줄이고 호르몬제의 회수율을 높이며 여과 후 남은 triacylglycerol 성분을 효과적으로 제거하기 위해 Q cartridge의한 정제방법을 적용하였다. 9종의 천연 및 합성 호르몬을 분획 하여 따로 분리 하지 않고 G 카트리지로 한꺼번에 용리시키기 위하여 메탄올로 용리시키는 조건을 사용하였다.
- 시료주입방식은 분할주입법 (split, 10:1)으로 1 rL 주입하였으며 주입구 온도는 250℃, 인터페이스 온도는 280℃, 그리고 운반기체로 헬륨(99.999%)을 사용하였고 유속은 1 mL/min, 평균 선속도 39 cm/sec이었다.
- 질량분석기에 사용된 이온화 법은 전자 충격법 (electron impact ionization)으로 이온화 에너지 70 eV 에서 사용하였으며, 이온원 온도 230%:를 유지하였다. 검출모드로 정 량분석을 위하여 선택이온검색(selected ion monitoring, SIM)에서 각각의 정 량이온과 확인 이온을 선택하였다.
성능/효과
- 각각의 시료에 대해서 9종의 성장 호르몬제는 66- 112%의 회수율을 보였다. 회수율과 표준편차를 Table 3에 나타내었다.
- 기존의 분석법보다 더 작은 시료량을 사용하여 분석하였으나 유럽의 검출한계기준보다 월등한 결과를 보였고 전체 육류 식품 시료에 적용하여도 적절한 회수율과 표준편차를 보였다.
- 9종의 천연 및 합성 호르몬을 분획 하여 따로 분리 하지 않고 G 카트리지로 한꺼번에 용리시키기 위하여 메탄올로 용리시키는 조건을 사용하였다. 따라서 1차 정제 과정과 지질분리를 위한 G 칼럼의 전체 성장 호르몬제에 대한 동시 분리 및 정제 조건을 확립하였고 이 조건에서 전체 9종의 성장호르몬제들이 모두 분리 용출되었으며 95% 이상의 매우 좋은 회수율을 보였다. 극성물질 제거를 위한 아미노프로필 카트리지 (0.
- 냉동지질제거 실험과 함께 여과 후 남은 육류시료를 헥산 15 mL로 2회 추출하여 용액에 남은 지질을 다시 제거하였다. 따라서 무게 분석법으로 확인한 최종적인 지질의 제거율은 평균 97.1%로 확인되었다.
- 않고 동시에 분석이 가능하다. 또한 액-액 주줄 법을 고체상추출법으로 대체하여 지질제거 용매인 헥산에 의해 유실되는 지용성 스테로이드인 progesterone 등의 회수율을 증가시킬 수 있었으며, 전체 분석 시간도 줄일 수 있었다. 본 연구팀은 기존의 기기분석 방법을 사용하면서 전처리 방법으로 냉동 지질 여과법을 사용하고 최적의 유도체화방법과 동위원소 표지된 내부표준물질을 사용하여 목표검출한계를 낮출 수 있었다.
- 본 연구팀은 기존의 기기분석 방법을 사용하면서 전처리 방법으로 냉동 지질 여과법을 사용하고 최적의 유도체화방법과 동위원소 표지된 내부표준물질을 사용하여 목표검출한계를 낮출 수 있었다. 목표 검출한계 내에서 유럽의 공인 방법보다 사용 시료무게를 줄여서 사용함으로써 새로운 분석 방법에 의해 시약과 시간을 절약하였다. 정제과정을 한 단계 줄임으로서 쉽고 빠른 분석조건을 찾았으며 전체적인 실험의 검출한계나 재현성 등에서 매우 우수한 결과를 보였다.
- 국내산 돼지고기에서는 8건이 검출되었다. 본 연구에서 검출된 progesterone의 평균농도는 국내산 우육 시료에서 검출된 시료만의 경우 4.30 ㎍/kg, 수입 우의 경우 2.38 μg/kg의 평균농도를 보였다. 또한 검출량과 검출빈도가 높은 한우 시료에서 측정된 농도 범위는 0.
- 본 연구에서 확립된 분석법을 이용하여 총 150건에대 한 모니터 링 결과 합성호르몬은 한 건도 검출되지 않았고, 천연호르몬으로는 progesteronee 57건이 검출되었고, epitestosteronee 한 건 검출되었다. 검출된 농도를 감안하여 볼 때 내인성으로 존재하는 정도로 판단되 어진다.
- 전체 시료에서 합성호르몬인 DES와 zeranol 그리고 estrogen류는 전혀 검출되지 않았다. 17&-Estradiole 내인성으로 생성되며 일부 동물에서 매우 낮은 수준으로 발견될 수 있다.
- 정제과정을 한 단계 줄임으로서 쉽고 빠른 분석조건을 찾았으며 전체적인 실험의 검출한계나 재현성 등에서 매우 우수한 결과를 보였다. 전체적으로 소모되는 유해 시약의 사용량을 줄였으며, 인구인력의 노력과 시간을 절감하여 다량분석의 가능성을 제시하였다. 따라서 소고기이외에 돼지고기, 내장 등 일반적인 가식 부위에 대한 전체적인 전처리 방법 및 분석법이 확립되었다.
- 목표 검출한계 내에서 유럽의 공인 방법보다 사용 시료무게를 줄여서 사용함으로써 새로운 분석 방법에 의해 시약과 시간을 절약하였다. 정제과정을 한 단계 줄임으로서 쉽고 빠른 분석조건을 찾았으며 전체적인 실험의 검출한계나 재현성 등에서 매우 우수한 결과를 보였다. 전체적으로 소모되는 유해 시약의 사용량을 줄였으며, 인구인력의 노력과 시간을 절감하여 다량분석의 가능성을 제시하였다.
후속연구
- 추후 실시된 3중수소로 표지된 17|3-estradiol의 주입실험으로부터도 근육과 지방조직에서 주요 잔류물은 17fJ-estradiol와 estrone으로 알려 졌으며, 17a-estradiol 은 소량 존재함이 다시 확인되었다.16 이에 반하여 신장과 간 조직에서는 free steroid와 glucuronic-과 glycoside conjugates를 통합하여 17a-estradiol이 주대사체이고 17fJ-estradiol는 소량 존재한다.
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