인간이 서로 간의 의사소통을 위해 언어를 사용하듯이, 세균의 경우도 외부 환경 변화를 신속히 감지하여 서로 효과적으로 대응하기 위해서 주변 세포들과 소통할 수 있는 세균만의 독특한 화학적 언어를 사용하는 것으로 알려져 있다. 특히, 일정 세포 농도에 도달했을 때 자체적으로 생산된 화학적 신호를 통해 개체 수를 인지하고 그에 따라 특정 유전자의 발현을 동시에 조절하는 quorum sensing (QS) 기작은 다양한 세균 종들에서 광범위하게 존재한다. 본 연구는 다양한 천연물 추출물들을 대상으로 QS 저해 활성을 확인하였는데 QS 지시균주인 Agrobacterium tumefaciens NT1과 화학적으로 합성한 QS autoinducers을 사용한 bioassay를 수행하였다. 그 결과 양배추, 파, 양파의 추출물들에서 QS 저해 활성을 확인하였고, recycling preparative HPLC (prep-HPLC)를 통한 정제 과정을 통해, 83분 지점의 peak에 해당하는 성분들이 공통으로 QS 저해 활성을 가지고 있음을 확인하였다. 따라서 그 QS 저해 성분을 QSI-83으로 지정하고 thin layer chromatography (TLC)를 통해 P. syringae pv. tabaci의 autoinducers 합성을 저해하는 활성을 가지고 있음을 확인하였다. 또한 열에 대한 안정성과 세균 생장에서의 영향을 조사하였는데, 그 결과 QSI-83은 열에 안정하며 세균의 생장에는 영향을 끼치지 않는 물질임을 확인하였다. 따라서 우리는 천연물로부터 분리된 새로운 성분이 QS 저해제로서 이용될 수 있음을 제안한다.
인간이 서로 간의 의사소통을 위해 언어를 사용하듯이, 세균의 경우도 외부 환경 변화를 신속히 감지하여 서로 효과적으로 대응하기 위해서 주변 세포들과 소통할 수 있는 세균만의 독특한 화학적 언어를 사용하는 것으로 알려져 있다. 특히, 일정 세포 농도에 도달했을 때 자체적으로 생산된 화학적 신호를 통해 개체 수를 인지하고 그에 따라 특정 유전자의 발현을 동시에 조절하는 quorum sensing (QS) 기작은 다양한 세균 종들에서 광범위하게 존재한다. 본 연구는 다양한 천연물 추출물들을 대상으로 QS 저해 활성을 확인하였는데 QS 지시균주인 Agrobacterium tumefaciens NT1과 화학적으로 합성한 QS autoinducers을 사용한 bioassay를 수행하였다. 그 결과 양배추, 파, 양파의 추출물들에서 QS 저해 활성을 확인하였고, recycling preparative HPLC (prep-HPLC)를 통한 정제 과정을 통해, 83분 지점의 peak에 해당하는 성분들이 공통으로 QS 저해 활성을 가지고 있음을 확인하였다. 따라서 그 QS 저해 성분을 QSI-83으로 지정하고 thin layer chromatography (TLC)를 통해 P. syringae pv. tabaci의 autoinducers 합성을 저해하는 활성을 가지고 있음을 확인하였다. 또한 열에 대한 안정성과 세균 생장에서의 영향을 조사하였는데, 그 결과 QSI-83은 열에 안정하며 세균의 생장에는 영향을 끼치지 않는 물질임을 확인하였다. 따라서 우리는 천연물로부터 분리된 새로운 성분이 QS 저해제로서 이용될 수 있음을 제안한다.
The quorum sensing (QS) regulatory network has been the subject of extensive studies during recent years and has also attracted a lot of attention because it both positively and negatively regulates various putative virulence factors, although initially considered to be a specialized system of Vibri...
The quorum sensing (QS) regulatory network has been the subject of extensive studies during recent years and has also attracted a lot of attention because it both positively and negatively regulates various putative virulence factors, although initially considered to be a specialized system of Vibrio fischeri and related species. In this study, to identify the novel materials which inhibit QS system of microorganisms, extracts of eighteen natural products were tested by bioassay using N-(3-oxohexanoyl)-$_L$-homoserine lactone and N-(3-oxooctanoyl)-$_L$-homoserine lactone synthesized in this experiment and an Agrobacterium tumefaciens NT1 biosensor strain containing a traI::lacZ fusion. The result indicated that the extracts of cabbage, leek, and onion exhibited the QS inhibition activity. Thus, materials contained in the extracts were isolated via recycling preparative HPLC and were purified via a JAIGEL-LS255 column. The common fraction corresponding to a peak of the 83 min point of them quenched the quorum sensing of A. tumefaciens NT1 biosensor strain in ABMM containing X-gal and was designated quorum sensing inhibitor-83 min (QSI-83). The QSI-83 exhibited the heat stability and did not inhibit the growth of A. tumefaciens NTl. Furthermore, thin layer chromatography (TLC) results suggested that these novel materials may be antagonists of N-acyl homoserine lactone or may inhibit the QS autoinducer synthesis by Pseudomonas syringae pv. tabaci.
The quorum sensing (QS) regulatory network has been the subject of extensive studies during recent years and has also attracted a lot of attention because it both positively and negatively regulates various putative virulence factors, although initially considered to be a specialized system of Vibrio fischeri and related species. In this study, to identify the novel materials which inhibit QS system of microorganisms, extracts of eighteen natural products were tested by bioassay using N-(3-oxohexanoyl)-$_L$-homoserine lactone and N-(3-oxooctanoyl)-$_L$-homoserine lactone synthesized in this experiment and an Agrobacterium tumefaciens NT1 biosensor strain containing a traI::lacZ fusion. The result indicated that the extracts of cabbage, leek, and onion exhibited the QS inhibition activity. Thus, materials contained in the extracts were isolated via recycling preparative HPLC and were purified via a JAIGEL-LS255 column. The common fraction corresponding to a peak of the 83 min point of them quenched the quorum sensing of A. tumefaciens NT1 biosensor strain in ABMM containing X-gal and was designated quorum sensing inhibitor-83 min (QSI-83). The QSI-83 exhibited the heat stability and did not inhibit the growth of A. tumefaciens NTl. Furthermore, thin layer chromatography (TLC) results suggested that these novel materials may be antagonists of N-acyl homoserine lactone or may inhibit the QS autoinducer synthesis by Pseudomonas syringae pv. tabaci.
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문제 정의
tubdci의 QS autoinducers 생산의 저해는 결국 병원성 제어로 연결될 수 있다. 따라서 QSL83어 식물병원균의 QS autoinducer 합성에 어떠한 영향을 끼치는지 알아보고자 하였다. R syringae pv.
그러나 furanone 유사체는 구조적인 불안정성과 독성을 가지고 있다는 단점 때문에 이를 대체 할 수 있는 새로운 물질의 탐색이 요구된다[16]. 따라서 본 연구는 세균의 QS 시스템을 제어하기 위한 새로운 QS 저해 물질의 탐색을 목표로 하였다. 이를 위해 세균 감염성 질환에 유효하다고 보고되고 있거나 건강식품의 원료로 이용되는 18가지의 천연물을 대상으로 QS 저해 활성을 확인하였다.
이번 연구에서 세균의 QS 기능을 제어하는 활성을 가지는 새로운 QS 저해제를 천연물로부터 얻었다. 세균성 질병에 대한 내성을 가진다고 알려져 있거나, 건강식품의 원료로 많이 이용되는 총 18가지 천연물을 대상으로 한 실험을 통해 양배추, 파, 양파가 QS 저 해 활성을 나타내는 성분을 함유하고 있음을 확인하였다.
제안 방법
2%, Solution A 5% (v/v), Solution B 5% (v/v))를 사용하여 30°C에서 배양하였다[14]. ABMM 배지 제조시 사용한 Solution A (K2HPO4 6%, NaH2PO4 2%) 와 solution B (NH4(기 2%, MgSO4 . 7HQ 0.6%, KC1 0.3%, CaCl2 0.02%, FeSO4 ・ 7HQ 0.005%)는 각각 고압멸균(110°C 20 min) 후에 첨가하였다.
Prep-HPLC를 사용하여 QS 저해 활성이 확인된 양배추, 파, 양파의 추출물들을 분획하였다. Prep-HPLC 결과(Fig.
QS 저해 효과를 보이는 추출물들에서 QS 저해제 후보물질을 분리하기 위해 recycling preparative HPLC LC-918R (JAI, Japan)과 JAIGEL-LS255 column (JAI, Japan)을 통과 시켜 분리된 peaks를 얻었고, 각 peaks에 해당하는 물질들을 RI-50 detector (JAIZ Japan)를 사용하여 각각 분획 수집하였다. 분획 수집물들은 동결건조하여 분말화하였다.
QS 저해제의 열 안정성 확인을 위해 시료들을 고압멸균 (121°CZ 15분)하여 농도 별로 bioassay에 적용하였다.
QSI-83의 열안정성을 확인하기 위해 그 시료를 고압 멸균하여 bioassay에 적용하였다. 그 결과(Fig.
R syringae pv. t&baci를 QSI-83이 첨가된 배양액에 접종하고 30°C에서 24시간동안 배양한 후, AHLs을 추출하여 TLC를 수행하였다. Fig.
세균성 질병에 대한 내성을 가진다고 알려져 있거나, 건강식품의 원료로 많이 이용되는 총 18가지 천연물을 대상으로 한 실험을 통해 양배추, 파, 양파가 QS 저 해 활성을 나타내는 성분을 함유하고 있음을 확인하였다. 그 성분을 prep-HPLC와 column 정제를 통해 분리하였고 QSI-83으로 지정하였다. 이 QSI-83은 JAI prep-HPLC library 상에는 존재하지 않는 신물질로써 열 안정성이 높은 물질임을 확인할 수 있었다.
확인흐!. 기 위해 QS 지시균주인 A. tumefuciens NT1 과 합성된 QS autoinducer가 혼합된 ABMM 배지(50 gg/ml X-gal 포함) 에각 추출물들을 추가하고 30°C에서 24시간 동안 배양하였다. 그 결과(Fig.
tabaci의 QS을 저해하였음을 확인하였다. 따라서 83분 지점의 peak에 해당하는 분획 수집물들을 quorum sensing inhibitor-83 min (QSI-83)으로 이름 붙였으며, 이를 새로운 QS 저해제로 제안한다.
tumefaciens NT1 은 traGdacZ gene을 가지고 있어서 거!] 지 내에 universal AHLs 존재 시 QS을 통해 lacZ gene을 발현할 수 있다[4]. 따라서 천연물 추출물들을 A. tumefaciens NT1 과 합성 된 AHLs 그리고 X-gal을 포함하는 ABMM 배지 200㎕에 추가하여 24시간 동안 30°C에서 배양한 후 QS 정도를 발색 수준으로 확인하였다.
6A). 또한 새로운 QS 저해제들이 P. syringae pv, tabaci의 생장에 영향을 미치는지를 확인하기 위하여 배양액에 첨가한 후 배양하는 동안 생장 곡선을 작성하였다(Fig. 6B). 그 결과 QSI-83은 AHLs을 분해하지 않았으며, 세포 생장에 어떠한 효과도 미치지 않았다.
2) 는 세 가지 추출물들이 각기 다른 성분들의 혼합물임을 나타내고 있으며, 83분 지점에서 가장 큰 peak로 나타나는 성분을 동일하게 가지고 있었다. 수집된 분획물들 중 어떤 것이 QS 저해 활성을 가지는지 확인하기 위해 각 peak 별 분획물들을 QS bioassay 실험에 적용하였다. 그 결과(Fig.
이는 QSL83이 QS autoinducers의 합성을 저해하는 활성을 가짐을 확인해 주고 있다. 이러한 TLC 상 QS auto inducers의 부재가 QSI-83에 의한 합성된 AHLs의 분해에 의한 결과인지 확인하기 위해 추출된 AHLs과 QSL83을 동량으로 섞어서 30°C에서 24시간 동안 반응시킨 다음 TLC를 거쳐 bioassay를 수행하였다(Fig. 6A). 또한 새로운 QS 저해제들이 P.
따라서 본 연구는 세균의 QS 시스템을 제어하기 위한 새로운 QS 저해 물질의 탐색을 목표로 하였다. 이를 위해 세균 감염성 질환에 유효하다고 보고되고 있거나 건강식품의 원료로 이용되는 18가지의 천연물을 대상으로 QS 저해 활성을 확인하였다.
4) 50 pl 이상이 추가되었을 때 QS 저해 활성이 유지됨을 확인할 수 있었으므로 이는 QSI-83이 비교적 열에 안정함을 알 수 있었다. 한편, bioassay 실험의 결과가 QSI-83이 가지는 지시균주의 생장 저해 효과 때문인지를 확인하기 위하여 bioassay 실험 후에 배양액 내의 A. tumefaciens NT1 의 생균수를 측정하였다. 그 결과, QSI-83이 지시균주의 생장을 저해하지 않았다(data not shown).
대상 데이터
18가지 천연물(양파, 고추장, 된장, 마늘, 오징어, 미 역, 양배추, 무, 당근, 바나나, 파래, 파, 깻잎 상추, 마른 새우, 고추, 브로콜리, 오미자)은 3차 증류수로 세 번 세척하여 준비하였다. 각각의 천연물 50 g에 150 ml의 3차 증류수를 추가하여 가정용 믹서 (mixer)로 10분 동안 분쇄한 다음 48시간 동안 정치시켰다.
syringae pv. tabaci (ATCC 11528) 균주는 King's B 배지 (Peptone 2%, MgSO4 . 7HQ 0.15%, K2HPO4 0.15%, Glycerol 1%)를 사용하여 30°C에서 배양하였고[9], QS을 확인하기 위해 사용된 지시 균주인 Agrobacterium tumefaciens NT1 은 ABMM 7](Mannitol 0.2%, Solution A 5% (v/v), Solution B 5% (v/v))를 사용하여 30°C에서 배양하였다[14]. ABMM 배지 제조시 사용한 Solution A (K2HPO4 6%, NaH2PO4 2%) 와 solution B (NH4(기 2%, MgSO4 .
여과액을 동결건조하여 분말화 시킨 후 3차 증류수를 추가하여 5 ml로 녹여낸 다음 bioassay 시료로 사용하였다. 이 중 QS 저해 기능이 알려진 마늘은 실험 대조군으로 사용하였다[3].
시료는 Cis reverse phase TLC plate (Merck, Germany) 에 1 ㎕를 점적하여 건조시킨 후 전개하였다. 전개 용매는 메탄올과 물을 60:40 (v/v)으로 혼합하여 사용하였다. 미리 준비한 1.
이론/모형
tabad 균주를 각각 QS 저해능이 나타나는 농도의 QSI-83과 함께 진탕배양(200 rpm) 하였다. 시간대별로 얻은 배양액은 평판계수법을 사용하여 생균수를 측정하였다.
성능/효과
양파의 추출물들을 분획하였다. Prep-HPLC 결과(Fig. 2) 는 세 가지 추출물들이 각기 다른 성분들의 혼합물임을 나타내고 있으며, 83분 지점에서 가장 큰 peak로 나타나는 성분을 동일하게 가지고 있었다. 수집된 분획물들 중 어떤 것이 QS 저해 활성을 가지는지 확인하기 위해 각 peak 별 분획물들을 QS bioassay 실험에 적용하였다.
6B). 그 결과 QSI-83은 AHLs을 분해하지 않았으며, 세포 생장에 어떠한 효과도 미치지 않았다.
tumefuciens NT1 과 합성된 QS autoinducer가 혼합된 ABMM 배지(50 gg/ml X-gal 포함) 에각 추출물들을 추가하고 30°C에서 24시간 동안 배양하였다. 그 결과(Fig. 1), 기존에 QS 저해 활성이 알려진 마늘은 X-gal 분해에 의한 색 변화를 나타내지 않았고 또한 양배추, 파, 양파의 추출물에서도 색 변화를 나타내지 않았다. 따라서 이들 천연물 추출물들이 QS 저해 활성을 가진다고 판단된다.
수집된 분획물들 중 어떤 것이 QS 저해 활성을 가지는지 확인하기 위해 각 peak 별 분획물들을 QS bioassay 실험에 적용하였다. 그 결과(Fig. 3), 각 추출물들의 83분 지점의 peak에 해당하는 분획 수집물들이 동일하게 P. syringae pv. tabaci의 QS을 저해하였음을 확인하였다.
bioassay에 적용하였다. 그 결과(Fig. 4) 50 pl 이상이 추가되었을 때 QS 저해 활성이 유지됨을 확인할 수 있었으므로 이는 QSI-83이 비교적 열에 안정함을 알 수 있었다. 한편, bioassay 실험의 결과가 QSI-83이 가지는 지시균주의 생장 저해 효과 때문인지를 확인하기 위하여 bioassay 실험 후에 배양액 내의 A.
tumefaciens NT1 의 생균수를 측정하였다. 그 결과, QSI-83이 지시균주의 생장을 저해하지 않았다(data not shown).
QS 저해제를 천연물로부터 얻었다. 세균성 질병에 대한 내성을 가진다고 알려져 있거나, 건강식품의 원료로 많이 이용되는 총 18가지 천연물을 대상으로 한 실험을 통해 양배추, 파, 양파가 QS 저 해 활성을 나타내는 성분을 함유하고 있음을 확인하였다. 그 성분을 prep-HPLC와 column 정제를 통해 분리하였고 QSI-83으로 지정하였다.
그 성분을 prep-HPLC와 column 정제를 통해 분리하였고 QSI-83으로 지정하였다. 이 QSI-83은 JAI prep-HPLC library 상에는 존재하지 않는 신물질로써 열 안정성이 높은 물질임을 확인할 수 있었다. 그리고 QSI-83 은 지시균주와 식물 병원균인 P.
한편 QSI-83을 AHLs과 동량으로 혼합하고 상온에서 24시간 동안 반응시 킨 후 TLC를 통해 확인한 결과 AHLs을 분해하는 활성을 가지는 acylase, lactonase 의 계열이 아님을 확인할 수 있었다. 이들 결과들을 종합하면 QSI-83 이 P. syringae pv. tabaci의 AHLs의 길항제 (antagonist)의 일종이거나 그것의 합성을 저해하는 저해제일 가능성이 높다.
ftibaci의 생장에 영향을 끼치지 않았다. 한편 QSI-83을 AHLs과 동량으로 혼합하고 상온에서 24시간 동안 반응시 킨 후 TLC를 통해 확인한 결과 AHLs을 분해하는 활성을 가지는 acylase, lactonase 의 계열이 아님을 확인할 수 있었다. 이들 결과들을 종합하면 QSI-83 이 P.
후속연구
이러한 천연물을 이용한 약제 개발은 무분별한 항생제사용을 막을 수 있으며, QS 저해제를 이용하여 세균의 bio film 형성에 의한 물때, 치석 등 여러 가지 문제를 해결하는데 도움이 될 것으로 생각된다. 따라서 LC-MS, NMR 등을 통한 정확한 구조 분석이 필요하며 이들 성분의 화학적 합성물이 동일한 효과를 가지는지를 확인하는 연구가 필요하다.
tabaci의 AHLs의 길항제 (antagonist)의 일종이거나 그것의 합성을 저해하는 저해제일 가능성이 높다. 이러한 천연물을 이용한 약제 개발은 무분별한 항생제사용을 막을 수 있으며, QS 저해제를 이용하여 세균의 bio film 형성에 의한 물때, 치석 등 여러 가지 문제를 해결하는데 도움이 될 것으로 생각된다. 따라서 LC-MS, NMR 등을 통한 정확한 구조 분석이 필요하며 이들 성분의 화학적 합성물이 동일한 효과를 가지는지를 확인하는 연구가 필요하다.
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