인돌 (Indol-3-Carbinol)이 인체대장암세포 HT-29 세포의 투과성 밀착결합조절과 세포 침윤성 억제에 미치는 영향
Indol-3-Carbinol Regulated Tight Junction Permeability and Associated-Protein Level and Suppressed Cell Invasion in Human Colon Cancer Cell Line, HT-29
본 실험은 인돌의 인체 대장암세포의 경과 및 전이억제와 TJ 활성 조절에 미치는 영향을 알아보기 위해 실험하였다. 인돌은 십자화 야채류인 양배추, 컬리플라워, 브로클리 등에 존재하는 glucosinolate, glucobrassicin의 대사산물 이다. 본 연구의 결과는 인돌이 대장암 세포 HT-29에서 농도 의존적으로 세포증식 저해를 나타내었다. 상처회복 실험을 통한 세포이동성과 세포 침윤성 실험결과 인돌이 암세포의 이동과 침윤성을 억제하였고 투과성상피세포의 전기적 저항성 측정치는 인돌 처리 세포에서 증가하였다. HT-29 세포에서 과발현을 나타내는 밀착결합 단백질인 claudin-1, claudin-5 발현은 인돌 처리로 유전자의 전사수준과 단백질 수준에서 유의적인 감소를 나타내었다. 이상의 결과에서 인돌이 HT-29 세포의 밀착결합과 그 구성 단백질 중 claudin 발현 현상을 회복시키므로 암 경과와 전이 억제를 나타내었다. 결론적으로, 천연 항암화합물인 인돌은 대장암 세포 HT-29에서 밀착결합 단백질인 claudin-1, -5을 억제하여 밀착결합을 활성화하므로 암 진행과 전이를 억제할 수 있는 인돌에 의한 새로운 기전을 보고합니다.
본 실험은 인돌의 인체 대장암세포의 경과 및 전이억제와 TJ 활성 조절에 미치는 영향을 알아보기 위해 실험하였다. 인돌은 십자화 야채류인 양배추, 컬리플라워, 브로클리 등에 존재하는 glucosinolate, glucobrassicin의 대사산물 이다. 본 연구의 결과는 인돌이 대장암 세포 HT-29에서 농도 의존적으로 세포증식 저해를 나타내었다. 상처회복 실험을 통한 세포이동성과 세포 침윤성 실험결과 인돌이 암세포의 이동과 침윤성을 억제하였고 투과성상피세포의 전기적 저항성 측정치는 인돌 처리 세포에서 증가하였다. HT-29 세포에서 과발현을 나타내는 밀착결합 단백질인 claudin-1, claudin-5 발현은 인돌 처리로 유전자의 전사수준과 단백질 수준에서 유의적인 감소를 나타내었다. 이상의 결과에서 인돌이 HT-29 세포의 밀착결합과 그 구성 단백질 중 claudin 발현 현상을 회복시키므로 암 경과와 전이 억제를 나타내었다. 결론적으로, 천연 항암화합물인 인돌은 대장암 세포 HT-29에서 밀착결합 단백질인 claudin-1, -5을 억제하여 밀착결합을 활성화하므로 암 진행과 전이를 억제할 수 있는 인돌에 의한 새로운 기전을 보고합니다.
To determine whether indol-3-carbinol (BC, $C_9H_9NO$), an autolysis product of a glucosinolate and a glucobrassicin in vegetables, regulated tight junction proteins (TJ) and suppressed cell invasion in colon cancer cells, this experiment was performed. Our results indicate that I3C inhib...
To determine whether indol-3-carbinol (BC, $C_9H_9NO$), an autolysis product of a glucosinolate and a glucobrassicin in vegetables, regulated tight junction proteins (TJ) and suppressed cell invasion in colon cancer cells, this experiment was performed. Our results indicate that I3C inhibit cell growth of HT-29 cells in a dose (0, 50, $100{\mu}M$) and time (0, 24 and 48h) dependent manner. Using the wound healing and matrigel invasion study, respectively, BC inhibits the cell motility and invasion of the ovarian cancer cell line. The TEER values were increased in HT-29 cells grown in transwells treated with BC, reversely, paracellular permeability was decreased in those of condition. Claudin-1, claudin-5, ZO-1 and occuldin have been shown to be positively expressed in HT-29 coloncancer cells. I3C occurs concurrently with a significant decrease in the levels of those of proteins in HT-29 cells. But E-cadherin level in the HT-29 was increased by I3C. The reduction of claudin-1 and claudin-5 protein levels occurred post-transcriptionaly since their mRNA levels are no difference by I3C. Therefore, our results suggest that I3C may be expected to inhibit cancer metastasis and invasion by tighten the cell junction and restoring tight junction in colon cancer cell line, HT-29.
To determine whether indol-3-carbinol (BC, $C_9H_9NO$), an autolysis product of a glucosinolate and a glucobrassicin in vegetables, regulated tight junction proteins (TJ) and suppressed cell invasion in colon cancer cells, this experiment was performed. Our results indicate that I3C inhibit cell growth of HT-29 cells in a dose (0, 50, $100{\mu}M$) and time (0, 24 and 48h) dependent manner. Using the wound healing and matrigel invasion study, respectively, BC inhibits the cell motility and invasion of the ovarian cancer cell line. The TEER values were increased in HT-29 cells grown in transwells treated with BC, reversely, paracellular permeability was decreased in those of condition. Claudin-1, claudin-5, ZO-1 and occuldin have been shown to be positively expressed in HT-29 coloncancer cells. I3C occurs concurrently with a significant decrease in the levels of those of proteins in HT-29 cells. But E-cadherin level in the HT-29 was increased by I3C. The reduction of claudin-1 and claudin-5 protein levels occurred post-transcriptionaly since their mRNA levels are no difference by I3C. Therefore, our results suggest that I3C may be expected to inhibit cancer metastasis and invasion by tighten the cell junction and restoring tight junction in colon cancer cell line, HT-29.
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문제 정의
밀착결합 복합체에 claudin 존재의 형태가 투과성상피세포의 전기적 저항성과 세포 투과성을 결정한다고 보고 되어져 있다.那 따라서 본 실험은 대장암세포 HT-29에서 인돌이 밀착결합의 총수 또는 단백질 구성을 조절하는지를 알아보기 위해 밀착결합 관련 단백질의 mRNA 수준과 단백질 수준을 알아보았다. 그 결과 (Fig.
이상의 결과에서 인돌이 HT-29 세포의 밀착결합과 그 구성 단백질 중 claudin 발현 현상을 회복시키므로 암 경과와 전이 억제를 나타내었다. 결론적으로, 천연 항암화합물인 인돌은 대장암 세포 HT-29 에서 밀착결합 단백질인 claudin-1, -5을억제하여 밀착결합을 활성화하므로 암진행과 전이를 억제할 수 있는 인돌에 의한 새로운 기전을 보고합니다.
그러므로 본 연구는 인체 대장암 세포인 HT-29 cell에서 I3C의 항암작용 기전을 연구하기 위하여 I3C이 대장암세포에서 TJ 형성을 유도하여 세포를 가로지르는 투과도를 억제하는지 세포의 이동성, 침윤성 그리고 claudin-1, -5, ZO-1, occludin, E-cadherin 단백질 발현에 미치는 영향을 알아보고자 실험하였다.
본 실험은 세포 운동성 (motility) 을 측정하는 실험이다. 세포가 배양되어있는 배양접시에 1 ml 팁으로 상처를 만들어 생긴 빈 공간으로 세포가 이동하여 채우는 것을 시간 의존적으로 관찰하는 실험이다.
본 실험은 인돌의 인체 대장암세포의 경과 및 전이 억제와 TJ 활성 조절에 미치는 영향을 알아보기 위해 실험하였다. 인돌은 십자화 야채류인 양배추, 컬리플라워, 브로클리 등에 존재하는 glucosinolate, glucobrassicin의 대사산물 이다.
실험이다. 세포가 배양되어있는 배양접시에 1 ml 팁으로 상처를 만들어 생긴 빈 공간으로 세포가 이동하여 채우는 것을 시간 의존적으로 관찰하는 실험이다. 30-mm 세포배양 접시에 20 淑ml rat tail collagen (BD Biosciences, Bedford, MA, USA)으로 코팅하여 2 x IO, cells/ml HT-29 세포배양 후 DMSO, I3C를 적정농도로 12시간 선 처리 하여 1ml 팁으로 상처를 만들었다.
가설 설정
인돌 처리 농도 의존적으로 대조세포에 비해 세포의 이동성이 현저히 억제되는 현상을 보여주었다. 본 실험에서 인돌의 세포이동성 억제에 영향을 미치는 이유는 세포의 밀착결합 형성의 부조 또는 파괴가 그 원인으로 가정하였다. 따라서 다음 실험으로 밀착결합 형성을 측정하는 실험을 하였다.
또한 결과로 나타내지는 않았지만 암세포의 투과성상피세포의 전기적 저항성 증가에 대한 인돌의 영향을 재검정 하기 위해서 세포에 인돌을 처리하여 72시간 배양 후 배지에서 인돌을 제거하여 투과성상피세포의 전기적 저항성을 측정한 결과 증가된 투과성상피세포의 전기적 저항성은 24시간 유지하다가 서서히 원래 수준으로 되돌아갔다. 이러한 결과는 인돌에 의한 투과성상피세포의 전기적 저항성 증가는 안정적으로 세포변화에 관여하고 그 변화는 가역적이다 는 것을 제안한다. 또 다른 실험으로 혹시 증가된 투과성 상피 세포의 전기적 저항성이 세포증식으로 인한 증가인지를 확인하기 위해 72시간 동안 세포를 배양한 후 MTT를 실시한 결과 24시간 배양하여 실시한 MTT 결과와 동일한 결과를 얻어 본 실험의 투과성상피세포의 전기적 저항성 증가가 세포증식에 의한 것이 아니라 인돌의 영향임을 확인하였다.
제안 방법
이와 같은 결과는 대장암 세포에 처리한 인돌이 밀착결합 활성에 영향을 주어 세포의 결합 조절 효과에 연관성이 있음을 알 수 있었다. 따라서 다음 실험으로 증가된 투과성 상피 세포의 전기적 저항성을 확인하기 위해 mannitol 에 동위원소를 표지한 ["ClD-mannitol를 이용하여 세포막을 통과한 mannitol을 감마선 측정기로 세포 투과성을 확인하는 실험을 하였다.
세포가 배양되어있는 배양접시에 1 ml 팁으로 상처를 만들어 생긴 빈 공간으로 세포가 이동하여 채우는 것을 시간 의존적으로 관찰하는 실험이다. 30-mm 세포배양 접시에 20 淑ml rat tail collagen (BD Biosciences, Bedford, MA, USA)으로 코팅하여 2 x IO, cells/ml HT-29 세포배양 후 DMSO, I3C를 적정농도로 12시간 선 처리 하여 1ml 팁으로 상처를 만들었다. PBS로 세포 찌거기를 제거하고 혈청 free 배지 (세포의 증식에 의한 이동성을 막기 위해서) 에 DMSO, 인돌을 각각 처리하여 시간 의존적으로 48시간 동안 관찰하여 상처난 영역으로 세포이동을 현미경으로 관찰하여 사진을 찍는다.
DMSO 및 인돌이 처리된 배지에서 자란 암세포들을 PBS 로 씻어내고 0.05% trypsin-EDTA로 부유시킨 다음 원심분리 하여 세포를 모았다. 이렇게 모아진 세포에 적당량의 NP-40 lysis buffer를 첨가하여 4 °C 에서 30분간 반응시킨 후, 14, 000 rpm으로 30분간 원심분리 하여 그 상층액을 취하였다 상층 액의 단백질 농도를 Bio-Rad 단백질 정량시약 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 과 그 사용방법에 따라 정량한 다음 동량의 샘플버퍼를 섞어서 시료를 만들었다.
30-mm 세포배양 접시에 20 淑ml rat tail collagen (BD Biosciences, Bedford, MA, USA)으로 코팅하여 2 x IO, cells/ml HT-29 세포배양 후 DMSO, I3C를 적정농도로 12시간 선 처리 하여 1ml 팁으로 상처를 만들었다. PBS로 세포 찌거기를 제거하고 혈청 free 배지 (세포의 증식에 의한 이동성을 막기 위해서) 에 DMSO, 인돌을 각각 처리하여 시간 의존적으로 48시간 동안 관찰하여 상처난 영역으로 세포이동을 현미경으로 관찰하여 사진을 찍는다.
5 mm dNTP, 10X buffer, DEPC water, premixed primer (GenoTech, Korea) 및 Taq DNA polymerase를 넣고 Mastercycler gradient (Eppendorf, Hamburg, Germany)를 이용하여 polymerase chain reac tion (PCR) 방법으로 증폭하였다. RT-PCR을 이용하여 분석을 시도한 유전자의 종류는 Table 1에 나타난 바와 같으며, 이때 비교 유전자인 glycealdehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) 유전자를 포함하여 세포내 대조 유전자로 사용하였다. 각 PCR 산물들의 양적 차이를 확인하기 위하예X TAE buffer로 1% agarose gel을 만들고 well 당 각각의 primer에 해당하는 PCR 산물에 DNA gel loading 용액 (5x, Quality Biological Inc.
Transwell plate에 matrigel (BD, Biosciences, Bed ford, MA, USA)을 코팅하여 세포의 침윤성을 실험하였다. 2 X 105 cells/ml 로 HT-29 세포를 배양하여 각각 DMSO, 인돌을 처리하였다.
Transwell에서 배지를 모두 제거하고 미리 데워둔 PBS (Ca++ 포함된 것 반드시 사용)로 2번 세척하고 시간 의존적으로 [14C] D-mannitol (Sigma)를 apical 영역에 첨가하고 계속해서 일정한 곡도로 교반시켜 세포를 통과하는 동위원소 양을 측정하였다. 세포막을 통과한 mannitol 을 LS 6500TA liquid scintillation counter (Beckman Coulter, Fullerton, CA)를 사용하여 측정하였다.
RT-PCR을 이용하여 분석을 시도한 유전자의 종류는 Table 1에 나타난 바와 같으며, 이때 비교 유전자인 glycealdehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) 유전자를 포함하여 세포내 대조 유전자로 사용하였다. 각 PCR 산물들의 양적 차이를 확인하기 위하예X TAE buffer로 1% agarose gel을 만들고 well 당 각각의 primer에 해당하는 PCR 산물에 DNA gel loading 용액 (5x, Quality Biological Inc.) 을 섞어서 loading 한 후 100 V 하에서 확인하여 Kodak Picture works' photo enhancer# 이용하여 사진 촬영 하였다.
MO, USA))를 처리하여 상온에서 1 시간 이상 또는 4°C에서 overnight 시킨 다음 PBS-T로 세척하고 처리된 1차 항체에 맞는 2차 항체를 사용하여 상온에서 1시간 정도 반응시켰다. 다시 PBS-T로 세척하고 enhanced chemilu- minoesence (ECL) 용액 (Amersham Life ScienceCorp. Arlington Heights, IL, USA)을 적용시킨 다음 암실에서 X-ray 필름에 감광시켜 특정단백질의 양을 분석하였다. Western blot을 위해 사용된 2차 항체로 사용된 peroxidase-labeld donkey anti-rabbbit 및 peroxidase-labeled sheep anti-mouse immunoglobulin은 amersham Life Science 에서 구입하였다.
4 mm pore size, Costar, Corning, NY) 에 2 x 105 cells/ml HT-29 세포를 처리하여 일정시간 배양하여 이때 세포막에 걸리는 전류의 전기 저항치를 측정하여 단층 세포의 integrity를 측정하였다. 다양한 농도의 인돌을 배양 세포에 48시간 처리하여 투과성상피세포의 전기적 저항성을 측정하여 세포 밀착결합과 세포를 가로지르는 투과성에 미치는 인돌의 영향을 평가하였다. 측정 시 4군데 각각 다른 영역을 측정하여 평균하여 사용 하였다.
이와 같은 결과는 대장암 세포에 인돌 처리시 인돌의 세포 밀착결합 형성에 영향을 미쳐 종양생성으로 증가된 세포를가로지는 투과성을 감소시킨다는 것을 확인 할 수 있었다. 다음 실험으로 이상의 결과들이 결과적으로 암의 사망률에 가장 영향을 많이 주는 암의 전이 억제에 영향을 미치는지 알아보기 위해 matrigel 침윤성 실험을 하였다.
따라서 인돌은 대장암세포 HT-29의 이동성과 침윤성을 유의적으로 억제함을 볼 수 있었다. 다음 실험은 세포 결합 (세포-세포 연결, 밀착결합)과 관련돤 단백질 발현을 알아보고 세포 전이 억제에 영향을 미치는지 검증해보기 위해 관련 단백질을 western blot으로 실험하였다.
1에서 나타난 바와 같이 HT-29 세포는 인돌처리 농도 의존적으로 세포의 증식이 유의적으로 억제되었으며, 특히 100 “M 이상의 농도에서 증식억제 효과는 약 70% 정도 보여 주었다. 따라서 모든 실험에서 인돌 농도는 세포의 증식 억제에 미치는 영향이 적은 50, 100 “M 농도로 처리하여 각각의 실험을 하였다.
분리된 RNA를 정량한 후 oligo dT primer와 AMV reverse transcriptase (RT) 를 이용하여 2 pg의 RNA에서 cDNA-f- 합성하였다. 만들어진 RT product (tem plate cDNA) 에 2.5 mm dNTP, 10X buffer, DEPC water, premixed primer (GenoTech, Korea) 및 Taq DNA polymerase를 넣고 Mastercycler gradient (Eppendorf, Hamburg, Germany)를 이용하여 polymerase chain reac tion (PCR) 방법으로 증폭하였다. RT-PCR을 이용하여 분석을 시도한 유전자의 종류는 Table 1에 나타난 바와 같으며, 이때 비교 유전자인 glycealdehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) 유전자를 포함하여 세포내 대조 유전자로 사용하였다.
2 X 105 cells/ml 로 HT-29 세포를 배양하여 각각 DMSO, 인돌을 처리하였다. 배양기 아래쪽에는 20% FBS 배지를 사용하였으며 인돌과 DMSO 처리 세포는 배양기 위쪽에 분주하여 무혈청 조건으로 37 °C CO2 배양기에서 24시간 배양한 후 배양기 위쪽의 안쪽을 생리식염수를 적신 면봉으로 닦아내고 헤마톡실린과 에이오신 Y (Sigma) 로 염색하였다. 슬라이드 글라스에 염색한 필터를 고정하여 현미경으로 matrigel에 침윤된 세포 수를 측정하였다.
본 실험은 12-well 폴리카본 막 배양기에 (1 cm2 surface area, 0.4 mm pore size, Costar, Corning, NY) 에 2 x 105 cells/ml HT-29 세포를 처리하여 일정시간 배양하여 이때 세포막에 걸리는 전류의 전기 저항치를 측정하여 단층 세포의 integrity를 측정하였다. 다양한 농도의 인돌을 배양 세포에 48시간 처리하여 투과성상피세포의 전기적 저항성을 측정하여 세포 밀착결합과 세포를 가로지르는 투과성에 미치는 인돌의 영향을 평가하였다.
본 연구에서는 인체 대장암 세포 HT-29 cell에 인돌을 처리하였을 때 밀착결합이 회복되어 세포의 투과성 상피 세포의 전기적 저항성의 증가를 시켜 세포를 가로지르는 투과성을 억제하였다 (Fig. 3, 4). 이러한 결과는 Dhawan 등:, 气도 대장암 세포에서 투과성상피세포의 전기적 저항성이 세포를 가로지르는 투과성과 역의 상관관계를 나타낸다고 보고하여 일치된 결과를 보였다.
Carlsbad, CA, USA)를 4°C에서 1시간 동안 처리하여 total RNA를 분리흐]였다. 분리된 RNA를 정량한 후 oligo dT primer와 AMV reverse transcriptase (RT) 를 이용하여 2 pg의 RNA에서 cDNA-f- 합성하였다. 만들어진 RT product (tem plate cDNA) 에 2.
이렇게 만든 동량의 단백질을 8-12% SDS 폴리아크릴아마이드 겔을 이용하여 전기영동으로 분리하였다. 분리된 단백질을 함유한 겔을 니트로셀룰로우즈 막 (Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA) 에 전이시킨 후, 10% 탈지분유를 함유한 PBS-T (0.1% Tween 20 in PBS)에 담구어 상온에서 2시간 정도 반응시켜 비 특이적인 단백질들에 대한 blocking을 실시하고 PBS-TS 15분 정도 세척하였다. 준비된 막에 1차 anticody (claudin-1, -5, ZO-l; Zymed, San Francisco, CA, USA), MMP-2, -9; Neo Markers, Fremont, CA, USA), -actin (Sigma, St.
Transwell에서 배지를 모두 제거하고 미리 데워둔 PBS (Ca++ 포함된 것 반드시 사용)로 2번 세척하고 시간 의존적으로 [14C] D-mannitol (Sigma)를 apical 영역에 첨가하고 계속해서 일정한 곡도로 교반시켜 세포를 통과하는 동위원소 양을 측정하였다. 세포막을 통과한 mannitol 을 LS 6500TA liquid scintillation counter (Beckman Coulter, Fullerton, CA)를 사용하여 측정하였다.
실험방법에서 언급한 바와 같이 세포 증식에 의한 세포 이동을 억제하기 위해서 무혈청 배지에서 실험하였다. 세포배양 접시에 피펫 팁으로 상처를 만들어 만든 공간에 농도별 인돌을 처리하여 48시간 동안 배양하면서 일정 시간 간격으로 현미경으로 관찰하고 사진을 찍었다 (Fig. 2). 인돌 처리 농도 의존적으로 대조세포에 비해 세포의 이동성이 현저히 억제되는 현상을 보여주었다.
배양기 아래쪽에는 20% FBS 배지를 사용하였으며 인돌과 DMSO 처리 세포는 배양기 위쪽에 분주하여 무혈청 조건으로 37 °C CO2 배양기에서 24시간 배양한 후 배양기 위쪽의 안쪽을 생리식염수를 적신 면봉으로 닦아내고 헤마톡실린과 에이오신 Y (Sigma) 로 염색하였다. 슬라이드 글라스에 염색한 필터를 고정하여 현미경으로 matrigel에 침윤된 세포 수를 측정하였다.
인돌 처리에 의한 대장암 세포 HT-29의 증식억제와 전이 억제의 연관성을 알아보기 위해 선행 실험으로 HT-29의 이동성에 미치는 인돌의 영향을 상처회복 방법을 이용한 세포 이동성을 실험하였다. 실험방법에서 언급한 바와 같이 세포 증식에 의한 세포 이동을 억제하기 위해서 무혈청 배지에서 실험하였다.
인체 대장암 세포의 증식억제에 미치는 인돌의 영향을 알아보기 위해 적정의 인돌을 24시간 동안 처리 후 MTT 를 실시하였다. Fig.
1% Tween 20 in PBS)에 담구어 상온에서 2시간 정도 반응시켜 비 특이적인 단백질들에 대한 blocking을 실시하고 PBS-TS 15분 정도 세척하였다. 준비된 막에 1차 anticody (claudin-1, -5, ZO-l; Zymed, San Francisco, CA, USA), MMP-2, -9; Neo Markers, Fremont, CA, USA), -actin (Sigma, St. Louis. MO, USA))를 처리하여 상온에서 1 시간 이상 또는 4°C에서 overnight 시킨 다음 PBS-T로 세척하고 처리된 1차 항체에 맞는 2차 항체를 사용하여 상온에서 1시간 정도 반응시켰다. 다시 PBS-T로 세척하고 enhanced chemilu- minoesence (ECL) 용액 (Amersham Life ScienceCorp.
다양한 농도의 인돌을 배양 세포에 48시간 처리하여 투과성상피세포의 전기적 저항성을 측정하여 세포 밀착결합과 세포를 가로지르는 투과성에 미치는 인돌의 영향을 평가하였다. 측정 시 4군데 각각 다른 영역을 측정하여 평균하여 사용 하였다.
투과성상피세포의 물질이 동을 알아보는 실험으로 2 X 10° cells/ml HT-29 세포를 transwell에서 세포결합을 형성시킨 후 DMSO, 인돌을 처리하여 48시간 동안 배양하였다. Transwell에서 배지를 모두 제거하고 미리 데워둔 PBS (Ca++ 포함된 것 반드시 사용)로 2번 세척하고 시간 의존적으로 [14C] D-mannitol (Sigma)를 apical 영역에 첨가하고 계속해서 일정한 곡도로 교반시켜 세포를 통과하는 동위원소 양을 측정하였다.
대상 데이터
세포는 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco BRL, Grand Island, NY, USA) 에 1%의 penicillin 및 streptomycin0] 포함된 DMEM 배지 (Gibco BRL, USA)를 사용하여 37°C 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. I3C (LKT Labs, St Paul, MN) 은 dimetyl sulphoxide (DMSO, Sigma, St. Louis, MO) 에 녹여 10 mM의 stock 용액으로 제조한 뒤 -20 °C 에 보관하여 적정 농도로 배지에 희석하여 실험하였다.
Arlington Heights, IL, USA)을 적용시킨 다음 암실에서 X-ray 필름에 감광시켜 특정단백질의 양을 분석하였다. Western blot을 위해 사용된 2차 항체로 사용된 peroxidase-labeld donkey anti-rabbbit 및 peroxidase-labeled sheep anti-mouse immunoglobulin은 amersham Life Science 에서 구입하였다.
본 실험에 사용한 인체대장암 세포인 HT-29 cell은 ATCC (American Type Culture Collection, UAS) 에서 구입하여 사용흐I였다. 세포는 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco BRL, Grand Island, NY, USA) 에 1%의 penicillin 및 streptomycin0] 포함된 DMEM 배지 (Gibco BRL, USA)를 사용하여 37°C 5% CO2 조건 하에서 배양하였다.
사용흐I였다. 세포는 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco BRL, Grand Island, NY, USA) 에 1%의 penicillin 및 streptomycin0] 포함된 DMEM 배지 (Gibco BRL, USA)를 사용하여 37°C 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. I3C (LKT Labs, St Paul, MN) 은 dimetyl sulphoxide (DMSO, Sigma, St.
실험하였다. 실험방법에서 언급한 바와 같이 세포 증식에 의한 세포 이동을 억제하기 위해서 무혈청 배지에서 실험하였다. 세포배양 접시에 피펫 팁으로 상처를 만들어 만든 공간에 농도별 인돌을 처리하여 48시간 동안 배양하면서 일정 시간 간격으로 현미경으로 관찰하고 사진을 찍었다 (Fig.
데이터처리
Data are shown as mean of triplicate samples (error bars, ± SE) and represent the invasive cell numbers com pared with those of control cells. The significance was deter mined by Student's t-test. *: p < 0.
Data are shown as mean of triplicate samples (error bars, ± SE) and represent the invasive cell numbers com pared with those of control cells. The significance was deter mined by Student's t-test. *: p < 0.
실험결과는 평균과 편차로 표시하였고 분산분석으로 분석 후 유의성이 나타난 항목에서 유의성 0.05% 수준에서 Student's t-test를 실시하여 대조군에 대한 유의성을 검정하였다.
5 mg/ml 농도가 되게 배지로 희석하여 2 ml씩 분주하고 3시간 동안 CO? incubator에서 배양시킨 다음 MTT 시약을 깨끗하게 제거하고 DMSO를 1 m씨 분주하여 well에 생성된 formazin을 모두 녹인 후 96 well plate 에 200 “1씩 옮겨서 ELISA reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) 로 540 nm에서 흡광도를 즉정하였다. 측정은 모두 세 번을 하였으며, 그에 대한 평균 값과 표준 오차를 Sigma Plot 4.0 프로그램 (SPSS Ins.) 으로구하였다
성능/효과
실시하였다. Fig. 1에서 나타난 바와 같이 HT-29 세포는 인돌처리 농도 의존적으로 세포의 증식이 유의적으로 억제되었으며, 특히 100 “M 이상의 농도에서 증식억제 효과는 약 70% 정도 보여 주었다. 따라서 모든 실험에서 인돌 농도는 세포의 증식 억제에 미치는 영향이 적은 50, 100 “M 농도로 처리하여 각각의 실험을 하였다.
측정한다. Fig. 3의 결과에서 DMSO를 처리한 세포는 74.3 ± 13.6 (Q X cm2) 이었고 50, 100 인돌을 처리한 세포에서의 전류저항은 200.31 ± 27.1, 321.47 ± 17.7 (Q x cm?) 로 각각 유의적 (p < 0.05) 으로 증가하였다. 또한 결과로 나타내지는 않았지만 암세포의 투과성상피세포의 전기적 저항성 증가에 대한 인돌의 영향을 재검정 하기 위해서 세포에 인돌을 처리하여 72시간 배양 후 배지에서 인돌을 제거하여 투과성상피세포의 전기적 저항성을 측정한 결과 증가된 투과성상피세포의 전기적 저항성은 24시간 유지하다가 서서히 원래 수준으로 되돌아갔다.
Fig. 4의 결과에서 transwell을 통과한 mannitol 유입이 대조군 (9.3 ± 1.6) 에 비해 인돌 처리 세포 (6.8 ± 1.71, 4.1 ± 1.33) 에서 각각 감소하였고 특히, 100 인돌 처리 세포에서는 현저한 유의적 (p< 0.05) 감소하여 투과성 상피 세포의 전기적 저항성과 역의 상관관계를 나타내었다. 이와 같은 결과는 대장암 세포에 인돌 처리시 인돌의 세포 밀착결합 형성에 영향을 미쳐 종양생성으로 증가된 세포를가로지는 투과성을 감소시킨다는 것을 확인 할 수 있었다.
상처회복 실험을 통한 세포이동성과 세포 침윤성 실험결과 인돌이 암세포의 이동과 침윤성을 억제하였고 투과성상피세포의 전기적 저항성 측정치는 인돌 처리 세포에서 증가하였다. HT-29 세포에서 과발현을 나타내는 밀착결합 단백질인 claudin-1, claudin-5 발현은 인돌 처리로 유전자의 전사수준과 단백질 수준에서 유의적인 감소를 나타내었다. 이상의 결과에서 인돌이 HT-29 세포의 밀착결합과 그 구성 단백질 중 claudin 발현 현상을 회복시키므로 암 경과와 전이 억제를 나타내었다.
암의 원인으로 유전, 환경 등이 영향을 미치는 것으로 보고 되고 있으며 환경인자 중 식생활과 관련 소화기관 암인 위암과 대장암 발병에 영향을 미치는 것으로 보고 되고 있다.I)대장암은 선진국에서 가장 흔한 암 이였으나 최근 우리나라에서도 대장암 발병은 남녀 함께 최근 10년 사이 가장 빠른 속도로 증가하고 있는 암이다. 급속한 경제발전으로 생활수준의 향상으로 식생활 문화의 서구화로 섭취열량 증가와 동물성 식품소비 증가가 대장암 발병을 증가 시킨다.
Claudin과 다른 단백질들과 결합을 이루고 있는 Z0-1 은 밀착결합 단백질 수와 밀접한 상호관련으로 조절된다.以> 본 실험결과 (Fig. 6)에서 Z0-1 은 claudin 발현 형태와 동일하여 상호관계를 나타내어 본 실험에서 HT-29 세포에서 처리한 I3C는 밀착결합 관련 단백질인 claudin, Z0-1 단백질 수준의 변화에 관여함을 확인 할 수 있었다. 그러나 Hoover 등'類은 밀착결합의 중요한 조절자인 ZO-1 이 유방암 세포에서 64%의 감소를 보였다고 하여 여전히 논쟁의 되고 있다.
종양세포에서의 E-cadherin 발현의 감소는 세포의 침윤성을 더 잘 유도 한다.引 본 실험에서 E-cadherin 발현은 대조세포에서 발현양이 현저히 낮았지만 인돌 처리 농도에 따라 단백질과 mRNA 발현이 유의적으로 증가 하였다 (Fig. 6).
那 따라서 본 실험은 대장암세포 HT-29에서 인돌이 밀착결합의 총수 또는 단백질 구성을 조절하는지를 알아보기 위해 밀착결합 관련 단백질의 mRNA 수준과 단백질 수준을 알아보았다. 그 결과 (Fig. 6) HT-29에 과발현된 claudin-1, -5은 인돌 처리로 단백질 수준에서 현저한 감소를 보였다. 그러나 mRNA 량은 변화가 없어 claudin 단백질 발현은 post-transcriptional 기전으로 조절 된다고 사료된다.
05)으로 감소하였다. 따라서 인돌은 대장암세포 HT-29의 이동성과 침윤성을 유의적으로 억제함을 볼 수 있었다. 다음 실험은 세포 결합 (세포-세포 연결, 밀착결합)과 관련돤 단백질 발현을 알아보고 세포 전이 억제에 영향을 미치는지 검증해보기 위해 관련 단백질을 western blot으로 실험하였다.
이러한 결과는 인돌에 의한 투과성상피세포의 전기적 저항성 증가는 안정적으로 세포변화에 관여하고 그 변화는 가역적이다 는 것을 제안한다. 또 다른 실험으로 혹시 증가된 투과성 상피 세포의 전기적 저항성이 세포증식으로 인한 증가인지를 확인하기 위해 72시간 동안 세포를 배양한 후 MTT를 실시한 결과 24시간 배양하여 실시한 MTT 결과와 동일한 결과를 얻어 본 실험의 투과성상피세포의 전기적 저항성 증가가 세포증식에 의한 것이 아니라 인돌의 영향임을 확인하였다. 이와 같은 결과는 대장암 세포에 처리한 인돌이 밀착결합 활성에 영향을 주어 세포의 결합 조절 효과에 연관성이 있음을 알 수 있었다.
05) 으로 증가하였다. 또한 결과로 나타내지는 않았지만 암세포의 투과성상피세포의 전기적 저항성 증가에 대한 인돌의 영향을 재검정 하기 위해서 세포에 인돌을 처리하여 72시간 배양 후 배지에서 인돌을 제거하여 투과성상피세포의 전기적 저항성을 측정한 결과 증가된 투과성상피세포의 전기적 저항성은 24시간 유지하다가 서서히 원래 수준으로 되돌아갔다. 이러한 결과는 인돌에 의한 투과성상피세포의 전기적 저항성 증가는 안정적으로 세포변화에 관여하고 그 변화는 가역적이다 는 것을 제안한다.
인돌은 십자화 야채류인 양배추, 컬리플라워, 브로클리 등에 존재하는 glucosinolate, glucobrassicin의 대사산물 이다. 본 연구의 결과는 인돌이 대장암 세포 HT-29에서 농도 의존적으로 세포증식 저해를 나타내었다. 상처회복 실험을 통한 세포이동성과 세포 침윤성 실험결과 인돌이 암세포의 이동과 침윤성을 억제하였고 투과성상피세포의 전기적 저항성 측정치는 인돌 처리 세포에서 증가하였다.
본 연구의 결과는 인돌이 대장암 세포 HT-29에서 농도 의존적으로 세포증식 저해를 나타내었다. 상처회복 실험을 통한 세포이동성과 세포 침윤성 실험결과 인돌이 암세포의 이동과 침윤성을 억제하였고 투과성상피세포의 전기적 저항성 측정치는 인돌 처리 세포에서 증가하였다. HT-29 세포에서 과발현을 나타내는 밀착결합 단백질인 claudin-1, claudin-5 발현은 인돌 처리로 유전자의 전사수준과 단백질 수준에서 유의적인 감소를 나타내었다.
생체 기저막 성분인 matrigel로 코팅한 chamber를 이용하여 HT-29세포의 침윤성을 알아본 결과 Fig. 5와 같이 100 인돌을 처리한 결과 유의적 (p < 0.05)으로 감소하였다. 따라서 인돌은 대장암세포 HT-29의 이동성과 침윤성을 유의적으로 억제함을 볼 수 있었다.
세포 밀착결합 단백질인 claudin-1 과 claudin-5의 단백질 및 mRNA 발현은 대조세포에서 발현양이 높았으며 claudin-1과 claudin-5 단백질 발현양은 인돌 처리 농도 의존적으로 현저한 감소하여 RT-PCR로 mRNA 수준을 확인한 결과 mRNA 발현은 변화를 보이지 않았다 (Fig. 6A, B). 이를 다시 확인을 위해 PCR primer 배열을 달리한 primer 를 사용하여 확인한 결과에서도 그 양에 변화가 없었다.
Adherens junction 단백질인 E-cadherin은 중요한 세포간 상호작용과 밀착결합 형성을 조절한다⑶ 암세포에서 E-cadherin의 손실은 전이에 밀접한 영향을 미치는 중요한 단백질 w로 인돌 처리로 발현량이 증가하였다. 이상의 결과를 종합하여 보면 인체 대장암세포인 HT-29 세포에 처리한 인돌은 밀착결합 단백질인 claudin-1, -5, ZO-1 과 TJ관련 단백질인 E-cadherin의 단백질 발현에 영향을 미쳐 밀착결합 복합체의 총수 또는 단백질 구성 조절에 관여 하는 것으로 나타났다. 따라서 I3C는 HT-29 세포에서 밀착결합 단백질의 발현 조절 및 그 활성에 영향을 미쳐 세포막 투과성 조절로 암의 경과와 전이를 예방 할 수 있을 것으로 사료된다.
HT-29 세포에서 과발현을 나타내는 밀착결합 단백질인 claudin-1, claudin-5 발현은 인돌 처리로 유전자의 전사수준과 단백질 수준에서 유의적인 감소를 나타내었다. 이상의 결과에서 인돌이 HT-29 세포의 밀착결합과 그 구성 단백질 중 claudin 발현 현상을 회복시키므로 암 경과와 전이 억제를 나타내었다. 결론적으로, 천연 항암화합물인 인돌은 대장암 세포 HT-29 에서 밀착결합 단백질인 claudin-1, -5을억제하여 밀착결합을 활성화하므로 암진행과 전이를 억제할 수 있는 인돌에 의한 새로운 기전을 보고합니다.
05) 감소하여 투과성 상피 세포의 전기적 저항성과 역의 상관관계를 나타내었다. 이와 같은 결과는 대장암 세포에 인돌 처리시 인돌의 세포 밀착결합 형성에 영향을 미쳐 종양생성으로 증가된 세포를가로지는 투과성을 감소시킨다는 것을 확인 할 수 있었다. 다음 실험으로 이상의 결과들이 결과적으로 암의 사망률에 가장 영향을 많이 주는 암의 전이 억제에 영향을 미치는지 알아보기 위해 matrigel 침윤성 실험을 하였다.
2). 인돌 처리 농도 의존적으로 대조세포에 비해 세포의 이동성이 현저히 억제되는 현상을 보여주었다. 본 실험에서 인돌의 세포이동성 억제에 영향을 미치는 이유는 세포의 밀착결합 형성의 부조 또는 파괴가 그 원인으로 가정하였다.
후속연구
이상의 결과를 종합하여 보면 인체 대장암세포인 HT-29 세포에 처리한 인돌은 밀착결합 단백질인 claudin-1, -5, ZO-1 과 TJ관련 단백질인 E-cadherin의 단백질 발현에 영향을 미쳐 밀착결합 복합체의 총수 또는 단백질 구성 조절에 관여 하는 것으로 나타났다. 따라서 I3C는 HT-29 세포에서 밀착결합 단백질의 발현 조절 및 그 활성에 영향을 미쳐 세포막 투과성 조절로 암의 경과와 전이를 예방 할 수 있을 것으로 사료된다. 본 연구의 결과는 claudin의 생물학적 기능에 대한 미흡한 단서를 밝혔다고 사료된다.
여전히 많은 부분이 알려져 있지 않고 남아 있다. 앞으로 계속해서 진행하여 확인 할 실험으로는 claudin siRNA 또는 shRNA를 이용한 검정과 동물실험을 통한 확인을 통해 claudin의 암세포에서의 기능과 더불어 인돌의 항암효과 기전을 더 확실히 규명 할 수 있을 것이다.
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