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문제 정의
- 또한 분리 균주가 생산하는 항진균 물질의 특성을 조사하여 세균뿐만 아니라 인체에 유해한 곰팡이를 억제할 수 있는 강력한 천연 식품보존제의 개발을 위한 기초자료를 제공하고자 하였디..
- 본 연구에서는 김치로부터 항진균 활성을 가진 유산균을 분리 - 동정하고 분리 균주의 항미생물 활성 범위를 조사하였다. 또한 분리 균주가 생산하는 항진균 물질의 특성을 조사하여 세균뿐만 아니라 인체에 유해한 곰팡이를 억제할 수 있는 강력한 천연 식품보존제의 개발을 위한 기초자료를 제공하고자 하였디.
제안 방법
- 온도에 의한 영향을 알아보기 위하여 조항균 물질을 30℃, 50℃, 7(TC에서 24시간, 100%:에서 30분, 12FC에서 15분간 열처리한 후에 잔존활성을 측정하였다. 각종 효소에 대한 영향을 알아보기 위하여 조항균 물질에 proteinase K(EC 34.21.64, Sigma Co., U.S.A.), protease (type I, Sigma), pepsin(EC 3.4.23.1, Sigma), trypsin(EC 3.4.21.4, Sigma), oc~chymotrypsin(EC 3.4.21.1, type I-S, Sigma), Iysozyme(EC 3.2.1.17, Sigma), a-amylase(EC 3.2.1.1, Type VⅢ, Sigma), lipase(EC 3.1.1.3, type VⅡ, Sigma)는 2mg/mL, aminopeptidee I(EC 3.4.11.22, Sigma) 는 1 unit/" 농도로 처리한 후에 잔존하는 항진균 활성을 측정하였다. 항진균 활성 역가는 spot-on-the lawn test 방법을 사용하여 AU(activity imit)/mN로 나타내었으며 , 감수성 곰팡이로는 A.
- p-R(5'-AAAAAGAAAGGAGGT- GATCCAGCCGCAGGTT-3') primer를 사용하였다. 1, 2차 PCR 산물은 각각 pGEM-T vector(Promega)에 cloning한 후 ABI PRISM 3730 DNA Analyzer(Applied Biosystems, Foster City, CA, U.S.A.}를 이용하여 염기서열을 분석하였다. 그 결과를 BLASTN 프로그램을 이용하여 GenBank의 ribosomal RNA gene sequence와 비교분석하였다.
- )를이용하여 분리한 후에 LeuP-F(5'-GCGGCGTGCCTAATA- CATGCAAGrCG-3)와 LeuP-R(5'-GACCCGGGAACG- TATTCACCGCGGC-31) primer를 사용하여 1차 PCR을 수행흐}였다. 16S rRNA의 complete sequence 분석을 위한 2 차 PCRe Lb.p-F(5'-ATTAAITTGAGAGTTTGATCCTGG- CTCAGGAC3) 와 Lb.p-R(5'-AAAAAGAAAGGAGGT- GATCCAGCCGCAGGTT-3') primer를 사용하였다. 1, 2차 PCR 산물은 각각 pGEM-T vector(Promega)에 cloning한 후 ABI PRISM 3730 DNA Analyzer(Applied Biosystems, Foster City, CA, U.
- 5% agar, w/ v)에 도말하였다. 3(rc에서 평판배양하면서 투명환을 나타내며 집락을 형성하는 균주들 중 곰팡이에 대한 저해 활성을 보이는 균주와 이에 감수성을 나타내는 곰팡이를 동시에 분리하였다. 분리 균주는 MRS 액체배지에 접종하여 30℃에서 24시간 동안 배양하였으며, 분리 곰팡이는 PDA(potato dextrose agar, Difco Laboratories) 평판배지에 접종하여 25℃에서 5일 동안 배양한 후 실험에 사용하였다.
- 원심분리에 의해 얻어진 genomic DNA 는 70% ethanol을 이용하여 세척하였다 얻어진 genomic DNA는 미량의 멸균수를 첨가하여 현탁하고, 60℃에서 1시간 처리한 후 PCR에 사용하였다. PCRe universal primer 인 ITSl(5, -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3, )과 ITS4R(5'- CAGACTr(G/A)TA(OT)ATGGTCCAG-3') primer를 사용하여 수행하였다. 증폭된 PCR 산물은 Wizard SV Gel and PCR clean-up system(Promega)을 이용하여 정제한 후에 ABI PRISM 3730 DNA Analyzer# 이용하여 염기서열을 분석하였다.
- 0으로 조정하여 37℃에서 2시간 동안 처리하였다. pH- renaturation 실험에서는 균주의 배양상징액을 pH 3.0~7.0에서 2시간 동안 처리 후 5 N HC1 과 5 N NaOH를 사용하여 원래의 배양액 pH인 pH 3.9로 조정하여 항진균 활성을 측정하였다. 온도에 의한 영향을 알아보기 위하여 조항균 물질을 30℃, 50℃, 7(TC에서 24시간, 100%:에서 30분, 12FC에서 15분간 열처리한 후에 잔존활성을 측정하였다.
- 조사하였다. pH에 대한 영향을 알아보기 위하여 분리 균주의 배양상징액을 5 N HCI과 5 N NaOH< 사용하여 pH 3.0~7.0으로 조정하여 37℃에서 2시간 동안 처리하였다. pH- renaturation 실험에서는 균주의 배양상징액을 pH 3.
- 인체에 유해한 곰팡이들에 대한 Lb. plantarum AF1의 생육 저해 활성을 관찰하였다(Fig. 2).
- Lb. plantarum AF1의 생육곡선과 생육에 따른 항진균 활성을 조사하였다(Fig. 3). Lb.
- 항진균 활성은 2배 희석법을 사용하여 spot-on-the lawn test 방법[기으로 측정하였다. 감수성 곰팡이 인 A. fumigatus ATCC 96918의 포자를 PDA 배지 20mL에 5x 104 cfu/mL로 첨가흐}여 petri dish에 부은 후에 굳으면 조항균 물질 20|iL를 배지 위에 spotting하여 3(TC에서 48시간 배양한 후 항진균 활성을 측정하였다. 항진균 활성 역가는 항균 물질을 순차적으로 2배씩 희석하여 저해환을 형성하는 최대 희석배수의 역을 취하고, 이 값에 1 mL에 대해서 환산해 주는 환산계수를 곱하여 AU(activity unit)/ml로 나타내었다.
- 5% yeast extract, 1% NaCl) 평판배지에 IxlO6 cfu/plate로 도말하여 준비하였다. 곰팡이 포자가 첨가된 평판배지 또는 세균이 도말된 평판배지위에 8 mm 직경의 paper disk(Advantec, Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Japan)를 놓고 조항균 물질을 100 μl씩 일정하게 가한 후에 감수성 세균은 37P에서 24 시간 동안 배양하고, 감수성 곰팡이는 25℃ 또는 30℃에서 24~96시간 동안 배양하여 분리 균주가 생산하는 항균 물질에 의한 생육 저지환 생성 여부를 관찰하였다. 생육 저지 환은 digimatic caliper(CD-15CPX, Mitutoyo Co.
- 1). 곰팡이에 대한 뚜렷한 저해 활성을 보이는 균주 1종과 이에 감수성을 나타내는 곰팡이를 각각 분리하였으며 , 항진균 활성을 나타내는 균주는 AF1 으로, 이에 대해 감수성을 나타내는 곰팡이는 KF-1 으로 각각 명명하였다.
- 형태학적, 생화학적 특성을 조사하였다. 그람 염색 및 현미경 관찰과 API 50 CHL system(BioMerieux, Marcy lEtoile, France)을 이용하여 당 발효능을 조사한 후에 균주 동정 프로그램 (http://apiweb.biomerieux.com)을 이용하여 균주를 동정하였다. 최종적인 동정을 위하여 분리 균주의 16S rRNA 염기서열을 결정하여 알려진 균주들과 비교하였다.
- 김치 여과액을 멸균수를 이용하여 단계적으로 희석한 후에 100 μL를 취하여 CaCCh가 2%(w/v) 첨가된 MRS (Difco Laboratories, MI, U.S.A.) 한천배지 (1.5% agar, w/ v)에 도말하였다. 3(rc에서 평판배양하면서 투명환을 나타내며 집락을 형성하는 균주들 중 곰팡이에 대한 저해 활성을 보이는 균주와 이에 감수성을 나타내는 곰팡이를 동시에 분리하였다.
- 분리 균주를 30℃에서 0~120시간 동안 정치배양 하면서 600 nm(Ultrospec 2100 pro, Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)에서 흡광도를 측정하여 생육곡선을 그리고, 생육에 따른 배양액의 pH(pH meter, M545, Coming Inc., NY, U.S.A.X 측정한 후 이때의 항진균 활성을 측정하였다. 항진균 활성은 2배 희석법을 사용하여 spot-on-the lawn test 방법[기으로 측정하였다.
- 7% agar) 10 mL에 1 x 10& 곰팡이 포자를 첨가하여 분리 균주가 접종된 MRS 평판배지 위에 부어주었다. 분리 균주와 곰팡이가 접종된 평판배지들은 30℃에서 24시간 배양한 후 각 곰팡이의 생육 온도에서 배양하면서 생육 저해환의 생성 여부를 관찰하였다.
- 분리 균주의 16S rRNA sequencinge Palmcycler(Corbett Research, Australia)를 사용하여 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 분리 균주의 chromosomal DNA를 Wizard genomic DNA purification kit(Promega, Madison, WI, U.S.A.)를이용하여 분리한 후에 LeuP-F(5'-GCGGCGTGCCTAATA- CATGCAAGrCG-3)와 LeuP-R(5'-GACCCGGGAACG- TATTCACCGCGGC-31) primer를 사용하여 1차 PCR을 수행흐}였다. 16S rRNA의 complete sequence 분석을 위한 2 차 PCRe Lb.
- , Japan)를 놓고 조항균 물질을 100 μl씩 일정하게 가한 후에 감수성 세균은 37P에서 24 시간 동안 배양하고, 감수성 곰팡이는 25℃ 또는 30℃에서 24~96시간 동안 배양하여 분리 균주가 생산하는 항균 물질에 의한 생육 저지환 생성 여부를 관찰하였다. 생육 저지 환은 digimatic caliper(CD-15CPX, Mitutoyo Co., Japan)를 사용하여 지름을 측정하였다.
- 숙성된 김치로부터 유산균을 분리히기 위하여 김치 여과액을 2% CaCOj가 첨가된 MRS 평판배지에 도말하여 30℃ 에서 배양하면서 형성되는 미생물의 집락을 관찰하였다. 김치 여과액이 도말된 MRS-CaCO3 고체 배지 상에서 산 생성에 따른 투명환을 형성하는 균주의 집락들과 함께 하얗게 균사를 형성하면서 자라는 곰팡이 1종이 관찰되었다(Fig.
- 측정하였다. 실험대조구로는 MRS 액체배지에 AF1 배양액의 lactic acid와 동일한 양(183 mM)을 첨가하고 AF1 배양액의 pH(pH 3.9)로 조정한 후 Centriprep YM-3을 사용하여 3, 000 Da 이상과 이하의 분획을 나누어 사용하였다. 본 실험 결과 Lb.
- 9로 조정하여 항진균 활성을 측정하였다. 온도에 의한 영향을 알아보기 위하여 조항균 물질을 30℃, 50℃, 7(TC에서 24시간, 100%:에서 30분, 12FC에서 15분간 열처리한 후에 잔존활성을 측정하였다. 각종 효소에 대한 영향을 알아보기 위하여 조항균 물질에 proteinase K(EC 34.
- 3% SDS)를 가하여 10분간 방치한 후에 멸균된 glass bead를 이용하여 균사체를 파쇄하였다. 원심분리(13, 900xg, 3 min)후 상징액을 취하여 동일 부피의 isopropanol을 가하여 genomic DNA를 침전시켰다. 원심분리에 의해 얻어진 genomic DNA 는 70% ethanol을 이용하여 세척하였다 얻어진 genomic DNA는 미량의 멸균수를 첨가하여 현탁하고, 60℃에서 1시간 처리한 후 PCR에 사용하였다.
- 0) 완충액에 녹여 5배 농축 배율로 준비하였다. 이때 균체배양을 하지 않은 MRS 액체 배지에 분리 균주 AF1 이 생산하는 lactic acid와 동일한 양의 lactic acid를 첨가한 후, 이후 항진균 활성 측정용 AF1 배양상징액과 동일한 하정으로 처리한 시료를 대조구로 사용하였다. 유산균의 항진균 활성 측정 시 유산균의 산생성에 의한 활성은 대조구의 활성 값으로 하여 이를 측정된 항진균 활성 값에서 빼주었다.
- PCRe universal primer 인 ITSl(5, -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3, )과 ITS4R(5'- CAGACTr(G/A)TA(OT)ATGGTCCAG-3') primer를 사용하여 수행하였다. 증폭된 PCR 산물은 Wizard SV Gel and PCR clean-up system(Promega)을 이용하여 정제한 후에 ABI PRISM 3730 DNA Analyzer# 이용하여 염기서열을 분석하였다. 그 결과는 BLASTN 프로그램을 이용하여 GenBank의 ribosomal RNA gene sequencee 비교하였으며, sequence] 상동성은 Clustal X program을 이용하여 분석하였다.
- com)을 이용하여 균주를 동정하였다. 최종적인 동정을 위하여 분리 균주의 16S rRNA 염기서열을 결정하여 알려진 균주들과 비교하였다. 분리 균주의 16S rRNA sequencinge Palmcycler(Corbett Research, Australia)를 사용하여 다음과 같은 방법으로 수행하였다.
- 항진균 물질의 pH, 온도 및 각종 효소처리에 대한 안정성을 조사하였다. pH에 대한 영향을 알아보기 위하여 분리 균주의 배양상징액을 5 N HCI과 5 N NaOH< 사용하여 pH 3.
- )으로부터 구입 하였으며, Aspergillus petrakii PF-1, Aspergillus ochraceus PF-2, Aspergillus nidulans PF-3, Cladosporium gossypiicola KF~2는 본 실험실에서 메주(PF- 1~3))와 김치(KF-2)로부터 분리한 곰팡이로서 본 실험에 사용하였다. 항진균 활성 측정은 dual culture overlay assay 빙법[14]을 변형하여 다음과 같이 시행하였다. 24시간 동안 배 양된 분리 균주의 배 양액 10 μL(7.
- 항진균 활성을 나타내는 분리 균주의 동정을 위하여 일차적으로 형태학적, 생화학적 특성을 조사하였다. 그람 염색 및 현미경 관찰과 API 50 CHL system(BioMerieux, Marcy lEtoile, France)을 이용하여 당 발효능을 조사한 후에 균주 동정 프로그램 (http://apiweb.
대상 데이터
- 8S rRNA gene sequencinge 시행하여 염기 서열을 비교한 결과 Epicoccum nigrum AF455455와 99%의 상동성을 나타내었다. 감수성 곰팡이는 최종 E nigrum KF-L으로 명명하였으며, 항진균 활성 실험을 위한 감수성 균주로 사용하였다.
- 감수성균으로 사용한 곰팡이들은 MEA(malt extract agar, Difco Laboratories) 또는 PDA 배지 20 mL를 멸균하여 식힌 후에 곰팡이 포자를 5xl04 cfu/mL로 첨가하여 petri disM 부은 후에 굳으면 실험에 사용하였다. 감수성 균으로 사용한 세균들은 LB(1% bacto-tiyptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl) 평판배지에 IxlO6 cfu/plate로 도말하여 준비하였다. 곰팡이 포자가 첨가된 평판배지 또는 세균이 도말된 평판배지위에 8 mm 직경의 paper disk(Advantec, Toyo Roshi Kaisha, Ltd.
- 실험에 사용한 감수성균 중 ATCC 균주는 ATCC로부터 구입하였으며 , KFRI 균주는 한국식품연구원 (Korea)으로부터 분양받아 사용하였다. 감수성균으로 사용한 곰팡이들은 MEA(malt extract agar, Difco Laboratories) 또는 PDA 배지 20 mL를 멸균하여 식힌 후에 곰팡이 포자를 5xl04 cfu/mL로 첨가하여 petri disM 부은 후에 굳으면 실험에 사용하였다. 감수성 균으로 사용한 세균들은 LB(1% bacto-tiyptone, 0.
- 광주광역시와 전라남도 등지에서 잘 익은 배추김치를 수집하여 김치 내용물 전체를 마쇄한 후에 멸균거즈로 여과하였다. 김치 여과액을 멸균수를 이용하여 단계적으로 희석한 후에 100 μL를 취하여 CaCCh가 2%(w/v) 첨가된 MRS (Difco Laboratories, MI, U.
- method[10J를 사용하여 조사하였다. 실험에 사용한 감수성균 중 ATCC 균주는 ATCC로부터 구입하였으며 , KFRI 균주는 한국식품연구원 (Korea)으로부터 분양받아 사용하였다. 감수성균으로 사용한 곰팡이들은 MEA(malt extract agar, Difco Laboratories) 또는 PDA 배지 20 mL를 멸균하여 식힌 후에 곰팡이 포자를 5xl04 cfu/mL로 첨가하여 petri disM 부은 후에 굳으면 실험에 사용하였다.
- 항진균 활성 측정 실험에 사용한 감수성 곰팡이 중 Aspergillus flavus ATCC 22546, Aspergillus fumigatus ATCC 96918, Penicillium roqueforti ATCC 10H0은 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA, USA.)으로부터 구입 하였으며, Aspergillus petrakii PF-1, Aspergillus ochraceus PF-2, Aspergillus nidulans PF-3, Cladosporium gossypiicola KF~2는 본 실험실에서 메주(PF- 1~3))와 김치(KF-2)로부터 분리한 곰팡이로서 본 실험에 사용하였다. 항진균 활성 측정은 dual culture overlay assay 빙법[14]을 변형하여 다음과 같이 시행하였다.
데이터처리
- 증폭된 PCR 산물은 Wizard SV Gel and PCR clean-up system(Promega)을 이용하여 정제한 후에 ABI PRISM 3730 DNA Analyzer# 이용하여 염기서열을 분석하였다. 그 결과는 BLASTN 프로그램을 이용하여 GenBank의 ribosomal RNA gene sequencee 비교하였으며, sequence] 상동성은 Clustal X program을 이용하여 분석하였다.
- }를 이용하여 염기서열을 분석하였다. 그 결과를 BLASTN 프로그램을 이용하여 GenBank의 ribosomal RNA gene sequence와 비교분석하였다.
이론/모형
- plantarum AF1 이 생산하는 항균 물질에 의한 항미생물 활성을 paper disk method를 통하여 조사하였다(Table 1).
- Lb. plantarum AF1 이 생산하는 항진균 물질의 분자량을 추정하기 위하여 배양 상징액을 분자량 3, 000 Da 이상과 이하의 분획으로 나누어 Aspegillus fumigatus ATCC 96918에 대한 항진균 활성을 paper disk methods. 측정하였다.
- 유산균의 항진균 활성 측정 시 유산균의 산생성에 의한 활성은 대조구의 활성 값으로 하여 이를 측정된 항진균 활성 값에서 빼주었다. 분리 균주가 생산하는 lactic acid의 농도는 D-Lactic acid/L-Lactic acid kit(Roche, R-Biopharm AQ Germany)를 사용하여 측정하였다, 준비한 항진균 물질과 대조구는 각각 100 μL씩취하여 A. fumigatus ATCC 96918에 대한 항진균 활성을 paper disk method를 사용하여 측정하였으며, 항진균 활성 역가는 Spot-on-the lawn test 방법을 사용하여 AU(activity imit)/mL로 나타내었다.
- 분리 균주가 생산하는 항균 물질에 의한 그람 양성 균과 음성균, 유산균 및 곰팡이에 대한 항미생물 활성을 paper disk method[10J를 사용하여 조사하였다. 실험에 사용한 감수성균 중 ATCC 균주는 ATCC로부터 구입하였으며 , KFRI 균주는 한국식품연구원 (Korea)으로부터 분양받아 사용하였다.
- 22, Sigma) 는 1 unit/" 농도로 처리한 후에 잔존하는 항진균 활성을 측정하였다. 항진균 활성 역가는 spot-on-the lawn test 방법을 사용하여 AU(activity imit)/mN로 나타내었으며 , 감수성 곰팡이로는 A. fumigatus ATCC 96918을 사용하였다.
- X 측정한 후 이때의 항진균 활성을 측정하였다. 항진균 활성은 2배 희석법을 사용하여 spot-on-the lawn test 방법[기으로 측정하였다. 감수성 곰팡이 인 A.
성능/효과
- 16S rRNA 염기서열 결정을 위하여 AF1 균주의 genomic DNA 를 이용하여 1차 PCR을 시행한 결과 1, 277 bp의 염기서열을 결정하였으며, 이를 GenBank에 등록된 다른 균주들과 염기서열을 비교한 결과 Lactobacillus plantarum WCFS1 (ATCC BAA-793)의 16S rRNA 염기서열 일부(541 bp)와 16S rRNA upstream의 일부 서열(636bp)을 포함한 genomic DNA 단편과 높은 상동성(99%)을 보였다. AF1 균주의 16S rRNA 전체 염기서열을 결정하기 위하여 2차 PCR을 시행한 결과 1, 571 bp의 AF1 16S rRNA 염기서열을 결정하였다.
- 16S rRNA 염기서열 결정을 위하여 AF1 균주의 genomic DNA 를 이용하여 1차 PCR을 시행한 결과 1, 277 bp의 염기서열을 결정하였으며, 이를 GenBank에 등록된 다른 균주들과 염기서열을 비교한 결과 Lactobacillus plantarum WCFS1 (ATCC BAA-793)의 16S rRNA 염기서열 일부(541 bp)와 16S rRNA upstream의 일부 서열(636bp)을 포함한 genomic DNA 단편과 높은 상동성(99%)을 보였다. AF1 균주의 16S rRNA 전체 염기서열을 결정하기 위하여 2차 PCR을 시행한 결과 1, 571 bp의 AF1 16S rRNA 염기서열을 결정하였다. 1, 2차 PCR 결과로부터 결정된 AF1의 염기서열(2,207 bp) 은 Lb.
- Lb plantarum AF1 이 생산하는 항미생물 물질은 식품에 부패를 일으키며 인체에 유해한 곰팡이뿐만 아니라 식중독을 일으키는 세균들에 강한 생육 저해 활성을 나타내었다. 이러한 결과는 Lb.
- Lb. plantarum AF1 이 생산하는 항진균 물질의 pH에 대한 영향을 실험한 결과 pH 3.0과 4.0에서는 본래의 활성 (3, 200 AU/mL)을 유지하였으나 pH 5.0-7.0 구간에서는 활성을 급격히 상실하였다. 그리고 pH 처리 후(pH 3.
- Lb. plantarum AF1에 감수성을 나타내는 곰팡이의 균주 동정을 위하여 ITS-5.8S rRNA gene sequencinge 시행하여 염기 서열을 비교한 결과 Epicoccum nigrum AF455455와 99%의 상동성을 나타내었다. 감수성 곰팡이는 최종 E nigrum KF-L으로 명명하였으며, 항진균 활성 실험을 위한 감수성 균주로 사용하였다.
- petrakii에도 뚜렷한 생육 저해 환을 형성하였으며, 저온저장 식품에서 변패를 일으키는 Penicillium roquefortie 대중]]서는 강한 생육 저해환을 나타내지는 않았으나 Lb. plantarum AF1의 균체 주변으로 포자형성 이 억제되는 현상을 관찰할 수 있었다. 항진균 활성 실험에서 대조구로 사용한 lb gasseri ATCC 33323은 어떠한 곰팡이에도 생육 저해 활성을 나타내지 않았다(Fig.
- 본 실험 결과 Lb. plantarum AF1의 항진균 활성은 분자량 3, 000 Da 이하의 분획에서만 항진균 활성이 관찰되어(3, 200 AU/mL) 항진균물질은 분자량 3, 000 Da 미만의 물질임을 알 수 있었다(Fig. 4). 대조구의 항진균 역가는 약 400 AU/mL로 나타나 Lb.
- Lb. plantarum AFIe 인체에 피부질환을 일으키는 Epicoccum 用grm과 알레르기나 염증성 폐렴에 관여하는 Cladosporium gossypiicol(^\ 병원성 곰팡이에 강한 저해 활성을 나타내었다. 또한 식품과 사료를 오염시키며 인체에 aspergillosis 유발하는 Aspegillus fumigatuse- 식품과 시료에서 저장기간 중에 부패를 일으키며 독소를 생성하는 곰팡이인 A.
- plantarum, Lb. sakei 등이 주로 포함되어있으며 , 실험 결과 A. fiimigatus, A. nidulans, Fusarium sporotrichioides, R commune straine] 곰팡이들과 Rhodotorula mucilaginosa strain의 효모는 대체로 잘 저해한 반면, P. roqueforti strain 곰팡이와 Pichia anomala, Kluyveromyces marxianus strain의 효모에 대해서는 실험에 사용된 어떤 유산균도 저해 활성을 나타내지 않았다. Bello 등[3}은 overlay method를 이용한 항진균 활성 실험결과 Lb.
- 곰팡이에 대한 실험에서는 감수성균으로 사용한 모든 곰팡이를 저해하였으며 a fumigatus ATCC 96918에 대하여가장 강한 저해 활성을 나타내었고 나머지 곰핑이에 대해서는 유사한 항진균 활성을 나타내었다(Table 1). 그람 양성과 그람 음성 세균들에 대한 항균 활성 실험에서는 대체로 강한 저해 활성을 나타내었으며, 특히 Bacillus subtilis ATCC 6633, Micrococcus luteus ATCC 13513, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Staphylococcus aureus subsp.
- 0 구간에서는 활성을 급격히 상실하였다. 그리고 pH 처리 후(pH 3.0-7.0) 이를 다시 균체 배양 후의 배양액 pH인 pH 3.9로 복원시켰을 때 pH 처리 전구간에서(pH 3.0-7.0) 상실된 항진균 활성이 100% 회복되었다(Table 2). 온도에 대한 안정성 실험에서 항진균 활성은 30℃, 50℃, 70℃에서 24시간, 100℃에서 30분, 121℃에서 15분간 열처리한 후에도 활성을 100% 유지하여(Table 2) 온도에 매우 안정한 물질임을 알 수 있었다.
- 김치 여과액이 도말된 MRS-CaCO3 고체 배지 상에서 산 생성에 따른 투명환을 형성하는 균주의 집락들과 함께 하얗게 균사를 형성하면서 자라는 곰팡이 1종이 관찰되었다(Fig. 1). 곰팡이에 대한 뚜렷한 저해 활성을 보이는 균주 1종과 이에 감수성을 나타내는 곰팡이를 각각 분리하였으며 , 항진균 활성을 나타내는 균주는 AF1 으로, 이에 대해 감수성을 나타내는 곰팡이는 KF-1 으로 각각 명명하였다.
- 각종 효소에 대한 영향을 살펴본 결과 항진균 활성은 peptidase오! 단백가수분해 효소를 비롯하여 lysozyme, a- amylase, lipase 등의 어떠한 효소에도 영향을 받지 않았다 (Table 2). 따라서 항진균 물질은 비단백질성 물질이거나 단백 가수분해효소에 영향을 받지 않는 물질이며, 당이나 지질의 결합이 항진균 활성에 영향을 주지 않음을 알 수 있었다.
- plantarum AFIe 인체에 피부질환을 일으키는 Epicoccum 用grm과 알레르기나 염증성 폐렴에 관여하는 Cladosporium gossypiicol(^\ 병원성 곰팡이에 강한 저해 활성을 나타내었다. 또한 식품과 사료를 오염시키며 인체에 aspergillosis 유발하는 Aspegillus fumigatuse- 식품과 시료에서 저장기간 중에 부패를 일으키며 독소를 생성하는 곰팡이인 A. ochraceusek A. nidulanse 대해서도 강한 생육 저해 활성을 나타내었다. 이들보다 활성이 다소 약하긴 하지만 간암 유발 물질인 aflatoxin을 생성하는 A.
- 9를 그대로 유지하였다. 생육에 따른 a fumigatus ATCC 96918에 대한 항진균 활성은 생육 곡선과 함께 증가하기 시작하여 생육 정지기에 들어선 20시간 후부터 최데 활성 (3, 200 AU/mL)을 나타내었으며, 생육 120시간까지도 활성이 감소되지 않고 유지되었다.
- 0) 상실된 항진균 활성이 100% 회복되었다(Table 2). 온도에 대한 안정성 실험에서 항진균 활성은 30℃, 50℃, 70℃에서 24시간, 100℃에서 30분, 121℃에서 15분간 열처리한 후에도 활성을 100% 유지하여(Table 2) 온도에 매우 안정한 물질임을 알 수 있었다. 각종 효소에 대한 영향을 살펴본 결과 항진균 활성은 peptidase오! 단백가수분해 효소를 비롯하여 lysozyme, a- amylase, lipase 등의 어떠한 효소에도 영향을 받지 않았다 (Table 2).
- 5 이상에서 활성이 감소하였으나 원래의 pH(pH 3, 6)로 복원시킬 경우 활성이 회복되었으며, 12 MC에서 15분간 열처리한 후에도 활성을 유지하였으나 proteinase K와 trypsin 처리에는 활성을 상실하였다[14]. 이상과 같은 연구들에서 항진균 물질에 따라 pH 안정성과 열 안정성은 비교적 다르게 나타나지만 단백질성 항진균 물질의 경우 단백분해효소 처리에 의한 활성 상실이 명백히 관찰되었다. 따라서 단백분해효소 처리에 영향을 받지 않은 AF1 항진균 물질은 비단백질성 물질로 추정되며 이는 생육시기에 따른 항진균 활성 실험에서 추정된 결과와 동일하다.
- 항진균 활성을 나타내는 분리 균주는 그람 염색 후 현미경 관찰 결과 그람 양성의 간균이며 , API 50CHL system을 이용하여 당 이용성 조사를 통한 균주 동정 결과 lactobacillus plantantm으로 판정되었다(data not shown). 16S rRNA 염기서열 결정을 위하여 AF1 균주의 genomic DNA 를 이용하여 1차 PCR을 시행한 결과 1, 277 bp의 염기서열을 결정하였으며, 이를 GenBank에 등록된 다른 균주들과 염기서열을 비교한 결과 Lactobacillus plantarum WCFS1 (ATCC BAA-793)의 16S rRNA 염기서열 일부(541 bp)와 16S rRNA upstream의 일부 서열(636bp)을 포함한 genomic DNA 단편과 높은 상동성(99%)을 보였다.
후속연구
- 본 실험실에서는 현재 항진균 활성 물질의 분리,정제 및 분석을 통하여 AF1 항진균 물질의 특성을 규명하는 연구들이 수행되고 있다. 향후 정제된 AF1 항진균 물질의 항진균 활성 기작에 대한 연구들이 수행될 것이며, 천연 식품보존제로서 실제 식품에 적용시킬 수 있는 응용 방법들에 대한 연구들이 이루어져야 할 것이다.
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