Penicillin G amidase(PGA, benzylpenicillinamidohydrolase, EC 3.5.1.11)는 penicillin G를 phenylacetic acid(PAA)와 6-aminopenicillanic acid(6-APA)로 분해하는 효소이다. Escherichia coli(E. coli) ATCC 11105의 PGA는 24 kDa의 small subunit과 65 kDa의 large subunit으로 구성되어 있고, precursor polypeptide에서 signal peptide와 spacer peptide가 절단되어 활성을 가진 heterodimer가 형성된다. 본 연구에서는 E. coli ATCC 11105에서 PCR(polymerase chain reaction)을 통해 증폭한 pga gene을 expression vector에 넣어 pET-pga plasmid를 제작하였고, 이것을 E. coli BL21 (DE3) 균주에 형질 전환하여 PGA를 발현하고 그 활성을 분석하였다. E. coli BL21(DE3)/pET-pga 균주의 고밀도 배양액을 SDS-PAGE로 분석 했을 때, PGA의 precursor, large subunit, 그리고 small subunit으로 보이는 protein band가 나타났으며, PGA가 soluble form의 precursor로 발현되어 processing을 거쳐서 large subunit과 small subunit으로 절단되기도 하고, 일부는 insoluble form의 precursor로 발현되기도 하는 것으로 생각된다. 유가배양시 온도변화 전략을 사용하여 고농도 배양에서 발현을 유도하였다. 온도변화 전략은 $37^{\circ}C$에서 $28^{\circ}C$를 거쳐 $22^{\circ}C$로 3단계로 변화시켰다. 이러한 전략으로 PGA활성은 19.6 U/mL이며 균체량은 600 nm에서 흡광도가 62까지 도달하였다.
Penicillin G amidase(PGA, benzylpenicillinamidohydrolase, EC 3.5.1.11)는 penicillin G를 phenylacetic acid(PAA)와 6-aminopenicillanic acid(6-APA)로 분해하는 효소이다. Escherichia coli(E. coli) ATCC 11105의 PGA는 24 kDa의 small subunit과 65 kDa의 large subunit으로 구성되어 있고, precursor polypeptide에서 signal peptide와 spacer peptide가 절단되어 활성을 가진 heterodimer가 형성된다. 본 연구에서는 E. coli ATCC 11105에서 PCR(polymerase chain reaction)을 통해 증폭한 pga gene을 expression vector에 넣어 pET-pga plasmid를 제작하였고, 이것을 E. coli BL21 (DE3) 균주에 형질 전환하여 PGA를 발현하고 그 활성을 분석하였다. E. coli BL21(DE3)/pET-pga 균주의 고밀도 배양액을 SDS-PAGE로 분석 했을 때, PGA의 precursor, large subunit, 그리고 small subunit으로 보이는 protein band가 나타났으며, PGA가 soluble form의 precursor로 발현되어 processing을 거쳐서 large subunit과 small subunit으로 절단되기도 하고, 일부는 insoluble form의 precursor로 발현되기도 하는 것으로 생각된다. 유가배양시 온도변화 전략을 사용하여 고농도 배양에서 발현을 유도하였다. 온도변화 전략은 $37^{\circ}C$에서 $28^{\circ}C$를 거쳐 $22^{\circ}C$로 3단계로 변화시켰다. 이러한 전략으로 PGA활성은 19.6 U/mL이며 균체량은 600 nm에서 흡광도가 62까지 도달하였다.
Penicillin G amidase (PGA, benzylpenicillinaminohydrolase, EC 3.5.1.11) is industrially important enzyme which converts penicillin G to 6-aminopenicillanic acid (6-APA) and phenylacetic acid (PAA). The PGA in E. coli ATCC 11105 is secreted into the periplasm after removing signal sequences and becom...
Penicillin G amidase (PGA, benzylpenicillinaminohydrolase, EC 3.5.1.11) is industrially important enzyme which converts penicillin G to 6-aminopenicillanic acid (6-APA) and phenylacetic acid (PAA). The PGA in E. coli ATCC 11105 is secreted into the periplasm after removing signal sequences and becomes heterodimer which composed of two subunits, small subunit (24 kDa) and large subunit (65 kDa). In this study, the PGA gene was obtained from E. coli ATCC 11105 using PCR (polymerase chain reaction) technique. The active PGA was successfully secreated into periplasm in E. coli BL2 1(DE3) harboring pET-pga plasmid. The optimized fed-batch fermentation, consisting of a three-step shift of culture temperature from $37^{\circ}C$ to $22^{\circ}C$, gave a productivity of 19.6 U/mL with a cell growth of 62 O.D. at 600 nm.
Penicillin G amidase (PGA, benzylpenicillinaminohydrolase, EC 3.5.1.11) is industrially important enzyme which converts penicillin G to 6-aminopenicillanic acid (6-APA) and phenylacetic acid (PAA). The PGA in E. coli ATCC 11105 is secreted into the periplasm after removing signal sequences and becomes heterodimer which composed of two subunits, small subunit (24 kDa) and large subunit (65 kDa). In this study, the PGA gene was obtained from E. coli ATCC 11105 using PCR (polymerase chain reaction) technique. The active PGA was successfully secreated into periplasm in E. coli BL2 1(DE3) harboring pET-pga plasmid. The optimized fed-batch fermentation, consisting of a three-step shift of culture temperature from $37^{\circ}C$ to $22^{\circ}C$, gave a productivity of 19.6 U/mL with a cell growth of 62 O.D. at 600 nm.
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문제 정의
본 연구에서는 E. coli ATCC 11105에서 PCR(polymerase chain reaction)을 통해 증폭한 pga gene을 pET-24a(+) expression vector에 넣어 pET-pga plasmid를 제작하였고, 이것을 형질전환한 E. coli BL21(DE3)/pET-pga 균주에서 PGA의 과발현을 위한 배양 온도변화 전략을 모색하여 재조합 대장균의 유가배양시에 세포생육과 PGA생산을 극대화하여 얻은 결과를 보고한다.
제안 방법
50 mM 인산칼슘완충액 (pH 6.0)에 16% ACN(ACETO- NITRILE) 이 포함된 이동상으로 RP-18 역상 HPLC 컬럼 (Hypersil OSD, 5 |im, 250 mmx4.6 mm)을 사용하여 1 mL /min 속도로 분리하고 225 nm 파장에서 분리한 물질을 검출하였다.
Lysozyme/EDTA 처리는 French[6]및 Pierce 등[15]의 방법을 보완하여 실시하였다. 즉 원심 분리하여 얻은 세포를 20% sucrose와 0.
이 두 가지 primer를 사용하여 PCR 기기 (GeneAmp PCR system 2700, Applied Biosystems, CA, USA)로 941에서 30초간, 55℃에서 30초간, 72℃서 25초간을 1회전으로 하여 30회 반복하여 PCR을 수행하였다. PCR product를 Ndel, Xhol enzyme으로 절단하여 Geneclean Spin Kit(BIO 101)로 electroelution 하였다. pET- 24a(+) vector 역시 Ndel, Xhol enzyme으로 절단하여 5.
PCR을 수행하여 signal sequence를 포함하는 2.6kbp의 pga gene을 증폭하였고, 그 염기 서 열은 Fig. 1과 같다. pET-pga plasmid를 Ndel, Xhol enzyme으로 동시에 절단하고 agarose gel에 전기영동을 하였을 때, 5.
, Ohio, USA)로 즉정하였다. PGA의 분석은 SDS-PAGE(NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel , Invitrogen, USA)로 하였으며 coomassie brilliant blue R- 200(Biorad, USA)로 염색하여 카메라로 촬영하였다. PGA 활성은 배양액을 0.
coli JM109에 transformation 하였다. Transformant로부터 plasmid를 miniprep 하여 Ndel, Xhol enzyme으로 절 단하여 26 kbp의 insert와 5.2 kbp의 vector fragment를 획인하였다. 이 plasmid-f- pET-pga라고명명하고 다시 E.
따라서 본 실험 에서는 효소의 유도제로서 lactose를 사용하였다. 공정의 편의를 위하여 배양 초기에 lactose를 넣고 효소의 발현을 유도하였다. 회분배양의 결과는 포도당이 고갈된 20시간 이후에 효소의 발현이 시작되었으며 효소 생산이 꾸준히 증가하여 600nm에서 흡광도가 23일 때 최종 역가가 6U/mL이었다(Fig.
0을 유지하였다. 기질은 pH 고정에 기초한 포도당 농도 최소화 전략으로 첨가하였다. 배양액 내의 포도당 농도는 0.
상온에서 반응시키며 405 nm에서의 흡광도를 측정하여 PGA 활성을 분석하였다. 또 다른 방법으로는 2mM 인산완충액 (pH 8.0)에 5% penicillin G를 첨가한 기질에 본 배양액 일정량을 첨가하여 28P에서 경시적으로 소모된 기질의 양을 측정하였다. 활성 단위의 계산은 다음 공식과 같다.
발효는 대량배양의 조건인 30% 이상의 D.O.농도를 유지하기 위하여 적절한 교반속도, 통기조건, 온도하강 등의 조건을 최적화하였다. 최적의 조건에서 본균주의 성장과 PGA 생산은 우수하였다.
Escherichia coli(E, coli) ATCC 11105의 PGA는 24 kDa의 small subunit과 65 kD효의 large subimit으로 구성되어 있고, preursor polypeptide 에서 signal peptide와 spacer peptide 가 절단되어 활성을 가진 hetenxiimei가 형성된다. 본 연구에서는 E. coli ATCC 11105에서 PCR(polymerase chain reaction)^ 통해 증폭한 pga gene을 expression vector에 넣어 pET-pga plasmid를 제작하였고, 이것을 E. coli BL21 (DE3) 균주에 형질 전환하여 PGA를 발현하고 그 활성을 분석하였다. E.
사용된 균주의 생육도는 자외선-가시광선 분광광도계 (Shimadzu UV-265, Japan)를 사용하여 600 nm에서 측정하였다. 포도당의 농도는 당분석기 (YSI model 2700 STAT, Yellow Springs Instrument Inc.
발현되기도 하는 것으로 생각된다. 유가배양시 온도변화 전략을 사용하여 고농도 배양에서 발현을 유도하였다. 온도변화 전략은 37℃에서 28P를 거쳐 22℃로 3단계로 변화시켰다.
Forward primer는 pga gene의 translation initiation codon 부위에 상보적 이 고, 그 염기 서열은 GAG GAT CALATG AAA AAT AGA AAT(NdeI site 밑줄)이며, reverse primer는 pga gene의 translation stop codon 부위에 상보적 이고, 그 염기 서열은 TTT CGG CTC GAG TTA TCT CTG AAC GTG(Xhol site 밑줄)이였다. 이 두 가지 primer를 사용하여 PCR 기기 (GeneAmp PCR system 2700, Applied Biosystems, CA, USA)로 941에서 30초간, 55℃에서 30초간, 72℃서 25초간을 1회전으로 하여 30회 반복하여 PCR을 수행하였다. PCR product를 Ndel, Xhol enzyme으로 절단하여 Geneclean Spin Kit(BIO 101)로 electroelution 하였다.
4). 이러한 회분배양의 결과를 토대로 하여 생산성을 높이기 위하여 유가배양을 실시하였다. 초기에 포도당의 농도를 충분히 유지시켜 효소의 발현을 억제하고 세포성장이 일정 수준에 도달하였을 때 포도당의 농도를 0.
포도당의 농도는 당분석기 (YSI model 2700 STAT, Yellow Springs Instrument Inc., Ohio, USA)로 즉정하였다. PGA의 분석은 SDS-PAGE(NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel , Invitrogen, USA)로 하였으며 coomassie brilliant blue R- 200(Biorad, USA)로 염색하여 카메라로 촬영하였다.
대상 데이터
E. coli ATCC 11105로부터 게놈 DNA를 추출하예 17], pga 유전자의 공여체로 사용하였다. Forward primer는 pga gene의 translation initiation codon 부위에 상보적 이 고, 그 염기 서열은 GAG GAT CALATG AAA AAT AGA AAT(NdeI site 밑줄)이며, reverse primer는 pga gene의 translation stop codon 부위에 상보적 이고, 그 염기 서열은 TTT CGG CTC GAG TTA TCT CTG AAC GTG(Xhol site 밑줄)이였다.
, USA) 이였다. pET-24a(+) 벡터는 Novagen 사(USA)로부터 구입하였고 제한효소와 Taq 중합효소는 TaKaRa사(Japan>의 제품을 사용하였다. SDS-PAGE의 분자량 크기 및 DNA 크기 마커는 Promega사(USA) 제품이였다.
T7 promotor에 의한 유전자 발현을 유도하기 위하여 IPTG 또는 lactose를 사용하는데 [2], IPTG는가격의 문제로 효소를 산업적으로 대량 생산 할 때에는 일반적으로 사용하지 않는다. 따라서 본 실험 에서는 효소의 유도제로서 lactose를 사용하였다. 공정의 편의를 위하여 배양 초기에 lactose를 넣고 효소의 발현을 유도하였다.
본 실험에 사용한 균주는 E. coli ATCC 11105(KTCC), E. coli JM 109(Stratagene, USA), E. coli BL21(DE3) (Novagen Inc., USA) 이였다. pET-24a(+) 벡터는 Novagen 사(USA)로부터 구입하였고 제한효소와 Taq 중합효소는 TaKaRa사(Japan>의 제품을 사용하였다.
전 배양은 500 mL flask에 50mL 전배 양 배지를 넣고 본균주를 접종하여 배양하였으며 37℃, 250RPM 으로 5~7시간 배양하였다. 본배양은 5 L 발효기 (한국발효기, 한국)에서 2 L 배양액으로 시작하여 수행하였으며 전 배양균의 접종량은 1%였고 배양액의 pH는 7.0을 유지하였다. 기질은 pH 고정에 기초한 포도당 농도 최소화 전략으로 첨가하였다.
성능/효과
이때 pH 고정(stat), fucose 최소 유지 전략을 기본으로 수행하였다. Fig. 5는 pH-stat 방법을 이용하여 유가 배양한 결과로서 시간에 따른 균체 농도(O.D.600), 포도당 농도, PGA역가를 나타내었는데 최종 결과가 균체량은 600nm에서 흡광도가 62이며, PGA 역가는 19.6U/mL로 나타났다. 이는 Deak 등이 [5] 보고한 4.
3). PGA가 가용성 전구체로 생성되고 processing을 거쳐서 large subunit과 small subunit으로 성공적으로 절단되었으며, HPLC를 이용하여 penicillin G로부터 6-APM 생성되는 것을 확인하였다(결과제시 생략).
1과 같다. pET-pga plasmid를 Ndel, Xhol enzyme으로 동시에 절단하고 agarose gel에 전기영동을 하였을 때, 5.2kbp의 pET- 24a(+) vector fragment와 2.6 kbp의 pga gene insert frag- men를 확인할 수 있었다. pga gene의 PCR product는 pET- pga plasmid의 insert fragment와 전기영동 상에서 동일한 위치에서 나타났다(Fig.
본 실험에 사용된 균주로부터 얻은 periplasm획분을 SDS-PAGES. 분석하였을 때 PGA의 large subunit과 small subunit의 2개의 protein band가 나타났다(Fig. 3). PGA가 가용성 전구체로 생성되고 processing을 거쳐서 large subunit과 small subunit으로 성공적으로 절단되었으며, HPLC를 이용하여 penicillin G로부터 6-APM 생성되는 것을 확인하였다(결과제시 생략).
농도를 유지하기 위하여 적절한 교반속도, 통기조건, 온도하강 등의 조건을 최적화하였다. 최적의 조건에서 본균주의 성장과 PGA 생산은 우수하였다. T7 promotor에 의한 유전자 발현을 유도하기 위하여 IPTG 또는 lactose를 사용하는데 [2], IPTG는가격의 문제로 효소를 산업적으로 대량 생산 할 때에는 일반적으로 사용하지 않는다.
공정의 편의를 위하여 배양 초기에 lactose를 넣고 효소의 발현을 유도하였다. 회분배양의 결과는 포도당이 고갈된 20시간 이후에 효소의 발현이 시작되었으며 효소 생산이 꾸준히 증가하여 600nm에서 흡광도가 23일 때 최종 역가가 6U/mL이었다(Fig. 4). 이러한 회분배양의 결과를 토대로 하여 생산성을 높이기 위하여 유가배양을 실시하였다.
후속연구
6U/mL로 나타났다. 이는 Deak 등이 [5] 보고한 4.5 U/mL보다는 약 4배의 높은 발현을 보여주었고 PGA는 세포질에서 periplasm 영역으로 성숙한 형태로 성공적으로 분비 발현되어 완전한 활성을 나타낸 것으로, 이는 나중에 PGA의 분리, 정제 시에 활용할 수 있을 것이다. 재조합 plasmid가 함유된 본 균주를 집적 배양하는 가운데 세포분해 (cell lysis) 현상이 관찰되었는데 이는 온도를 저하 시킬 때 공통적으로 발생하였다.
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