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문제 정의
- 본 연구에서는 상기의 예비 실험 결과를 토대로 하여 홍삼과 보이차, 노팔선인장을 포함하는 항비만 혼합원료를 개발하기 위하여 이들을 2종 또는 3종으로 혼합한 원료를 농도 별로 동물에 투여하면서 체중, 혈중 지질 분석, 복부 및 기타지방 조직, 비만에 관련된 몇 가지 생화학적 지표를 조사하였고, 간 기능과 신장, 조혈 기능을 나타내는 생화학적 지표의 조사를 통하여 항비만 효과가 우수하고 부작용이 없는 최적의 혼합 원료와 적정 섭취 농도를 설정하고자하였다.
- 시험물질 투여에 의한 부작용을 관찰하기 위하여 간, 신장, 조혈 작용 등에 미치는 영향을 조사하였다. 간 기능의 바이오마커인 AST, ALT 및 담도계와 신장 기능의 바이오마커인 ALP, T-BIL, BUN을 측정한 결과 Table 4에서와 같이 AST와 ALT는 정상식이군에 비해 고지방식이군에서 증가하는 경향을 나타내었으나 오차 범위가 크고 통계적인 유의성은 나타나지 않았다.
제안 방법
- 분리한 혈청을 이용하여 triglyceride, HDL(high density lipoprotein), LDL(low density lipoprotein), total cholesterol, AST(aspartate amino transferase), ALT(alanine aminotransferase), ALP(alkaline phosphatase), T-BIL(total bilirubin), BUN(blood urea nitrogen)을 혈청자동분석기 (Hitachi 7060, Japan)를 이용하여 측정하였고, 혈청 내 렙틴 및 혈장 내 인슐린 함량은 rat leptin 및 insulin immunoassay kit(R&D Systems, Inc., MN, USA)로 측정하였다.
- 시험군 및 식이투여: 실험군은 Table 1과 같이 정상식이군, 고지방식이 대조군, 고지방식이와 DM1 100, 300, 500 mg/kg 투여군, 고지방식이와 DM2 100, 300, 500 mg/kg 투여군으로 구분하였다. 시험군은 고지방식이로 8주간 비만을 유도하여 체중이 증가한 흰쥐를 난괴법으로 12～14마리씩 분류하고, 8주간 고지방식이를 공급하면서 시험물질을 생리식염수에 용해하여 1일 1회 강제 경구 투여하였으며 정상식이군과 고지방식이 대조군은 시험물질을 제외한 생리식염수를 투여하였다.
- 시험군 및 식이투여: 실험군은 Table 1과 같이 정상식이군, 고지방식이 대조군, 고지방식이와 DM1 100, 300, 500 mg/kg 투여군, 고지방식이와 DM2 100, 300, 500 mg/kg 투여군으로 구분하였다. 시험군은 고지방식이로 8주간 비만을 유도하여 체중이 증가한 흰쥐를 난괴법으로 12～14마리씩 분류하고, 8주간 고지방식이를 공급하면서 시험물질을 생리식염수에 용해하여 1일 1회 강제 경구 투여하였으며 정상식이군과 고지방식이 대조군은 시험물질을 제외한 생리식염수를 투여하였다.
- 시험기간 중 동물실의 온·습도를 자동측정기로 매 30분마다 측정하고, 조도 등의 환경조건을 정기적으로 측정하여 일정한 상태를 유지하였다.
- 시험동물 사육: 시험동물 사육환경은 온도 20.7∼21.2o C,상대습도 49.9∼54.2%, 환기횟수 10∼15회/시간, 조명시간 12시간(오전8시∼오후8시), 조도 200∼300 Lux의 동물사육실에서 사료와 음용수를 공급하여 순화 및 시험기간 동안 격리 사육하였다.
- 실험동물을 식이로 비만을 유도한 후 시험물질을 투여하였다. 고지방식이로 8주간 비만을 유도한 결과 체중증가는 Fig.
- 간조직 내 지방질의 축적을 확인하기 위해서 간을 적출하여 액체질소로 동결하여 -70o C deep freezer에 보관하였다. 적출하여 고정한 간조직을 동결전편 슬라이드 표본을 제작한 다음, Oil-Red O stain법(20)을 이용하여 지방질의 분포를 광학현미경으로 조사하고 지방과립의 크기는 3점(1점: 핵보다 작다, 2점: 핵의 크기, 3점: 핵보다 크다), 지방과립의 분포는 6점(2점: Zone 1, 4점: Zone 2, 6점: Zone 3), 지방과립의 분포가 문맥에서 문맥으로 이어질 때는 1점, 문맥에서 중심정맥으로 이어질 때는 2점으로 지질침착도를 평가하였다(21).
- 채취한 지방조직의 무게를 조사하기 위하여 혈액을 채취한 후 부고환주위지방(좌/우), 내장지방, 신장주위지방(좌/우) 및 갈색지방을 조심스럽게 적출하여 생리식염수로 세척한 다음 여과지로 수분을 제거한 후 지방조직의 중량을 측정하였다.
- 채혈한 전혈을 항응고제 EDTA-2K가 함유된 채혈튜브에 넣어 자동혈액분석기를 이용하여 혈액학적 WBC(white blood cell), RBC(red blood cell), Hb(hemoglobin) 및 HCT (hematocrit)을 측정하였다.
- 체중은 시험물질 투여 개시 직전 및 투여 개시 후 주 1회, 식이섭취량은 주 2회씩 8주간 측정하였다.
대상 데이터
- 홍삼 물추출물은 한국인삼공사에서 2006년에 제조한 6년근 홍삼 물엑기스를 분무건조하여 사용하였고, 보이차 추출물은 중국 운남성에서 2006년에 제조한 보이차를 열수로 추출하여 분무건조한 분말로 B사 제품을 구입하여 사용하였다. 노팔선인장분말은 남아메리카 산 노팔선인장을 건조 분쇄한 것으로 K사 제품을 구입하여 사용하였다. 본 연구에 사용한 시험물질 DM1은 홍삼추출물과 보이차추출물, 노팔 선인장(10:45:45, 무게비), DM2는 홍삼추출물과 보이차추출물(10:90, 무게비)을 각각 혼합하여 사용하였다.
- 노팔선인장분말은 남아메리카 산 노팔선인장을 건조 분쇄한 것으로 K사 제품을 구입하여 사용하였다. 본 연구에 사용한 시험물질 DM1은 홍삼추출물과 보이차추출물, 노팔 선인장(10:45:45, 무게비), DM2는 홍삼추출물과 보이차추출물(10:90, 무게비)을 각각 혼합하여 사용하였다.
- , D12451, 칼로리 구성: 지방 45%, 탄수화물 35%, 단백질 20%)를 사용하였다. 비교 시험용 정상식이는 Purina Rodent Chow(Purina Korea Inc., Product No. 38057, 칼로리 구성: 지방 12%, 탄수화물 63%, 단백질 25%)를 사용하였다.
- 사료: 비만 유도를 위한 고지방식이로는 AIN-76A(Research Diets, Inc., D12451, 칼로리 구성: 지방 45%, 탄수화물 35%, 단백질 20%)를 사용하였다. 비교 시험용 정상식이는 Purina Rodent Chow(Purina Korea Inc.
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시험동물 및 시험군
시험동물: 시험동물은 생후 3주령 수컷 흰쥐(Sprague Dawley Rat, CrjBgi:CD-IGS Strain)를 (주)오리엔트바이오 에서 구입하여 1주일 동안 적응시킨 후 사용하였다.
- 홍삼 물추출물은 한국인삼공사에서 2006년에 제조한 6년근 홍삼 물엑기스를 분무건조하여 사용하였고, 보이차 추출물은 중국 운남성에서 2006년에 제조한 보이차를 열수로 추출하여 분무건조한 분말로 B사 제품을 구입하여 사용하였다. 노팔선인장분말은 남아메리카 산 노팔선인장을 건조 분쇄한 것으로 K사 제품을 구입하여 사용하였다.
데이터처리
- 모든 시험결과는 평균과 표준오차로 표시하였으며, 대조군과 시험군과의 비교는 Student's t-test 또는 Fisher's exact test를 하여 p값이 5% 미만일 때를 통계학적으로 유의성이 있다고 판정하였다.
성능/효과
- 31 g에 비하여 다소 감소하는 결과를 나타내었다. 1일 체중증가량을 1일 식이섭취량으로 나눈 후 백분율로 계산한 식이효율은 고지방식이군의 10.78%에 비하여 DM1투여군은 8.74～5.57%, DM2투여군은 7.53～1.91%를 나타내어 농도 의존적으로 유의성 있는 감소를 나타내었고, DM1보다 DM2투여군에서 식이효율이 더 낮아서 DM2가 체중증가를 억제하는 효과가 높았다.
- 시험물질 투여에 의한 부작용을 관찰하기 위하여 간, 신장, 조혈 작용 등에 미치는 영향을 조사하였다. 간 기능의 바이오마커인 AST, ALT 및 담도계와 신장 기능의 바이오마커인 ALP, T-BIL, BUN을 측정한 결과 Table 4에서와 같이 AST와 ALT는 정상식이군에 비해 고지방식이군에서 증가하는 경향을 나타내었으나 오차 범위가 크고 통계적인 유의성은 나타나지 않았다. 또한 DM1과 DM2 투여군에서 AST 및 ALT 수치가 고지방식이군에 비해 감소하는 경향이었고 DM1 500 mg/kg을 제외하고는 정상식이군의 수준으로 낮아져서 DM1과 DM2의 투여로 간 기능을 저하시키지 않는 것으로 사료된다.
- 실험동물을 식이로 비만을 유도한 후 시험물질을 투여하였다. 고지방식이로 8주간 비만을 유도한 결과 체중증가는 Fig. 1에서와 같이 고지방식이군에서 559.3 g으로 정상식이군의 482.3 g보다 77.0 g 증가하여 고지방식이 공급으로 체중을 현저히 증가함을 알 수 있었다. 시험물질 투여기간인 8주간 실험동물의 체중변화는 고지방식이군은 141.
- 05). 그러나 그 외의 시험군에서는 유의적인 결과를 나타내지 않았으므로 본 시험물질은 혈중 콜레스테롤에는 큰 영향을 미치지 않는 것으로 생각되었다.
- 31 g으로 감소하였고, DM2 100, 300, 500 mg/kg 투여군에서는 17 g, 16 g, 14 g으로 감소하여 DM1, DM2 투여로 농도의존적인 감소를 나타내었으며, DM1 500 mg/kg과 DM2 300, 500 mg/kg 투여에서는 1% 수준에서 통계적 유의성을 나타내었고 신장주위지방의 경우에도 같은 결과를 나타내었다. 내장지방의 경우에는 DM1과 DM2의 시료 투여에 의한 지방증가량의 감소가 더욱 뚜렷하여 DM1은 300, 500 mg/kg 투여군에서, DM2는 100, 300, 500 mg/kg 투여군에서 1% 수준의 통계적 유의성을 나타내어 시험물질이 지방 축적을 감소하는 효과가 뚜렷함을 확인하였다. 갈색지방 중량도 DM2 투여군에서 유의적인 감소를 나타내었다.
- 갈색지방 중량도 DM2 투여군에서 유의적인 감소를 나타내었다. 따라서 시험물질 DM1과 DM2 투여로 체지방 축적을 대표하는 부고환지방 및 내장지방, 신장주위지방에서 농도 의존적으로 감소하여 시험물질이 체지방량 감소, 특히 복부지방 감소에 매우 효과적인 소재임을 알 수 있었고 이것은 체중증가 억제 효과와 일치하였다.
- 렙틴은 에너지가 과잉 축적될 경우 생성이 증가하여 비만지표로 사용될 수 있으며(24) 체중 및 체지방과 상관관계가 높다(25). 따라서 시험물질의 투여로 혈청 렙틴 농도가 감소한 것은 체중 및 지방 조직량의 결과와 일치하는 것으로 체중 및 지방 조직량의 감소에 기인된 것으로 판단되었다.
- 간 기능의 바이오마커인 AST, ALT 및 담도계와 신장 기능의 바이오마커인 ALP, T-BIL, BUN을 측정한 결과 Table 4에서와 같이 AST와 ALT는 정상식이군에 비해 고지방식이군에서 증가하는 경향을 나타내었으나 오차 범위가 크고 통계적인 유의성은 나타나지 않았다. 또한 DM1과 DM2 투여군에서 AST 및 ALT 수치가 고지방식이군에 비해 감소하는 경향이었고 DM1 500 mg/kg을 제외하고는 정상식이군의 수준으로 낮아져서 DM1과 DM2의 투여로 간 기능을 저하시키지 않는 것으로 사료된다. 담도계 및 신장 기능의 이상 유무를 확인할 수 있는 지표인 ALP, T-BIL 및 BUN의 농도를 조사한 결과는 Table 4에서와 같이 모든 투여군에서 고지방 식이군과 비교해 유의적인 차이가 관찰되지 않아서 담도계 및 신장 기능에 이상을 초래하지 않는 것으로 판단된다.
- 본 실험실에서는 체중조절 효과가 우수하고, 부작용이 없는 천연소재를 개발하기 위하여 문헌 조사를 통하여 후보 소재 7종을 선발하였으며, 이들 소재들을 조합한 복합물 3종 등 10종을 일정 농도로 동물에 투여하였을 때 홍삼과 보이차, 노팔선인장 투여군에서 고지방식이군에 비하여 체중, 혈중 지질, LDL 콜레스테롤, 중성지질 농도가 감소하였고, 지방조직의 무게가 감소하는 결과를 얻었으며, 이 혼합원료가 개별 원료 투여 시보다 효과가 우수하여 상승효과가 있었음을 확인하고 특허 출원한 바 있다(출원번호: 10-2006-0115006).
- 4와 같다. 부고환주위지방량은 고지방식이군에서 20.10 g으로 정상식이군의 12.45 g에 비하여 161% 증가한 반면 DM1 100, 300, 500 mg/kg 투여군에서는 18.27 g, 16.91 g, 15.31 g으로 감소하였고, DM2 100, 300, 500 mg/kg 투여군에서는 17 g, 16 g, 14 g으로 감소하여 DM1, DM2 투여로 농도의존적인 감소를 나타내었으며, DM1 500 mg/kg과 DM2 300, 500 mg/kg 투여에서는 1% 수준에서 통계적 유의성을 나타내었고 신장주위지방의 경우에도 같은 결과를 나타내었다. 내장지방의 경우에는 DM1과 DM2의 시료 투여에 의한 지방증가량의 감소가 더욱 뚜렷하여 DM1은 300, 500 mg/kg 투여군에서, DM2는 100, 300, 500 mg/kg 투여군에서 1% 수준의 통계적 유의성을 나타내어 시험물질이 지방 축적을 감소하는 효과가 뚜렷함을 확인하였다.
- 7 g 증가하여 고지방식이 공급으로 체중이 계속적으로 증가하였다. 시험물질 DM1 투여군에서는 8주 후에 100, 300, 500 mg/kg 투여에서 각각 109.1 g, 75.3 g, 73.3 g의 체중이 증가하여 고지방식이군의 77.1～51.8% 수준을 나타내었고, DM2 투여군에서는 100, 300, 500 mg/kg 투여 시 각각 91.5 g, 64.3 g, 22.8 g의 체중증가량을 나타내어 고지방식이군의 64.7～16.1% 수준을 나타내었다. 이들의 결과는 통계적으로 유의하였으며(p<0.
- 0 g 증가하여 고지방식이 공급으로 체중을 현저히 증가함을 알 수 있었다. 시험물질 투여기간인 8주간 실험동물의 체중변화는 고지방식이군은 141.4 g 증가한 반면 정상식이군은 114.7 g 증가하여 고지방식이 공급으로 체중이 계속적으로 증가하였다. 시험물질 DM1 투여군에서는 8주 후에 100, 300, 500 mg/kg 투여에서 각각 109.
- 이들의 결과는 통계적으로 유의하였으며(p<0.01), 농도 의존성을 보였고 DM1보다 DM2가 체중증가 억제 효과가 더욱 높았다.
- WBC의 경우에는 시험군간에 유의적인 농도의 차이를 나타내지 않았으며, RBC의 경우에는 헤모글로빈(Hb)의 농도에서 시험물질 투여군이 대체로 증가하는 경향이었으며 DM1 500 mg/kg와 DM2100, 500 mg/kg에서는 통계적인 유의성을 나타내어 조혈 기능을 증가시키는 것으로 사료된다. 이상의 결과를 종합해보면 시험물질의 투여는 간 독성이나 신장 독성을 일으키지 않고 혈액이나 면역체계에도 나쁜 영향을 나타내지 않아 부작용이 없는 것으로 판단된다.
- 01). 일반적으로 고지방식이를 섭취하면 정상식이에 비하여 중성 지질의 농도가 높아질 것으로 생각되나 본 실험에서는 이와 상반되는 결과를 얻었는데, 이는 실험에 사용한 고지방식이가 lard fat 함량이 20%인 식이로서, lard fat 함량이 높은 식이 또는 옥수수 오일 함량이 높은 고지방식이를 흰쥐에 투여 시 혈청 TG함량을 감소시킨다(22,23)는 보고와 일치하였으며, 식이지방의 종류에 따라서 중성지방의 축적에 다른 영향을 주는 것으로 생각된다. 총콜레스테롤 및 고밀도 콜레스테롤, 저밀도 콜레스테롤 농도는 정상식이군에 비하여 고지방식이군에서 증가하였고, 고지방식이와 함께 시험 물질을 투여했을 때에는 다소 감소하는 경향이었으며 DM2100 mg/kg 투여군에서는 총콜레스테롤 함량이 통계적으로 유의성 있게 감소하였다(p<0.
- 식이섭취량은 Table 2에서와 같이 고지방식이군이 정상식이군에 비해 섭취량이 적은 반면 식이효율은 높게 나타났는데, 이는 고지방식의 칼로리가 높아서 나타난 현상인 것으로 보인다. 일일 식이섭취량은 시험물질 DM2 300 mg/kg과 500 mg/kg 투여군에서 각각 21.69 g 및 20.09 g으로, DM1300 mg/kg에서 21.37 g으로 고지방식이군의 23.31 g에 비하여 다소 감소하는 결과를 나타내었다. 1일 체중증가량을 1일 식이섭취량으로 나눈 후 백분율로 계산한 식이효율은 고지방식이군의 10.
- 총 점수는 정상식이군의 3.58에서 고지방식이군은 9.54점으로 증가하였으며, DM1 투여군에서는 8.38～8.85, DM2 투여군에서는 6.83～9.77점으로 DM2 500 mg/kg 투여군에서만 통계적인 유의성(p<0.05)있는 감소효과를 나타내어 DM2를 고농도로 투여 시 고지방식이에 의한 간 조직내 지질침착도를 완화할 수 있을 것으로 판단된다.
- 총콜레스테롤 및 고밀도 콜레스테롤, 저밀도 콜레스테롤 농도는 정상식이군에 비하여 고지방식이군에서 증가하였고, 고지방식이와 함께 시험 물질을 투여했을 때에는 다소 감소하는 경향이었으며 DM2100 mg/kg 투여군에서는 총콜레스테롤 함량이 통계적으로 유의성 있게 감소하였다(p<0.05).
- 혈청 렙틴 농도는 Fig. 3(A)에서와 같이 일반식이군이 41.48 ng/mL이고 고지방식이 대조군은 43.09 ng/mL로 통계적으로 유의성 있는 차이가 없었지만, DM1 500 mg/kg 투여군은 30.27 ng/mL, DM2 100, 300, 500 mg/kg 투여군은 각각 33.21, 30.68, 28.83 ng/mL로 고지방식이 대조군에 비해 유의하게 렙틴 농도가 감소하였다. 렙틴은 에너지가 과잉 축적될 경우 생성이 증가하여 비만지표로 사용될 수 있으며(24) 체중 및 체지방과 상관관계가 높다(25).
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