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제안 방법
- 0)/300mM NaCl/8M urea]에 용해시킨 후 원심분리하여 상등액을 Ni-NTN column에 loading 하여 wash buffer[denaturing binding buffer+20mM imidazole]로 세척하고 elution buffer[denaturing binding buffer+100 or 250mM imidazole]로 Ni-resin에 결합되었던 peptides를 분리시켰다. Recombinant pALS 정제의 각 단계에서 얻어진 시료는 SDS-PAGE한 후 Coomassie staining으로 용해 정제의 여부와 순도를 판정하였다.
- 그러나 선행연구가 종료된 후 pALS expression vector에삽입된 pALS coding sequence를 조사한 결과 6 개의 bases에서 error가 발생하였고 이 중 2개의 codons에서 mis-sense errors가 확인되었다. 따라서 본 연구에서는 site-directed mutagenesis 방법으로 이들 2개의 mis-sense codons를 바로잡아 full-length pALS cDNA를 합성하여 pET- 28a(+) plasmid expression vector에 삽입시키고 E. coli cell에서 발현시켜 pALS peptide를 생산하고 정제하였다.
- 본 연구에서는 ‘site-directed mutagenesis’ 방법으로 pALS의 올바른 coding sequence를 합성하여 ‘insert DNA’의 마지막 codon 다음에 ‘His-tag’ sequence가 위치한 pET- 28a(+) plasmid expression vector에 삽입하였다. 본 expression construct는 E. coli BL21(DE3) 세포에서 ‘induction’ 시켰고, 발현된 유전자재조합(recombinant) peptide는 Ni-affinity chromato- graphy로 정제하였다. 이렇게 affinity chro- matography로 정제된 peptide는 SDS-PAGE에서 66kDa 위치에 single band를 나타냄으로써 recombinant pALS의 예상된 질량과 일치하였다.
- 그러나 본 expression construct의 pALS coding sequence 에는 PCR error로 추정되는 원인으로 말미암아 2개의 bases에서 mis-sense mutation이 일어난 것이 발견되었다. 본 연구에서는 ‘site-directed mutagenesis’ 방법으로 pALS의 올바른 coding sequence를 합성하여 ‘insert DNA’의 마지막 codon 다음에 ‘His-tag’ sequence가 위치한 pET- 28a(+) plasmid expression vector에 삽입하였다. 본 expression construct는 E.
- 이때 NH2-terminal coding sequence와 COOH-terminal coding sequence에는 위와 같이 BamH I & Hind Ⅲ restriction sites를 부착하여 COOH- terminal 부위에 6x-His-tagged된 pET-28a(+) plasmid expression vector(Novagen, La Jolla, CA, USA)의 해당 sites에 삽입하고 insert DNA sequence를 확인하였다.
- 2). 이와 같은 결과는 발현된 pALS peptide가 불용성의 inclusion body를 형성하여 Ni column에 결합하지 않았음을 의미하므로 다음 실험에서는 induction된 E. coli cell을 denaturing condition 하에서 cell lysate pellet 용해, Ni column에 loading, washing & elution하였다.
이론/모형
- 1). 이들 2개의 non-conservative errors 를 교정하기 위해 아래와 같은 2 sets의 DNA primers를 이용하여 전술(Choi 등, 2004)한 바와같이 site-directed mutagenesis 방법으로 coding sequence를 교정하였다.
- 제작된 expression construct는 전술(Lee 등, 2005)한 바와 같이 E. coli BL21(DE3) cell에 ‘transformation’ 시켜 37℃ 혹은 16℃에서 ‘induction’ 하여 유전자재조합(recombinant) pALS 를 발현시킨 후 세포를 ‘sonication’ 방법으로 용해시켰다. ‘Cell lysate’는 원심분리하여 상등액은 ‘non-denaturing’ condition 하에서 Ni- NTN column에 제조자(Biorad, Hercules, CA, USA)의 지시에 따라 ‘loading’한 후 imidazole를 함유하는 buffer로 ‘elution’시켰다.
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