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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 산양유 지방의 조성 및 분해특성이 이취 및 산패취의 발생에 미치는 영향을 조사하기 위하여 산양유의 LPL 활성, 저장기간 및 효소처리에 따른 지방분해를 유리지방산 측정 방법으로 시험하고 유리지방산 생성량과 산양유 이취 강도와의 상관성을 조사하였으며, 또한 지방산의 조성을 분석하고 산양유 이취 발생과의 상관성을 비교하였다.
제안 방법
- Cartier와 Chilliard의 방법(1986)을 일부 변형시킨 방법으로 측정하였으며, triolein 유화액은 glycerol 10ml에 glyceryl trioleate(Sigma) 600 mg과 phosphatidyl choline(Sigma) 36mg을 혼합하여 균질기(Polytron PT 2100, Kinematica) 로실온에서 5분간 균질하고, 1.4 ml씩 tube에 분주 후 냉장보관 하였다. 혈청은 유산양 혈액으로부터 응고물을 제외한 혈청을 수거하고 60 로 45분간 가열하여 효소를 불활성화시킨 후 냉동보관 하였다.
- Hexanediethyl ether(1:1, v/v)를 5ml씩 2회 주입하고 30분 동안 방치하였다. Column 내에서 건조된 alumina를 10ml test tube에 옮겨 6% formic acid-diisopropyl ether 1ml를 첨가하고, 실온에서 2, 000×g로 5분간 원심분리하여 상등액을 GC 분석용 시료로 하였다. GC의 분석조건은 Table 1과 같으며, 유리지방산의 정성 및 정량은 internal standard와 각각 표준지방산(Fluka, C4:0, 19215; C6:0, 21529; C8:0, 21639; C10:0, 21409; C12:0, 61609; C14:0, 70079; C16:0, 76119; C18:0, 85679; C18:1, 75090)의 retention time과 peak area 를 적용하여 비교 분석하였다.
- Column 내에서 건조된 alumina를 10ml test tube에 옮겨 6% formic acid-diisopropyl ether 1ml를 첨가하고, 실온에서 2, 000×g로 5분간 원심분리하여 상등액을 GC 분석용 시료로 하였다. GC의 분석조건은 Table 1과 같으며, 유리지방산의 정성 및 정량은 internal standard와 각각 표준지방산(Fluka, C4:0, 19215; C6:0, 21529; C8:0, 21639; C10:0, 21409; C12:0, 61609; C14:0, 70079; C16:0, 76119; C18:0, 85679; C18:1, 75090)의 retention time과 peak area 를 적용하여 비교 분석하였다.
- Chromatography column(5cm×15cm) 에 glass wool을 일정량 넣은 후, 4%의 물을 가하여 불활성화 시킨 alumina 1g을 넣고 위에서 만들어진 용액을 column에 흘려주었다. Hexanediethyl ether(1:1, v/v)를 5ml씩 2회 주입하고 30분 동안 방치하였다. Column 내에서 건조된 alumina를 10ml test tube에 옮겨 6% formic acid-diisopropyl ether 1ml를 첨가하고, 실온에서 2, 000×g로 5분간 원심분리하여 상등액을 GC 분석용 시료로 하였다.
- Lipase 종류별 산양유 지방의 분해특성을 확인하기 위해 산양시유를 각 50ml씩 사용하였으며, 시료를 37 로 유지시킨 상태에서 효소 별 적정농도의 효소용액을 첨가하고 30분 동안 반응시켰다. 효소분해시킨 시료는 즉시 75 에서 15분간 가열하여 효소를 불활성화 시켰으며, 얼음에 꽂아 급냉한 후 CSM 및 GC 분석용 시료로 하였다.
- 효소분해시킨 시료는 즉시 75 에서 15분간 가열하여 효소를 불활성화 시켰으며, 얼음에 꽂아 급냉한 후 CSM 및 GC 분석용 시료로 하였다. Lipase 종류별 지방분해 특성은 각 지방산별 유리지방산의 증가량을 비교하여 나타내었다.
- butyric acid를 포함한 저급 유리지방산을 비교적 높은 비율로 분해 생성하였다. 이는 후 사용하였다. 각각의 효소용액은 37 산양유에 임의 농도로 첨가하여 30분 동안 반응시킨 다음 생성된 유리지방산량을 copper soap method로 측정하고, 그 값이 유사한 수준을 나타내는 효소 농도를 균일한 활성을 가지는 것으로 표준화하여 첨가량을 결정하였다.
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7. 관능검사
관능평가는 산양유 이취에 대하여 시험하였으며, 산양유 섭취경험이 있는 성인 10명을 대상으로 이취의 유무 또는 강도에 대하여 5점 평가법 (매우 강하다(5)~매우 약하다(1))으로 실시하였다.
- 유지방 분리는 Feng 등(2004)에 의한 방법으로 하였다. 냉장원유 30ml를 4 에서 17, 000× g으로 30분 동안 원심분리하고 상부 크림층을 microtube에 분리 회수하여 실온에서 30분간 방치한 다음, 실온에서 19, 300×g으로 20분 동안 원심분리하여 상부 투명한 지방층을 분리하고 갈색 병에 N2와 함께 담아 20 로 냉동 보관하면서 시료로 사용하였다. 지방산 methyl ester 는 ISO-IDF(2002) 방법에 따라 준비하였다.
- 산양유 원유를 냉장 저장할 때에 일어나는 자발적 지방분해를 조사하였다. 이를 위하여 산양유 원유를 4 에서 24시간과 48시간 냉장 저장하는 동안 유리지방산의 변화를 GC로 조사한 결과는 Fig.
- 산양유의 유도적 지방분해를 측정하기 위해, 살균 및 균질 처리된 시유에 원유를 교반 하여 혼합할 때에 원유의 LPL 활성에 의해 시유 내지방구를 분해하여 유리지방산이 생성되는 양상을 조사하였다. 시유 내 유지방구의 지방분해에 의한 유리지방산의 증가 형태를 확인하기 위하여 시유 80%에 원유를 20% 혼합한 후 교반하고 37 에서 30분 동안 반응시킨 후의 시험 구를 GC로 측정한 결과는 Fig.
- 지방산 조성은 GC(Varian star 3400 CX) 로분석하였으며, GC의 분석조건은 Table 2와 같다. 표준지방산(Fluka)은 methyl butyrate(19358), methyl caproate(21599), methyl caprylate(21719), methyl caprate(21479), methyl laurate(61689), methyl myristate(70129), methyl palmitate(76159), methyl stearate(85769), methyl oleate(75160), methyl linoleate(62280), methyl linolenate(62200) 를 일정 비율로 혼합하여 n-heptane에 용해시킨후 분석하여 retention time 및 함량(%)과 peak area 비율을 확인하였고, 이를 시료의 피크 면적에 적용하여 총지방산 중의 백분율(%)로 표시하였다.
- 표준지방산(Fluka)은 methyl butyrate(19358), methyl caproate(21599), methyl caprylate(21719), methyl caprate(21479), methyl laurate(61689), methyl myristate(70129), methyl palmitate(76159), methyl stearate(85769), methyl oleate(75160), methyl linoleate(62280), methyl linolenate(62200) 를 일정 비율로 혼합하여 n-heptane에 용해시킨후 분석하여 retention time 및 함량(%)과 peak area 비율을 확인하였고, 이를 시료의 피크 면적에 적용하여 총지방산 중의 백분율(%)로 표시하였다.
- 효소분해시킨 시료는 즉시 75 에서 15분간 가열하여 효소를 불활성화 시켰으며, 얼음에 꽂아 급냉한 후 CSM 및 GC 분석용 시료로 하였다. Lipase 종류별 지방분해 특성은 각 지방산별 유리지방산의 증가량을 비교하여 나타내었다.
대상 데이터
- Pseudomonas fluorescens lipase(Fluka), Candida rugosa lipase(Sigma), 및 calf lipase(Lipase powder L1, New England Cheesemaking Supply Company) 등 분말효소를 각각 PBS(phosphate buffered saline)에 100~200 units의 농도로 용해한 후 사용하였다. 각각의 효소용액은 37 산양유에 임의 농도로 첨가하여 30분 동안 반응시킨 다음 생성된 유리지방산량을 copper soap method로 측정하고, 그 값이 유사한 수준을 나타내는 효소 농도를 균일한 활성을 가지는 것으로 표준화하여 첨가량을 결정하였다.
- 개체유와 집합유는 강원도 일원에 소재하는 4개 농장으로부터 3월에서 11월에 이르는 9개월 동안 수거하였으며, 집합유와 시유는 2개 유가 공장으로부터 제공받았다.
이론/모형
- 유리지방산 함량은 Modified copper soap solvent extraction method(Shipe 등, 1980)에 따라 측정하였다. 시료 75 를 취하고 0.
- 유리지방산의 조성 및 함량 변화는 Deeth 등 (1983)의 방법에 따라 GC(Varian star 3400 CX, USA)로 분석하였다.
- 유지방 분리는 Feng 등(2004)에 의한 방법으로 하였다. 냉장원유 30ml를 4 에서 17, 000× g으로 30분 동안 원심분리하고 상부 크림층을 microtube에 분리 회수하여 실온에서 30분간 방치한 다음, 실온에서 19, 300×g으로 20분 동안 원심분리하여 상부 투명한 지방층을 분리하고 갈색 병에 N2와 함께 담아 20 로 냉동 보관하면서 시료로 사용하였다.
- 유지방 함량은 시료 11ml를 취하여 Gerber 법 (Marshall, 1993)으로 측정하였으며, 총고형분은 시료 약 5 g을 취하여 상압 가열건조법(국립수의과학검역원, 2007)으로 측정하였다.
- 냉장원유 30ml를 4 에서 17, 000× g으로 30분 동안 원심분리하고 상부 크림층을 microtube에 분리 회수하여 실온에서 30분간 방치한 다음, 실온에서 19, 300×g으로 20분 동안 원심분리하여 상부 투명한 지방층을 분리하고 갈색 병에 N2와 함께 담아 20 로 냉동 보관하면서 시료로 사용하였다. 지방산 methyl ester 는 ISO-IDF(2002) 방법에 따라 준비하였다. 시험관에 지방시료 20mg과 n-heptane(Riedel-de Haën) 1ml를 담아 혼합한 다음, 2M CH3NaO (Fluka)을 함유한 methanol 용액의 transesterification reagent를 0.
성능/효과
- 3과 같다. Butyric acid는 착유 당일 0.43ppm에서 저장 24시간 후에는 1.65 ppm으로 약 284% 증가하였으며, caproic acid는 0.68ppm에서 1.52ppm으로 124%, caprylic acid 는 0.94ppm에서 1.61ppm으로 71%, 그리고 capric acid는 1.80ppm에서 3.17ppm으로 76% 증가하는 등 저급 유리지방산(C4:0~C10:0) 함량은 3.85ppm에서 7.95ppm으로 206% 증가하였다. 이에 비하여 lauric acid는 0.
- lipase와 차이를 보였다. Candida rugosa lipase의 경우는 저급 유리지방산이 84.1ppm으로 6배 증가시킨데 비하여 중급 및 고급 유리지방산은 521ppm으로 34배 증가시켰으며, 저급 유리지방산 대비 중급 및 고급 유리지방산의 함량 비율은 1:6.2를 나타내었다. 또한 Pseudomonas fluorescens lipase는 저급 유리지방산이 198 ppm으로 14배 증가시킨데 비하여 중급 및 고급 유리지방산은 2, 470ppm으로 162배 증가시켰으며, 저급 유리지방산 대비 중급 및 고급 유리지방산의 함량 비율이 1:12.
- 산양 혈청을 포함하는 기질 용액을 일정 비율로 산양유에 혼합하고 37 에서 1시간 동안 처리하여 분해된 유리지방산 함량을 비교한 결과 LPL 활성과 산양유 이취는 그림과 같이 일정 수준의 상관성을 나타내었다. LPL 활성과 산양유 이취는 r=0.5777으로 유의적인 상관관계를 보였으며 P<0.01의 수준에서 유의성을 보였다.
- 산양유 원유를 24시간 냉장저장 하는 동안에 저급 유리지방산(C4:0~C10:0)은 106% 증가하였으며 중급 및 고급 유리지방산(C12:0~C18:1)은 203%로 높은 증가율을 보였다. 균질한 시유에 원유를 첨가하여 반응할 때에 저급 유리지방산은 22% 증가되었으며 중급 및 고급 유리지방산은 199% 증가되었다. Lipase의 종류에 따른 지방분해실험에서 calf lipase는 중급 및 고급지방산 9배보다 저급지방산은 5.
- 6배로 증가시켰다. 그러나 Candida rugosa lipase와 Pseudomonas fluorescens lipase는 저급 유리지방산이 각각 6배와 14배 증가하고, 중급 및 고급 유리지방산은 각각 34 배와 162배 증가하여 중급 및 고급지방산을 더 잘 분해하는 것으로 나타났다. 산양유의 LPL 활성이 높을수록 유리지방산 생성량도 증가되어 유의적 상관관계(r=0.
- 2를 나타내었다. 또한 Pseudomonas fluorescens lipase는 저급 유리지방산이 198 ppm으로 14배 증가시킨데 비하여 중급 및 고급 유리지방산은 2, 470ppm으로 162배 증가시켰으며, 저급 유리지방산 대비 중급 및 고급 유리지방산의 함량 비율이 1:12.5를 나타내었으며 Candida rugosa lipase의 경우보다도 중급 및 고급 유리지방산을 2배 이상 높은 비율로 분해 생성시켰다. Candida rugosa lipase의 경우 지방산의 구분 없이 휘발성지방산을 다량 생산하였다는 Ha와 Lindsay(1993)의 실험과 유사한 결과이며, 이러한 lipase의 선택적 분해 특성은 산양유의 향미를 결정짓는데 크게 영향을 미칠 것으로 생각한다.
- 반응 후 시유를 대조구로 시험구의 유리지방산 함량을 비교한 결과 저급 유리지방산은 대조 구가 14.0±1.0ppm이고 시험구는 17.0±0.1 ppm으로 시험구가 22%가 더 높은 수치를 보였으며, 중급 및 고급 유리지방산은 대조구가 15.2±0.6ppm이고 시험구는 45.6±2.2ppm으로 시험 구가 200% 더 높았다. 저급 유리지방산에 대한 중급 및 고급 유리지방산의 비율이 대조 구에서 1.
- 이보고 들에 따르면 산패취 이전에 감지될 수 있는 산양유 이취는 제품에 긍정적으로 작용할 수 있는 저급 유리지방산으로부터 발생된 것으로 생각할 수 있다. 본 실험에서는 저장하는 동안 저급 유리지방산의 증가보다 고급 유리지방산의 증가가 크게 높게 나타났는데, 이는 저장하는 동안 고급 유리지방산이 더 많이 증가되며, 이때 소비자에게 불쾌감을 느끼게 하고 제품에 부정적인 영향을 미치는 산패취 및 산양유 이취가 형성되는 것으로 생각한다.
- 5와 같다. 산양 혈청을 포함하는 기질 용액을 일정 비율로 산양유에 혼합하고 37 에서 1시간 동안 처리하여 분해된 유리지방산 함량을 비교한 결과 LPL 활성과 산양유 이취는 그림과 같이 일정 수준의 상관성을 나타내었다. LPL 활성과 산양유 이취는 r=0.
- 유지방 함유율이 높을수록 총고형분 함량도 비례하여 증가하였다. 산양유 원유를 24시간 냉장저장 하는 동안에 저급 유리지방산(C4:0~C10:0)은 106% 증가하였으며 중급 및 고급 유리지방산(C12:0~C18:1)은 203%로 높은 증가율을 보였다. 균질한 시유에 원유를 첨가하여 반응할 때에 저급 유리지방산은 22% 증가되었으며 중급 및 고급 유리지방산은 199% 증가되었다.
- 그러나 Candida rugosa lipase와 Pseudomonas fluorescens lipase는 저급 유리지방산이 각각 6배와 14배 증가하고, 중급 및 고급 유리지방산은 각각 34 배와 162배 증가하여 중급 및 고급지방산을 더 잘 분해하는 것으로 나타났다. 산양유의 LPL 활성이 높을수록 유리지방산 생성량도 증가되어 유의적 상관관계(r=0.5635)를 보였으며 또한 산양유 이취가 높아지는 상관관계(r=0.5777)를 보였다. 유지방 함량이 낮을수록 LPL 활성은 높아지는 유의적 역 상관관계(r= 0.
- 산양유의 지방산 조성을 우유와 비교한 결과 butyric acid의 경우 우유는 9.69%, 산양유는 5.01%로 우유 중의 함량이 높았으며, 이에 비하여 capric acid는 우유의 경우 3.34%, 산양유는 8.99% 이었으며 linolenic acid는 우유가 0.36%이고 산양유 중에는 1.23%로 산양유에 높게 함유되어 있는 등 butyric acid, capric acid 및 linolenic acid의 함량에서 뚜렷한 차이를 보였다. 이러한 산양유 지방산의 조성은 Chilliard 등(2002)의 보고에 비하여 butyric acid가 2.
- 7과 같다. 유지방 함량은 높을수록 LPL 활성이 낮은 경향을 보였지만 상관성은 r= 0.4627로 낮았으나 P<0.05 수준에서 유의성이 있었다.
- 5777)를 보였다. 유지방 함량이 낮을수록 LPL 활성은 높아지는 유의적 역 상관관계(r= 0.4627)를 보였다. 산양유의 palmitic acid 함량이 높을 경우 산양유 이취 강도가 증가하는 유의적 상관관계 (r=0.
- 8%)에 낮았다. 유지방 함유율이 높을수록 총고형분 함량도 비례하여 증가하였다. 산양유 원유를 24시간 냉장저장 하는 동안에 저급 유리지방산(C4:0~C10:0)은 106% 증가하였으며 중급 및 고급 유리지방산(C12:0~C18:1)은 203%로 높은 증가율을 보였다.
- 이에 비하여 Candida rugosa lipase와 Pseudomonas fluorescens lipase는 중급 및 고급 지방산을 저급지방산보다 크게 높은 비율로 분해하여 calf lipase와 차이를 보였다. Candida rugosa lipase의 경우는 저급 유리지방산이 84.
- 2ppm으로 시험 구가 200% 더 높았다. 저급 유리지방산에 대한 중급 및 고급 유리지방산의 비율이 대조 구에서 1.1배이었으며 시험구에서 2.7배로 시유에 원유를 첨가하여 교반함으로서 중급 및 고급 유리지방산이 더 많이 증가하는 경향을 보였다. 즉, 유도적 지방분해는 저급 유리지방산 보다는 중급 및 고급 유리지방산을 크게 높은 비율로 증가시켰다.
- 6배 증가하여 크게 높은 결과를 보였다. 저장 48시간 동안의 유리지방산 증가 양상 또한 Fig. 3에서 보이는 것과 같이 저급 및 중급 유리지방산의 증가 형태에 비하여 palmitic acid 및 고급 유리지방산의 증가량이 높은 경향을 나타내었다.
- 중급 및 고급 유리지방산이 15.24ppm에서 82.27 ppm으로 5.4배 증가된 것에 비하여 저급 유리지방산은 13.95 ppm에서 126.22ppm으로 9배 증가를 보였으며, 이때 저급 유리지방산 대비 중급 및 고급 유리지방산의 함량 비율은 1 : 0.65이었다. 7배로 시유에 원유를 첨가하여 교반함으로서 중급 및 고급 유리지방산이 더 많이 증가하는 경향을 보였다. 즉, 유도적 지방분해는 저급 유리지방산 보다는 중급 및 고급 유리지방산을 크게 높은 비율로 증가시켰다. Chilliard(1982)는 산양유에서 LPL 활성은 자발적인 지방분해에 의한 효소 활성 보다 크게 높다고 하였는데, 원유의 이송 또는 교반 등 진탕에 의해 지방구가 물리적인 충격을 받을 경우 LPL의 활성이 촉진되어 유도적 지방분해(induced lipolysis)가 빠르게 진행될 것으로 생각한다.
- 6% 범위로 개체유 간에 차이가 크게 나타났는데, 이는 Arnold 등(1975)과 Ha와 Lindsay (1991)이 유제품의 풍미는 대부분 유지방에 의하여 결정된다고 한 것과 같이 산양유 제품의 관능적 품질저하를 유발하는 요인일 것으로 생각한다. 총고형분은 10.6~12.8% 범위로 유지방함량이 높을수록 유사한 비율로 증가하는 높은 상관성 (P<0.001) 을 보였다.
후속연구
- 유지사료보조제를 사료에 첨가하여 급여할 경우 우유는 유지방 함량이 감소하거나 변동이 없지만 양유와 산양유는 유지방 함량이 증가한다고 한 Chilliard와 Bocquier (1993)의 보고와 유사한 결과를 보인 것이다. 이러한 산양유의 특성은 유지사료 보조제 급여를 통하여 개체별 유지방 함량을 균일화시킴으로서 산양유의 품질을 향상시켜 줄 수 있을 것으로 생각한다.
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