The purpose of this study was to compare the efficiency of slow freezing with that of vitrification method for the cryopreservation of human embryos. Human embryos were derived from in vitro fertilization (IVF) or intracytoplasmic sperm injection (ICSI) and the mixed solution of propanedial (1.5, 1....
The purpose of this study was to compare the efficiency of slow freezing with that of vitrification method for the cryopreservation of human embryos. Human embryos were derived from in vitro fertilization (IVF) or intracytoplasmic sperm injection (ICSI) and the mixed solution of propanedial (1.5, 1.0, 0.5M PROH) and sucrose (0.1M), ethylene glycol (7.5, 15%), dimethyl sulfoxide (7.5, 15% DMSO), sucrose (0.5, 1.0M) and SPS (Serum Protein Substitute) was used for a cryoprotectant for slow freezing and vitrification solution, respectively. Rates of recovery after thawing, morphological normality, post-thaw viability, arrest, morphological abnormality and preimplantation development were compared between two protocols. After freezing-thawing, recovery and survial rate of slow freezing was (88.6% and 73.4%), whereas vitrification was (99.2% and 96.2%) (p<0.05). The arrest rate of slow freezing was significantly lower compared with those of vitrification(8.7% vs 29.9%) (p<0.05). Preimplantation development to the 2-cell (83.8% vs 67.7%), 4-cell (69.0% vs 47.2%) and 8-cell (62.4% vs 37.8%) stages 24, 48 and 72 h after thawing, respectively, were higher in the slow freezing than the vitrification. After slow freezing and vitrification of human embryo at 2-8cell stage, the rate of recovery rate, survival rate and partial damage rate were 92.0% vs 100%, 80.4% vs 96.2% and 52.2% vs 19.0%, respectively. And partial damage rate was significantly lower than those of slow freezing method (p<0.05). These results demonstrate that a slow freezing using PROH is more efficient than a vitrification for cryopreserving the human zygotes, although the vitrification yielded better recovery, survival and partial damage of frozen-thawed 2-8 cell stage embryos than slow freezing method.
The purpose of this study was to compare the efficiency of slow freezing with that of vitrification method for the cryopreservation of human embryos. Human embryos were derived from in vitro fertilization (IVF) or intracytoplasmic sperm injection (ICSI) and the mixed solution of propanedial (1.5, 1.0, 0.5M PROH) and sucrose (0.1M), ethylene glycol (7.5, 15%), dimethyl sulfoxide (7.5, 15% DMSO), sucrose (0.5, 1.0M) and SPS (Serum Protein Substitute) was used for a cryoprotectant for slow freezing and vitrification solution, respectively. Rates of recovery after thawing, morphological normality, post-thaw viability, arrest, morphological abnormality and preimplantation development were compared between two protocols. After freezing-thawing, recovery and survial rate of slow freezing was (88.6% and 73.4%), whereas vitrification was (99.2% and 96.2%) (p<0.05). The arrest rate of slow freezing was significantly lower compared with those of vitrification(8.7% vs 29.9%) (p<0.05). Preimplantation development to the 2-cell (83.8% vs 67.7%), 4-cell (69.0% vs 47.2%) and 8-cell (62.4% vs 37.8%) stages 24, 48 and 72 h after thawing, respectively, were higher in the slow freezing than the vitrification. After slow freezing and vitrification of human embryo at 2-8cell stage, the rate of recovery rate, survival rate and partial damage rate were 92.0% vs 100%, 80.4% vs 96.2% and 52.2% vs 19.0%, respectively. And partial damage rate was significantly lower than those of slow freezing method (p<0.05). These results demonstrate that a slow freezing using PROH is more efficient than a vitrification for cryopreserving the human zygotes, although the vitrification yielded better recovery, survival and partial damage of frozen-thawed 2-8 cell stage embryos than slow freezing method.
* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.
문제 정의
본 연구는 IVF-ET program 중 잉여 배아 동결시 보편적으로 사용하고 있는 완만 동결법과 점점 새롭게 기대되는 유리화 동 결법을 비교하여 인간의 전핵시기 배아와 수정란 상태의 배아 를 동결 보존 시 어느 방법이 최적의 방법인지 알아보고자 시행 하였다. 전핵기 배아의 완만, 유리화 동결 후 융해시 회수율과 생존율은 각각 88.
본 연구는 시험관아기 시술 과정에서 발생하는 잉여배아를동결 보존시, 일반적으로 사용하고 있는 완만 동결법과 새롭게 기대되는 유리화 동결법을 비교하여 전핵시기 배아와 2~8 세포기 수정 란 상태의 배아를 동결 보존시 어느 방법 이 최적의 방법 인지 알아보고자 시 행하였다. zygote 상태 의 배 아를 완만-유리화 동결-융해시 회수율과 생존율은 각각 88.
최근 들어 완만 동결법의 단점들을 보완하기 위해 유리화 동결법의 효용성에 대해 보고되고 있는데(Isachenko V, 2003), 본 연구는 인간의 전핵기 단계의 배아 및 발달 단계의 배아를 완만 동결법과 유리화 동결 방법으로 동결 보존 후 융해하여 회수율, 생존율, 배 발달율을 비교, 각각의 동결법의 효용성을 알아보기 위해 수행하였다.
제안 방법
난자 채취시 PBS(Sage BioPharma, USA)를 이용하여 2~3회 세척 후 수정 전까지 QFert(HTF)(Sage BioPharma, USAj에서 배 양하였다. 0.1% hyaluronidase(Sage BioPharma, USA) 농도의 Q-HEPES(Sage BioPharma, USA) 용액에서 피펫을 이용하여 난구세포를 제거하고 실 체 현미경(stereomicroscope)하에서 MII 단계에 나타나는 제 1극 체(polar body)의 유무로 난자의 성숙을 판단하였다. 성숙된 난 자는 3~4시간 배양 후 체외 수정 또는 미세 조작술을 실시하여 QFert(HTF)에 넣은 다음 37℃, 5% CO2 로 조절된 배양기에서 배양하였다.
장기 요 법의 경우, 월경주기 일주일 전부터 GnRH agonist를 이용하여 뇌하수체를 억제하고, 월경이 시작되면 월경 주기 제 3일에 뇌하수체의 기능 억제 유무를 확인하기 위하여 혈중 LH, estradiol, progesterone(P4)을 즉정 하고 LH < 5 mIU/mL, E2 < 50 pg/ mL, P4 < Ing/ml인 경우 과배란 유도를 시작하였고, 그 후 과배 란 과정은 단기 요법과 같았다. 길항 요법은 월경 시작 3일째 에 초음파 검사 및 위에서 언급한 호르몬 검사를 실시하여 난 소낭종이 없고, 호르몬 검사상 월경주기 3일째에 합당한 수치 의 결과가 보이면 단기 요법에서 언급한 성선자극호르몬을 투 여하기 시작하고, 생리 주기 6~8일째 다시 초음파 검사를 실 시하여 난포의 크기 가 14 mm에 도달하면 조기 LH surge를 예 방 하기 위해 GnRH antagonist(Cetrotide, Serono, Switzerland) 0.25 mg를 매일 투여하였으며, 그 후 난자 채취를 위한 hCG 등의 주사는 위에서 언급한 바와 같이 시행하였다.
모든 배 양액 에 는 10% Serum Protein Substitute(SPS; Sage BioPharma, USA)를 첨가하여 사용하였다. 난자 채취시 PBS(Sage BioPharma, USA)를 이용하여 2~3회 세척 후 수정 전까지 QFert(HTF)(Sage BioPharma, USAj에서 배 양하였다. 0.
단기 요법은 월경 주기 제 2일째부터 GnRH agonist(Lucrin, Laboratories Abbott, France)를 이용하여 뇌 하수체를 억제 하고 제 3일부터 성선자극 호르몬(Follitroph, LG생명과학, Korea)을 환 자에 따라 적절한 용량을 주사하면서 초음파 및 혈중 E2 농도 를 지속적으로 측정하여 우성 난포의 평균 직경이 18 mm 이 상이거나 16 mm 이상인 난포가 3개 이상 관찰되면서 혈중 E2 농도가 계속 상승하거나, 직경 10 mm 이상인 난포당 혈중 E2 농도가 200 pg/inL 이상이면 hCG(ovidrel, Serono, Switzerland) 250 mcg를 피하주사하여 배란 촉발을 유도한 후 35~36시간 뒤에 질식 초음파 유도하에 난자 채취를 시행하였다. 장기 요 법의 경우, 월경주기 일주일 전부터 GnRH agonist를 이용하여 뇌하수체를 억제하고, 월경이 시작되면 월경 주기 제 3일에 뇌하수체의 기능 억제 유무를 확인하기 위하여 혈중 LH, estradiol, progesterone(P4)을 즉정 하고 LH < 5 mIU/mL, E2 < 50 pg/ mL, P4 < Ing/ml인 경우 과배란 유도를 시작하였고, 그 후 과배 란 과정은 단기 요법과 같았다.
모든 배 양액 에 는 10% Serum Protein Substitute(SPS; Sage BioPharma, USA)를 첨가하여 사용하였다. 난자 채취시 PBS(Sage BioPharma, USA)를 이용하여 2~3회 세척 후 수정 전까지 QFert(HTF)(Sage BioPharma, USAj에서 배 양하였다.
성숙된 난 자는 3~4시간 배양 후 체외 수정 또는 미세 조작술을 실시하여 QFert(HTF)에 넣은 다음 37℃, 5% CO2 로 조절된 배양기에서 배양하였다. 배양 16~18시간 후 실체 현미경 하에서 2개의 전 핵이 보이는 정상 수정된 수정란을 선별하여 Q-Cleavage(Sage BioPharma, USA)에 배양 또는 동결 보존을 실시하였다.
융해는 한 달 이상 액체질소 안에 보관되었던 동결된 straw 를 대기 중에 10여초 노출 후 37℃ 항온수조에서 1분동안 융해 후 거즈로 straw 표면의 물기를 제거한 다음 양 끝을 절단하여 배아와 동결 보존액을 배양 접시에 흘려내리고 실체 현미경하에서 배아의 수를 확인하였다. 기본 융해액 역시 10% SPS가 첨가된 DPBS를 사용하였는데, 1.
융해한 배아의 회수율은 동결 배아에 대한 백분율로, 생존율은 회수된 배아에 대한 백분율로 계산하였고, 융해 후 72시간 동안 24시간 단위로 배아의 난할율을 관찰하였으며, 난 할 율은 융해 후 살아있는 배아에 대한 백분율로 평가하였는데, 실체현미경으로 관찰시 투명대가 온전하고 세포질이 밝고 투명한 형태의 배아를 생존한 것으로 판정하였다.
대상 데이터
완만 또는 유리화 동결 실험에 공시한 배 아는 2007년 3월부터 2007년 12월까지 광주 미래와희망 산부인과의원에서 성선자극 호르몬(gonadotropin)으로 과배란 유도를 하고, 체외수정또는 미세 조작 시술을 실시하여 정상적인 수정이 이루어진배아 중 이식 후 남은 잉여 배아를 대상으로 하였고, 이때 환자의 연령은 고려하지 않았다.
유리 화 동결액도 10% SPS가 첨 가된 DPBS(Gibco BRL, USA) 를 기 본으로 하여 ES(Equilibrium Solution)와 VS(VitriHcation So lution) 용액을 제조하여 사용하였다. ES 용액은 7.
데이터처리
통계적 유의성 검정은 SAS(statistical analysis system)를 이용한 #-text를 실시하여 유의성 검정을 하였고, p<0.05 일 때 유의하다고 판정하였다. -
성능/효과
05). 2~4세포기 상태의 배아를 완만-유리화 동결 후 융해시 회수율은 각각 92.0% vs 100%로 유의적인 차이를 보이지 않았으나, 생존율은 유리화 동결 방법이 96.2%로 80.4%의 완만 동결 방법보다 유의적으로 높았다. 또, 할구의 부분 손상율도 유리화 동결이 19.
방법 인지 알아보고자 시 행하였다. zygote 상태 의 배 아를 완만-유리화 동결-융해시 회수율과 생존율은 각각 88.6% vs 99.2% 와 73.4% vs 96.2%로 유리화 동결 방법 이 유의 적으로 높았으나, 발달 정지율은 8.7% vs 29.9%로 완만 동결이 유의적으로 높았다(p<0.05). 융해 후 24, 48, 72시간별 배 발달율은 완만 동결 1 각각 83.
05). 그러나 동결-융해 후 발달 정지율을 살펴보면 완만 동결 방법은 229개 중 20개(8.7%)로 매우 낮은 반면 유리화 동결은 127개 중 38개(29.9%)로 30%에 가까운 발달 정지 현상을 보였다3<0.05).
따라서 인간 수정란의 동결 보존 시 전핵시기 배아의 동결은 융해 후 회수율과 생존율이 조금 낮더라도 발달 정지율이 낮은 완만 동결 방법을, 세포 분열이 진행된 2~8 세포기 배아 동결은 융해 후 회수율, 생존율, 할구의 부분 손상율이 적은 유리화 동결 방법이 효과적일거라 사료된다. 더불어 짧은 시간과 비싼 장비가 필요없고, 보다 간편한 유리화 동결 방법을 사용하기 위해서는 융해 후 발달 정지율을 낮추는 추가적인 연구가 지속적으로 이루어져야 할 것이다.
4%의 완만 동결 방법보다 유의적으로 높았다. 또, 할구의 부분 손상율도 유리화 동결이 19.0% 로 완만 동결 52.2%보다 유의적으로 낮았다(0.05).
배아 상태에서의 완만, 유리화 동결-융해 후 회수율은 유의 적 인 차이 가 없었으나(92% vs 100%), 생존율은 유리 화 동결 방 법이 96.2%로 완만 동결법 80.4%보다 유의적으로 높았고, 부 분 손상율도 19.0%로 완만 동결법 52.2% 보다 낮았다. 이는 완 만 동결시 세포의 분열이 진행된 상태에서 유리화 동결 방법 보다 많은 동결 보존액을 사용하여 열전도율이 낮고, 외부에서 빙결정 형성시 또는 세포 동결기에서 동결된 straw를 꺼낼 때 외부충격으로 인하여 할구가 부분적으로 손상을 받았을 것으 로 생 각된다.
유리화 동결이 완만 동결에 비해 회수율(100% vs 92.0%)과생존율(96.2% vs 80.4%)이 높았으며, 부분 손상율은 완만 동결방법이 52.2%로 유리화 동결 방법인 19.0%보다 유의적으로높았다 (p<0.05).
05). 융해 후 24, 48, 72시간별 배 발달율은 완만 동결 1 각각 83.8%, 69.0%, 62.4%로 유리화 동결 67.7%, 47.2%, 37.8%로 유의적으로 좋은 성적을 보였다gO.05). 2~4세포기 상태의 배아를 완만-유리화 동결 후 융해시 회수율은 각각 92.
융해 후 24시간 간격으로 72시간 동안 배아의 발달율을 살펴본 결과, 완만 동결-융해 후 대부분의 배아는 시간에 따라 일반적으로 알고 있는 단계별 발달이 진행되 었지 만, 유리화 동결 -융해 한 배아의 발달 속도는 반나절 정도 늦음을 관찰할 수 있었다. Isachenko(2004) 등은 재수화 과정이 많을수록 배아의 삼투압 변화에 따른 손상을 줄이는데 효과적이라고 하였는데, 유리화 동결-융해 후 배 아가 발달 속도가 늦은 것은 융해 과정 중 동결 보호제를 제거하는 2단계의 재수화 과정에서 삼투압의 변화 등에 따른 배아의 손상이 아닐까 추측이 된다.
본 연구는 IVF-ET program 중 잉여 배아 동결시 보편적으로 사용하고 있는 완만 동결법과 점점 새롭게 기대되는 유리화 동 결법을 비교하여 인간의 전핵시기 배아와 수정란 상태의 배아 를 동결 보존 시 어느 방법이 최적의 방법인지 알아보고자 시행 하였다. 전핵기 배아의 완만, 유리화 동결 후 융해시 회수율과 생존율은 각각 88.6% vs 99.2%, 73,4% vs 96.2%로 유리화 동결 방법 이 유의 적으로 높았지 만, 발달 정지율은 29.9%로 완만 동 결 방법(8.7%)이 유의적으로 낮았다. 이러한 결과는 유리화 동 결보존 후 90~95%(공 등, 1999)의 발생율과 80~85%(Kasai 등, 1990) 발생율을 보인 것에 비해 낮은 발생율을 나타내었는 더L 이는 유리화 동결 과정 중 수정 상태의 Zygote가 액체질소 의 급격한 온도 변화와 동결 보호제의 농도 차이 및 평형 과정 에 의한 직접적인 외부 접촉에 의해서 생존에 negative efibct로 나타난 것으로 보인다(Chen 등, 2001).
회수율은 완만 동결 방법 이 352개의 배아 중 312개를 회수하여 88.6%의 회수율을, 유리화 동결 방법은 133개 중 132개를 회수하여 99.2%의 회수율을 보였고, 생존율은 완만 동결 방법이 312개 중 229개가 살아 73.4%의 생존율을, 유리화 동결 방법 이 132개 중 127개 가 살아 96.2%의 생존율을 보여 유리화 동결 방법이 완만 동결 방법보다 유의적으로 높은 회수율과 생존율을 보였다3<0.05). 그러나 동결-융해 후 발달 정지율을 살펴보면 완만 동결 방법은 229개 중 20개(8.
후속연구
동결 방법이 효과적일거라 사료된다. 더불어 짧은 시간과 비싼 장비가 필요없고, 보다 간편한 유리화 동결 방법을 사용하기 위해서는 융해 후 발달 정지율을 낮추는 추가적인 연구가 지속적으로 이루어져야 할 것이다.
참고문헌 (29)
Bafrani HH, Salsabili N, Pasbakhsh P, Hassani H, Movahedin M and Al-tarihi T. 2003. Comparison of 1,2-propanedial and ethylene glycol for cryopreservation of slow-cooled mouse zygote and their subsequent development. J. Assist. Reprod. Genet. 20: 234-240
Bautista JA, Dela Pena EC, Katagiri S, Takahashi Y and Kanagawa H. 1998. In vitro viability of mouse oocytes vitrified in an ethylen glycol-based solution. Jpn. J. Vet. Res. 46:13-18
Chen SU, Lien YR, Chen YY, Chen HF, Ho NH and Yang YS. 2001. Vitrification of mouse oocytes using closed pulled straw (OPS) achieves a high survival and preserves good patterns of meiotic a spindles, compared with conventional straws, open pulled straw(OPS) and grids. Hum. Reprod. 16:2350-2359
Cohen J, DeVane GW, Elsner CW, Rehilly CB, Kort HI, Massey JB and Turner TG Jr. 1988. Cryopreservation of zygotes and early cleaved human embryos. Fertil. Steril. 49:283-289
Cohen J, Simons RF, Edwards RG, Fehilly CB and Fishel SB. 1985. Pregnancies following the frozen storage of expanding human blastocysts. J. In Vitro Fert. Embryo Transfer. 2:59-64
Damario MA, Hammit DG, Galantis TM, Session DR and Dumesic DA. 1999. Pronuclear stage cryopreservation after intracytoplasmic sperm injection and conventional IVF: implications for timing of the freeze. Fertil. Sterill. 72:1049-1054
Dobrinsky JR, Pursel VG, Long CR and Johnson LA. 2000. Birth of piglets after transfer of embryos cryopreserved by cytoskeletal stabilization and vitrification. Biol. Reprod. 62:564-570
Fugger EF, Bustillo M, Katz LP, Dorfmam AD, Bender SD and Schulman JD. 1988. Embryonic development and pregnancy from fresh and cryopreservation sibling pronucleate human zygotes. Fertil. Steril. 50:273-278
Gardner DK, Weissman A, Howles CM and Shoham Zeev. 2004. Textbook of Assisted Reproductive Techniques. 2nd ed, Taylor & Francis, United Kingdom, pp. 257-289
Isachenko V, Montag M, Isachenko E, Nawroth F, Dessole S and van der Ven H. 2004. Developmental rate and ultrastructure of vitrified human pronuclear oocyte after step-wise versus direct rehydration. Hum. Reprod. 19:660-665
Kaidi S, Donnay I, Lambert P, Dessy F and Massip A. 2000. Osmotic behavior of in vitro produce bovine blastocyst in cryoprotectant solutions as a potential predictive test of survival. Cryobiology 41:106-115
Kasai M, Ito K and Edashige K. 2002. Morphological appearance of the cryopreserved mouse blastocysts as a tool to identify the type of cryoinjury. Hum. Reprod. 17:1863-1874
Kasai M, Komi H, Takakamo A, Tsudera H, Sakurai T and Machida T. 1990. A simple method for mouse embryo cryopreservation in low toxicity vitrification solution without appreciable loss of viability. J. Reprod. Fert. 89:91-97
Kaufmann RA, Nicollet B, Menezo Y, DuMont M, Hazout A and Servy EJ. 1995. Cocultured blastocyst cryopreservation: experience of more than 500 transfer cycles. Fertil. Steril. 64:1125- 1129
Mandelbaun J, Belaisch-Allart J, Junka AM, Antoine JM, Plachot M, Alvarez S, et al. 1998. Cryopreservation in humna assisted reproduction is now routine for embryos but remains a research procedure for oocyte. Hum Reprod. Suppl. 13:161-174
Menezo Y, Nicollet B, Herbaut N and Andre D. 1992. Freezing cocultured human blastocysts. Fertil. Steril. 58:977-980
Miyake T, Kasai M, Zhu SE, Sakurai T and Machida T. 1993. Vitrification of mouse oocytes and embryos at various stage of development in an ethylene-glycol based solution by a simple method. Theriogenology 40:121-134
Ohta N, Nohara M, Kojimahara T, Ito M, Saito T, Nakahara K, Tezuka N, Saito H and Hiroi M. 1996. Ultrarapid freezing of human embryos by vitrification method: a case of delivery. Jpn. J. Fertil. Steril. 41:276-279
Park JE and Ruffing H. 1992. Factors affecting low temperature survivals of mammalian oocytes. Theriogenology 37:59-73
Scheffen B, Van Der Zwalmen P and Massip A. 1986. A simple and efficient procedure for preservation of mouse embryos by vitrification. Cryo-Letters 7:260-269
Testart J, Lassalle B, Belaisch-Allart J, Hazoult A, Forman R, Rainborn JD and Frydman R. 1986. High pregnancy rate after early human embryo freezing. Fertil. Steril. 46:268-272
Vanderzwalmen P, Delval A, Chatziparasidou A, Bertin G, Ectors F, Lejeune B, Nijis M, Prapas N, Prapas Y, Van Damme B, Zech H and Schoysman R. 1997. Pregnancies after vitrification of human day 5 embryos. Hum Reprod. Abst. 12:O-198
Veeck LL, Amundson CH, Brothman LJ, DeScisciolo C, Maloney MK, Muasher SJ and Jones HW Jr. 1993. Significantly enhanced pregnancy rates per cycle through cryopreservation and thaw of pronuclear stage oocytes. Fertil. Steril. 59:1202-1207
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.