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문제 정의
- 본 실험은 콩 [Glycine max (L.) Merill]의 자엽마디를 이용하여 효율적인 형질전환 시스템을 확립하고 그 방법을 통해 제초제 저항성 콩을 개발하기 위하여 수행되었다. 형질전환에 적합한 콩을 찾기 위하여 여러가지 재배품종을 대상으로 재분화율을 조사한 결과 국내품종은 단백콩과 은하콩이 국외품종은, Jack, 과 'Peking, 이 높은 재분화율을 나타내 콩의 형질전환에 적합한 품종으로 선발하였다 콩의 자엽마디에 제초제 저항성 유전자 0V)를 포함하고 있는 PCAMBIA3301 벡터로 형질전환한 아그로박테리움 (KYRT1, EHA105)을 접종하여 형질전환하였다.
- 1998), 황화합물을 이용한 형질전환 효율 향상 연구 (Olhoft and Somers 2001) 등 다양한 분야에서 연구가 진행되었음에도 국내외적으로 유전자변형 콩의 개발은 쉽지 않은 것으로 여겨지고 있다. 본 연구에서는 효율적인 형질전환 시스템을 확립하고, 최근 glyphosate 제초제 저항성 잡초 발생에 따른 생태계의 교란을 방지하기 위하여 새로운 제초제 저항성 콩을 개발하고자 하였다.
제안 방법
- bar$\ 5, 과 3, 을 인지하는 한 쌍의 primer를 제작하여(bar-F : 5'-GCT GAA GTC CAG CTG CCA GAA ACC C-3, bar-R : 5'-AAC CAC TAC ATC GAG ACA AGC ACG GTCA-3') 400bp 크기의 밴드가 증폭되도록 하였다. 35S 프로모터는 35S-F: 5'-GAG GAC CTA ACA GAA CTC GCC GTA AAC-3', 35S-R: 5'-GTC CCC CGT GTT CTC TCC AAATG-3, 로 하여 515bp가 증폭되도록 하였다. GUS 프로모터는 GUS-F: 5'-GTG CAC GAC CAC GCA TTA ATG GAC T-3', GUS-R: 5'-AAA TCG CCG CTT TGG ACA TAC CAT C-3, 로 하여 500 bp 가 증폭되도록 하였다 PCR조건은 premix (Accupower®, Bioneer) 제조사의 프로토콜을 이용하였다.
- 8% plant agar, pH54)에 옮겼다. 5일간 공배양후에 자엽마디를 신초유도용 배지 (B5, 3% sucrose, 3 mMMES, 1.67 mgeLBA, 250 mL cefotaxime, 50 mg/L vancomycin, 0.8% plant agar, phosphinothricin, pH 5.7)에 옮겨 2주마다 계대배양을 하고 6주후 신초신장용 배지(MS, 3% sucrose, 3 mM MES, 0.5 mg/L GA, 50 mg/L asparagine, 1 mg/L zeatin, 0.1 mg/L IAA, 250 mg/L cefotaxime, 50 mg/L vancomycin, 0.8% plant agar, phosphinothricin, pH 5.7)로 옮겨 계대배양 하였다. 재분화된 식물체는 발근용 배지 (MS,3% sucrose, 1 mg/L NAA, 0.
- 35S 프로모터는 35S-F: 5'-GAG GAC CTA ACA GAA CTC GCC GTA AAC-3', 35S-R: 5'-GTC CCC CGT GTT CTC TCC AAATG-3, 로 하여 515bp가 증폭되도록 하였다. GUS 프로모터는 GUS-F: 5'-GTG CAC GAC CAC GCA TTA ATG GAC T-3', GUS-R: 5'-AAA TCG CCG CTT TGG ACA TAC CAT C-3, 로 하여 500 bp 가 증폭되도록 하였다 PCR조건은 premix (Accupower®, Bioneer) 제조사의 프로토콜을 이용하였다. 전체 PCR반응양은 20 μ1 로 하였으며 95 ℃ 에서 1회 5분간 pre-denaturation후 94℃ 에서 30초간 denaturation, 60℃ 에서 30초간 annealing, 72℃ 에서 30초간 elongation하여 30회 반응시켰으며 72℃ 에서 최종 10분간 post-elongation시켰다.
- Genotype에 따른 식물체 재분화 능력을 확인하기 위하여대립종 16품종, 나물콩 5품종 유색콩 7품종 총 28품종의 콩을 사용하여 식물체 재분화 능력을 검정하였다. 재분화에이용된 배지의 조성은 Zhang (2004)의 방법을 이용하였다.
- bar$\ 5, 과 3, 을 인지하는 한 쌍의 primer를 제작하여(bar-F : 5'-GCT GAA GTC CAG CTG CCA GAA ACC C-3, bar-R : 5'-AAC CAC TAC ATC GAG ACA AGC ACG GTCA-3') 400bp 크기의 밴드가 증폭되도록 하였다. 35S 프로모터는 35S-F: 5'-GAG GAC CTA ACA GAA CTC GCC GTA AAC-3', 35S-R: 5'-GTC CCC CGT GTT CTC TCC AAATG-3, 로 하여 515bp가 증폭되도록 하였다.
- 현재는 최종적으로 확인된 St-2 형질전환체로부터 후대 종자를 획득하여 다음 세대로 제초제 저항성이안정적으로 유전되고 있는지를 확인중이다. 본 실험 수행결과 형질전환 콩을 개발하기 위한 적합한 조건을 확립하였으며, 이를 통해 제초제 저항성 유전자가 삽입되어 발현하는형질전환 콩을 개발하였고, GUS발색 반응 및 분자생물학적기술을 이용하여 검정하였다. 향후 이러한 형질전환 체계를이용하면 제초제 저항성 유전자 외에도 다른 유용유전자가도입된 유전자변형 콩을 개발할 수 있을 것으로 기대된다.
- 선발된 식물체에서 유전자의 삽입여부를 확인하기 위하여 제초제 저항성 유전자 (bar)에 대한 PCR 분석을 실시하였다. bar$\ 5, 과 3, 을 인지하는 한 쌍의 primer를 제작하여(bar-F : 5'-GCT GAA GTC CAG CTG CCA GAA ACC C-3, bar-R : 5'-AAC CAC TAC ATC GAG ACA AGC ACG GTCA-3') 400bp 크기의 밴드가 증폭되도록 하였다.
- 콩의 자엽 마디와 아그로박테리움을공배양한 후 GUS발색 반응을 통해 절편체로의 T-DNA 도입율은 최대 60%에 이르렀으나 형질전환율은 콩의 품종과아그로박테리움의 종류에 따라 현저한 차이를 보였으며, 그중에서 Jack품종의 자엽마디를 아그로박테리움 EHA105를이용하여 형질전환하였을 때에 가장 높은 3%의 형질전환율을 나타내었다. 순화된 형질전환체 중 GUS발색 반응에서양성반응을 보이는 식물체들을 PCR을 이용하여 검정하였으며, 제초제 (Basta®)살포와 Southern분석을 통해 제초제저항성 유전자가 도입되어 발현되는 형질전환체를 확인하였다. 현재 후대로의 유전양상과 도입된 유전자가 안정적으로 발현하는지의 여부를 실험중이다.
- 아그로박테리움과 공배양한 자엽마디를 1 mM X-gluc용액에 침지하여 유전자의 도입여부와 발현정도를 GUS발색반응으로 확인하였다. 유전자가 도입되어 발현된 부분은 푸른색의 점 모양을 나타낸 반면 유전자가 도입되지 않은 부분은 변색되지 않음을 확인할 수 있었다.
- 에서 16시간 이상 반응시킨 후, 70% 알코올로 탈색시켜 GUS의 발색 여부와 정도를 관찰하였다.
- 8% agarose gel로 전기 영동 후 band를 확인하였다. 온실에서 생육중인 콩의 어린잎을 이용하여 genomic DNA를 분리하였으며 분리한 DNA (20 ug)를 EcoRI 제한효소로 절단하여 0.8% agarose gel에 전기 영동 하였다. Agarose gel상의 DNA 를 Zeta-ProbeR Blotting Membranes (BIO-RAD)에 전이시켜 [a-32P] dCTP로 표지된 bar probe를 이용하여 Southern blot 을 실시하였다 (Sambrook 2001).
- 공배양한 자엽마디를 선발배지에 치상하고 1주후부터 자엽마디의 부위에서는 작은 돌기들이 형성되면서 새로운 신초를 유기하였다. 이들을 계대배양하면 신초 주변의 세포들이 급속히 분열하면서 여러 개의 신초들을 형성하였으며, 2차 계대배양 후부터는 phosphinothricin에 저항성을 나타내는 신초는 녹색을유지하며 계속적으로 자라기 시작하였지만 형질전환이 제대로 이루어지지 않아 제초제 저항성을 갖지 못한 절편체는갈변되기 시작하여 결국에는 고사하였다. 이는 Cho 등 (2004) 이 보고한 것처럼 형질전환이 일어나지 않은 절편체는 배지내의 phosphinotMicin을 흡수하여 암모니아 축적으로 괴사현상을 나타내지만 형질전환된 절편체는 phosphinothricin acetyl transferase를 합성하여 저항성을 갖게 된 현상으로 보이며, 이는 T-DNA의 제초제 저항성 유전자가 올바르게 식물체로전달되어 발현하고 있음을 알 수 있었다.
- 재분화 능력이 뛰어난 것으로 확인된 '단백콩', '은하콩', 'Jack', <Peking, 종자를 염소가스법을 이용하여 16시간 표면살균 후 3% sucrose와 0.8% agar가 첨가된 MS기본배지에 10개씩 치상하였다. 배양 5일후 발아된 식물체로부터 자엽 마디를 분리하여 준비된 아그로박테리움에 30분간 침지 후 공배양용 배지 (B5, 3% sucrose, 20 mM MES, 3.
- 이는 형질전환체가 chimeric plant이었기 때문인 것으로 생각되며 좀더 안정적이며 국내품종도 형질전환이 가능하도록 형질전환 체계의 개선이 필요하다. 현재는 최종적으로 확인된 St-2 형질전환체로부터 후대 종자를 획득하여 다음 세대로 제초제 저항성이안정적으로 유전되고 있는지를 확인중이다. 본 실험 수행결과 형질전환 콩을 개발하기 위한 적합한 조건을 확립하였으며, 이를 통해 제초제 저항성 유전자가 삽입되어 발현하는형질전환 콩을 개발하였고, GUS발색 반응 및 분자생물학적기술을 이용하여 검정하였다.
- ) Merill]의 자엽마디를 이용하여 효율적인 형질전환 시스템을 확립하고 그 방법을 통해 제초제 저항성 콩을 개발하기 위하여 수행되었다. 형질전환에 적합한 콩을 찾기 위하여 여러가지 재배품종을 대상으로 재분화율을 조사한 결과 국내품종은 단백콩과 은하콩이 국외품종은, Jack, 과 'Peking, 이 높은 재분화율을 나타내 콩의 형질전환에 적합한 품종으로 선발하였다 콩의 자엽마디에 제초제 저항성 유전자 0V)를 포함하고 있는 PCAMBIA3301 벡터로 형질전환한 아그로박테리움 (KYRT1, EHA105)을 접종하여 형질전환하였다. 콩의 자엽 마디와 아그로박테리움을공배양한 후 GUS발색 반응을 통해 절편체로의 T-DNA 도입율은 최대 60%에 이르렀으나 형질전환율은 콩의 품종과아그로박테리움의 종류에 따라 현저한 차이를 보였으며, 그중에서 Jack품종의 자엽마디를 아그로박테리움 EHA105를이용하여 형질전환하였을 때에 가장 높은 3%의 형질전환율을 나타내었다.
대상 데이터
- pCAMBIA3301 을 EHA105와 KYRT1에 각각 형질 전환하여 비교실험에 이용하였다. Rifampicin 50 mg/L과 kanamycin 50 mg/L이 첨가된 YEP 고체배지에서 형성된 single 콜로니를 취하여 YEP 액체배지로 옮기고 28℃ 에서 120 rpm으로 진탕 배양하여 아그로박테리움의 농도를 OD6oo=0.
이론/모형
- 8% agarose gel에 전기 영동 하였다. Agarose gel상의 DNA 를 Zeta-ProbeR Blotting Membranes (BIO-RAD)에 전이시켜 [a-32P] dCTP로 표지된 bar probe를 이용하여 Southern blot 을 실시하였다 (Sambrook 2001).
- 자엽 마디와 아그로박테리움을 5일간 공배양 후 Jefferson 등 (1987)의 방법을 이용하여 GUS발색 반응을 수행하였다. 아그로박테 리움과 공배 양한 자엽 마디 를 1 mM 5-bromo-4-chloro-3-indole-glucuronidase (X-gluc) 용액에 침지하여 37℃
- 재분화에이용된 배지의 조성은 Zhang (2004)의 방법을 이용하였다.
성능/효과
- GUS발색 반응은 나타났지만 0.3% 제초제 살포후 고사한 '은하콩', '단백콩', 'Peking' 등 9개의 형질전환체를 제외하고 Jack, 품종에서 GUS 발색 반응으로 확보한 3개의 형질전환체에 대해 도입유전자를 확인하기 위해서 PCR 분석을 수행한 결과 St-1, St-2, St-3 각각에서 CaMV 35S 프로모터와 g"s유전자가 삽입되어 있는 것을 확인하였다 (Figure 2). 하지만 bar primer를 사용하여 PCR분석을 하였을 때에는 St-1 형질전환체에서는 증폭된 band를 확인할 수 없었으며, 이는 T-DNA가 온전히 식물체에 도입되지 못하고 gus 유전자 부분만 삽입되었거나 또는 온전히 삽입되었었더라도 재분화 과정중 제초제 저항성 유전자가 소실된 것으로 생각되며, 이로 인해 0.
- 보다 효율적인 형질전환 체계를 완성하기 위해서는 앞으로 유전자의 안정적인 도입 및 발현과 관련하여 더욱 깊은 연구가 필요할 것으로 생각된다. 0.3% 제초제에 저항성을 나타내는 2개의 형질전환체를 Southern blot 분석을 한 결과 St-2 형질전환체에서 유전자가 3 copy로 도입되었음을 밴드로 확인하였으나 St-3의 경우에는 GUS발색 반응과 PCR 을 통해서 유전자의 도입을 확인하였음에도 Southern blot에서는 밴드를 확인할 수 없었다 (Figure 3). 이는 형질전환체가 chimeric plant이었기 때문인 것으로 생각되며 좀더 안정적이며 국내품종도 형질전환이 가능하도록 형질전환 체계의 개선이 필요하다.
- 이는 Cho 등 (2004) 이 보고한 것처럼 형질전환이 일어나지 않은 절편체는 배지내의 phosphinotMicin을 흡수하여 암모니아 축적으로 괴사현상을 나타내지만 형질전환된 절편체는 phosphinothricin acetyl transferase를 합성하여 저항성을 갖게 된 현상으로 보이며, 이는 T-DNA의 제초제 저항성 유전자가 올바르게 식물체로전달되어 발현하고 있음을 알 수 있었다. 또한 형질전환체를 선발하기 위해 phosphinothricin의 농도는 기존의 보고를참조하여 5, 8, 10 mg/L로 배지내에 첨가하여 사용해 보았는데, 8mg/L 이상의 농도를 첨가하였을 때에는 콩의 절편체가모두 갈변하거나 신초가 발달하지 못하는 등 생육이 눈에띄게 저하되는 피해를 보였으며 반면에 5 mg/L 이하의 농도에서는 pseudo 식물체의 발생이 많아 적절한 선발을 할 수없었다. 따라서 'Jack' 품종을 이용한 콩의 형질전환시 효과적인 선발 농도는 5 mg/L로 생각되며 이는 Zhang 등 (1999) 의 결과와 일치하였다.
- 확인하였다. 유전자가 도입되어 발현된 부분은 푸른색의 점 모양을 나타낸 반면 유전자가 도입되지 않은 부분은 변색되지 않음을 확인할 수 있었다. 공배양한 자엽마디를 선발배지에 치상하고 1주후부터 자엽마디의 부위에서는 작은 돌기들이 형성되면서 새로운 신초를 유기하였다.
- 형질전환에 적합한 콩을 찾기 위하여 여러가지 재배품종을 대상으로 재분화율을 조사한 결과 국내품종은 단백콩과 은하콩이 국외품종은, Jack, 과 'Peking, 이 높은 재분화율을 나타내 콩의 형질전환에 적합한 품종으로 선발하였다 콩의 자엽마디에 제초제 저항성 유전자 0V)를 포함하고 있는 PCAMBIA3301 벡터로 형질전환한 아그로박테리움 (KYRT1, EHA105)을 접종하여 형질전환하였다. 콩의 자엽 마디와 아그로박테리움을공배양한 후 GUS발색 반응을 통해 절편체로의 T-DNA 도입율은 최대 60%에 이르렀으나 형질전환율은 콩의 품종과아그로박테리움의 종류에 따라 현저한 차이를 보였으며, 그중에서 Jack품종의 자엽마디를 아그로박테리움 EHA105를이용하여 형질전환하였을 때에 가장 높은 3%의 형질전환율을 나타내었다. 순화된 형질전환체 중 GUS발색 반응에서양성반응을 보이는 식물체들을 PCR을 이용하여 검정하였으며, 제초제 (Basta®)살포와 Southern분석을 통해 제초제저항성 유전자가 도입되어 발현되는 형질전환체를 확인하였다.
- 형질전환체를 육성하기 위하여 콩의 자엽마디에 pCAM BIA3301 로 형질전환한 아그로박테리움 EHA105와 KYRT1 을 공배양한 결과 병원성이 강한 KYRTK 이용하였을 때콩의 자엽마디 에서 보다 많은 GUS spot을 확인하였으며, 따라서 KYRT1 이 외래 유전자의 전달효율이 더 높은 것으로판단되었다. 하지만 공배양 후 아그로박테리움의 제거가 어려워 자엽마디 주위에 아그로박테리움이 계속적으로 증식함에 따라 콩의 자엽마디에서 신초를 형성하지 못하거나, 신초를 형성하더라도 아그로박테리움으로 인하여 곧 고사하고 말았다 (자료 미제시).
후속연구
- 3% 제초제를 처리하였을 때 대조구와 마찬가지로 제초제 저항성을 나타내지 못하고 고사한 것으로 여겨진다. 보다 효율적인 형질전환 체계를 완성하기 위해서는 앞으로 유전자의 안정적인 도입 및 발현과 관련하여 더욱 깊은 연구가 필요할 것으로 생각된다. 0.
- 8%)의 제초제 저항성 식물체를 확보할 수 있었으며 나머지 모든 개체들은 제초제에 저항성을 나타내지 못하고 대조구와 마찬가지로 고사하였다 (Figure 1). 앞선 재분화율 검정에서 보인 높은 재분화율과는달리 재배품종에 따라 현저하게 낮은 형질전환율을 보이고있으므로, 향후 재현성 있는 콩의 형질전환 체계를 위해서는 최적의 콩 품종을 선발하는 것 외에도 적절한 벡터 및 아그로박테리움의 종류, 공배양 조건의 확립, 재분화체계 등이 반드시 극복되어야 할 것으로 생각된다.
- 본 실험 수행결과 형질전환 콩을 개발하기 위한 적합한 조건을 확립하였으며, 이를 통해 제초제 저항성 유전자가 삽입되어 발현하는형질전환 콩을 개발하였고, GUS발색 반응 및 분자생물학적기술을 이용하여 검정하였다. 향후 이러한 형질전환 체계를이용하면 제초제 저항성 유전자 외에도 다른 유용유전자가도입된 유전자변형 콩을 개발할 수 있을 것으로 기대된다.
- 순화된 형질전환체 중 GUS발색 반응에서양성반응을 보이는 식물체들을 PCR을 이용하여 검정하였으며, 제초제 (Basta®)살포와 Southern분석을 통해 제초제저항성 유전자가 도입되어 발현되는 형질전환체를 확인하였다. 현재 후대로의 유전양상과 도입된 유전자가 안정적으로 발현하는지의 여부를 실험중이다.
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