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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 토사자 에탄올 추출물의 항산화 효과와 항돌연변이 활성을 분석하여 새로운 생리활성 물질 의 탐색과 고부가가치 기능성식품 소재로서의 유용성을 알 아보고자 하였다
- 본 연구에서는 토사자 에탄올 추출물의 항산화 효과와 항돌연변이 활성을 분석하였다. 토사자 에탄올 추출물은 100 ppm, 200 ppm의 농도에서 BHH보다 높은 항산화 활성을 나타내었다.
가설 설정
- 1) Data are expressed as means ± SD of histidine positive revertant colonies on plates.
제안 방법
- Korea)에서 분양받아 돌연변이 및 항돌연변이능을 측정하였다. 균주는 액체질소에 보관하면서 사용하였고, 정기적으로 이들 균주의 histidine 요구성, deep rough(rfa) 돌연변이, uvrB 돌연변이 및 R factor 등의 유전형질을 확인하였다. 돌연변이 유발물질로는 직접돌연변이 물질인 sodium azide와 4-NQO를 사용하였다.
- Sodium azide는 증류수에 녹여 사용하였고, 4-NQO는 DMSO에 녹여 사용하였다. 돌연 변이원의 사용량은 예비실험을 통해 dose response test를 실시하여 최적의 농도를 결정한 후 사용하였다.
- 시료의 농도는 미리 독성 실험을 실시하여 돌연변이 능이 나타나지 않는 범위 내에서 결정하였다. 멸균된 cap tube에변이원 50 μL와 시료 50 μL, 균 100 μL를 넣고 0.
- 저장하면서 사용하였다. 시료의 에탄올 추출물은 건조시료를 분쇄한 후, 100 g에 70% 에탄올을 가하여 실온에서 12시간 동안 5번씩 추출하여 총 2 L의 에탄올 추출물을 얻었다. 이를 여과지 (Advantec.
- 대조군으로는 수용성 천연항산화제인 L-ascorbic acid 와 합성항산화제인 BHH를 사용하였다. 시료의 전자공여능 은 측정된 흡광도 값으로부터 먼저 Inhibition (%)= (1-시료 첨가구의 O.D/시료무첨가구의 O.D) X 100을 구한 다음 inhibition과 시료농도 사이의 관계식을 구하여 자유 라디칼 의 활성을 50%로 저해하는데 필요한 농도인 IC50의 값을 구하였다.
- 토사자 추출물의 돌연변이원성 억제 작용을 검토하기 위하여 직접변이원으로 알려진 sodium azide와 4-NQO< 사용하여 염기쌍 치환 변이주인 Salmonella typhimurium TAI00 에 대한 추출물의 항돌연변이능을 실험하였다. 본 실험에 사용한 직접돌연변이원은 세포 내의 DNA 정보 발현에 직 접적으로 손상을 주어 돌연변이를 유발하는 물질이다
대상 데이터
- (USA)로부터 구입흐}였으며, nutrient broth 와 agar는 Acumedia Co.(Lansing, Mich, USA)의 제품을 사용하였다.
- Salmonella typhimurium TAI00 균주는 한국생명공학연구원(Daejeon, Korea)에서 분양받아 돌연변이 및 항돌연변이능을 측정하였다. 균주는 액체질소에 보관하면서 사용하였고, 정기적으로 이들 균주의 histidine 요구성, deep rough(rfa) 돌연변이, uvrB 돌연변이 및 R factor 등의 유전형질을 확인하였다.
- , Korea, 37℃) 에서 30분간 반응시킨 후 UV/Visible spectrophotometer (Beckman, USA)를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 즉정하였다. 대조군으로는 수용성 천연항산화제인 L-ascorbic acid 와 합성항산화제인 BHH를 사용하였다. 시료의 전자공여능 은 측정된 흡광도 값으로부터 먼저 Inhibition (%)= (1-시료 첨가구의 O.
- 균주는 액체질소에 보관하면서 사용하였고, 정기적으로 이들 균주의 histidine 요구성, deep rough(rfa) 돌연변이, uvrB 돌연변이 및 R factor 등의 유전형질을 확인하였다. 돌연변이 유발물질로는 직접돌연변이 물질인 sodium azide와 4-NQO를 사용하였다. Sodium azide는 증류수에 녹여 사용하였고, 4-NQO는 DMSO에 녹여 사용하였다.
- 본 실험에서 사용된 토사자는 대구 약령시에서 유통되는건조된 형태의 한약규격품을 구입하여 분쇄한 후, -4℃에서저온 저장하면서 사용하였다. 시료의 에탄올 추출물은 건조시료를 분쇄한 후, 100 g에 70% 에탄올을 가하여 실온에서 12시간 동안 5번씩 추출하여 총 2 L의 에탄올 추출물을 얻었다.
- 증류수로 최종 부피를 25 mL로 맞추고 상온에서 2시간 반응시킨 뒤 UV/Visible spectrophotometer를 이용하여 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로는 hesperitin을 사용하였다.
데이터처리
- 2) The values are significantly different from that of the control value at * p<0.05 by Student's t-test.
- 2) Values in the same column with the different case letters are significantly different (p<0.05) by Duncan's multiple range test.
- , Chicago, IL)을 이용하여 통계처리하였다. 각 실험군의 유의성은 분산분석(ANOVA)을 실시한 후 p<0.05 수준에서 Duncan's multiple range test로 검정하였다. 또한 돌연변이능 측정에서 시료와 대조군간의 차이를 검정하기 위해Student's t-test를 사용하였다.
- 05 수준에서 Duncan's multiple range test로 검정하였다. 또한 돌연변이능 측정에서 시료와 대조군간의 차이를 검정하기 위해Student's t-test를 사용하였다.
- 모든 실험 결과는 SPSS 프로그램(V. 11, SPSS Inc., Chicago, IL)을 이용하여 통계처리하였다. 각 실험군의 유의성은 분산분석(ANOVA)을 실시한 후 p<0.
이론/모형
- 1. The electron donating ability of ethanol extract from Cuscutae semen using the DPPH assay. Mean with the different letters are significantly different (p<0.
- 토사자 에탄올 추출물의 전자공여능은 Blois MS(1958)의 방법에 의해 측정하였다. 0.
- 토사자 추출물의 총 폴리페놀 함량 측정은 Folin-Ciocalteu (FC)법에 따라 시행되었다(Pellegrini N 등 1999). 증류수 5 mL, 시료 1 mL 및 FC reagent 0.
- 토사자의 돌연변이 및 항돌연변이 활성은 Maron DM과 Ames BN(1983)의 방법에 따라 측정하였다. 먼저 master plate에 배양한 S.
- 플라보노이드 함량 측정은 Moreno MI 등(2000)의 방법에 따라 즉정하였다. 10% aluminum nitrate 0.
성능/효과
- Table 1과 같이 토사자 에탄올 추출물은 실험 농도인 0.5 mg/mL, 1 mg/mL, 5 mg/mL에서 돌연변이를 유발하지 않은 반면, sodium azide 및 4-NQO와 같은 돌연변이원은 대 조군에 비해 복귀돌연변이의 숫자를 유의하게 증가시켜 시료의 농도가 항돌연변이 실험을 하기에 적합함을 확인할 수 있었다. 토사자 에탄올 추출물의 sodium azide에 대한 항돌연변이 효과는 Table 2에 제시되어 있다.
- 또한 토사자 에탄올 추출물의 항산화 활성은 Park CS(2005)어) 의해 보고된 당귀(68%), 목통(62%), 골담초(65%) 의 500 ppm에서의 항산화 활성보다 높게 나타났고, Park YS(2002)에 의해 보고된 황기, 국화, 구기자. 감초, 당귀, 대추, 작약, 천궁의 항산화 활성보다 높은 것으로 나타났다. 토사자 에탄올 추출물의 IC 항돌연변이 물질이 활성을 나타내는 기작은발암원의 흡수를 방해하거나 발암원과 DNA가 결합하여 DNA adducts를 형성하는 것을 감소시켜 암 발생을 억제시키는 것으로 알려져 있다(Steele VE와 Kelloff GJ 2005). 따라서 본 연구에서 토사자 에탄올 추출물이 높은 DPPH 라디칼 소거능을 가지고 있음을 볼 때 토사자 에탄올 추출물이 자유 라디칼에 의해 유도되는 DNA 손상을 감소시키는데 도움을 줄 수 있었을 것으로 보여진다.
- 2%의 저해 효과를 나타내었다. 또 다른 직 접돌연변이원인 4-NQO로 유도된 돌연변이에 대해 토사자 에탄올 추출물은 매우 높은 돌연변이 억제능을 나타내었다. 토사자 에탄올 추출물을 0.
- 토사자 추출물은 본 연구에서 사용한 농도에서는 돌연변이를 유발하지 않았으며, 직접돌연변이원인 4-NQO 에 의해 유발된 돌연변이를 90% 이상 억제시키는 효과를보여주어 우수한 항돌연변이능을 가지고 있는 것으로 나타났다. 또한 토사자 에탄올 추출물은 폴리페놀 화합물을 다량 함유하고 있어 이들 항산화 물질이 토사자의 항산화 효과와 항돌연변이 활성에 영향을 주었을 것으로 사료되었다. 본 연구 결과 토사자 에탄올 추출물은 항산화 효과와 함께돌연변이 유발을 억제하는 항돌연변이 활성을 가지는 것으로 나타나 천연항산화제 및 고부가가치의 기능성식품 신소재로서 이용될 가능성을 보여주었다.
- 본 실험 결과, 토사자 에탄올 추출물은 직접 돌연변이 원에 대한 항돌연변이 효과가 우수하였으며, S. typhimurium TA100에 의해 검출되는 염기쌍 치환 돌연변이를 효과적으로 억제하였다. 항돌연변이 물질이 활성을 나타내는 기작은발암원의 흡수를 방해하거나 발암원과 DNA가 결합하여 DNA adducts를 형성하는 것을 감소시켜 암 발생을 억제시키는 것으로 알려져 있다(Steele VE와 Kelloff GJ 2005).
- 또한 토사자 에탄올 추출물은 폴리페놀 화합물을 다량 함유하고 있어 이들 항산화 물질이 토사자의 항산화 효과와 항돌연변이 활성에 영향을 주었을 것으로 사료되었다. 본 연구 결과 토사자 에탄올 추출물은 항산화 효과와 함께돌연변이 유발을 억제하는 항돌연변이 활성을 가지는 것으로 나타나 천연항산화제 및 고부가가치의 기능성식품 신소재로서 이용될 가능성을 보여주었다.
- 또한 일부플라보노이드 화합물 또한 alkylperoxyl 라디칼 소거능을 가지고 있어 자유 라디칼로 인해 발생하는 여러 질환과 암발생을 억제시킨다고 보고되었다(Jimenez-Escrig A 등 2001). 본 연구에서 토사자 에탄올 추출물은 다른 일부 생약재들에 비해 비교적 높은 함량의 폴리페놀과 플라보노이드를함유하어 토사자 에탄올 추출물이 높은 DPPH 라디칼 소거능을 보인 것은 추출물에 포함된 폴리페놀 및 플라보노이드 화합물과 연관이 있을 것으로 보여진다. 또한 폴리페놀함량이 플라보노이드 함량보다 높은 것으로 보아 플라보노이드 외의 다른 폴리페놀 화합물들도 토사자의 항산화 활성에 기여하는 것으로 사료된다.
- 토사자 에탄올 추출물은 비교적 저농도인 100 ppm, 200 ppm에서는 합성항산화제인 BHH보다 유의적으로 높은 항산화 활성을 나타내었고, 300 ppm, 400 ppm, 500 ppm의 농도에서는 BHT의 항산화 활성과 유의적으로 차이가 없는 것으로 나타나 토사자 에탄올 추출물이 높은 항산화 활성을 가지고 있음을 보여주었다. 본 연구의 토사자 에탄올 추출물은 400 ppm에서 81.7%의 전자공여능을 나타내어 Kim EY 등(2004)에 의해 보고된 토사자 열수 추출물의 전자공여능(57.5%)보다높았다. 또한 토사자 에탄올 추출물의 항산화 활성은 Park CS(2005)어) 의해 보고된 당귀(68%), 목통(62%), 골담초(65%) 의 500 ppm에서의 항산화 활성보다 높게 나타났고, Park YS(2002)에 의해 보고된 황기, 국화, 구기자.
- 토사자 에탄올 추출물의 sodium azide에 대한 항돌연변이 효과는 Table 2에 제시되어 있다. 토사자 에탄 올 주줄물을 0.5 mg/mL, 1 mg/mL, 5 mg/mL의 농도로 첨 가하였을 때 sodium azide에 의한 돌연변이에 대해 각각 4.1%, 21.1%, 49.2%의 저해 효과를 나타내었다. 또 다른 직 접돌연변이원인 4-NQO로 유도된 돌연변이에 대해 토사자 에탄올 추출물은 매우 높은 돌연변이 억제능을 나타내었다.
- 활성을 분석하였다. 토사자 에탄올 추출물은 100 ppm, 200 ppm의 농도에서 BHH보다 높은 항산화 활성을 나타내었다. 토사자 추출물은 본 연구에서 사용한 농도에서는 돌연변이를 유발하지 않았으며, 직접돌연변이원인 4-NQO 에 의해 유발된 돌연변이를 90% 이상 억제시키는 효과를보여주어 우수한 항돌연변이능을 가지고 있는 것으로 나타났다.
- 대한 전자공여 효과도 증가하였다. 토사자 에탄올 추출물은 비교적 저농도인 100 ppm, 200 ppm에서는 합성항산화제인 BHH보다 유의적으로 높은 항산화 활성을 나타내었고, 300 ppm, 400 ppm, 500 ppm의 농도에서는 BHT의 항산화 활성과 유의적으로 차이가 없는 것으로 나타나 토사자 에탄올 추출물이 높은 항산화 활성을 가지고 있음을 보여주었다. 본 연구의 토사자 에탄올 추출물은 400 ppm에서 81.
- 또 다른 직 접돌연변이원인 4-NQO로 유도된 돌연변이에 대해 토사자 에탄올 추출물은 매우 높은 돌연변이 억제능을 나타내었다. 토사자 에탄올 추출물을 0.5 mg/mL, 1 mg/mL, 5 mg/mL의 농도로 처리 시 각각 91.3%, 91.6% 및 98.4%의 저해율을 보여, 실험에 사용된 모든 농도에서 90% 이상의 항돌연변 이 활성을 갖는 것으로 나타났다(Table 3). 토사자 에탄올 추출물의 농도가 증가할수록 두 가지의 직접돌연변이원에 의해 유발된 돌연변이 저해 효과가 높아졌으며, sodium azide보다는 4-NQO에 대하여 상대적으로 더 높은 돌연변 이 유발 억제 능력을 보였다.
- 감초, 당귀, 대추, 작약, 천궁의 항산화 활성보다 높은 것으로 나타났다. 토사자 에탄올 추출물의 IC50 값(89.4 ppm)은 Kim BS 등 (1997)에 의해 보고된 토사자의 hexane, chloroform, butanol 및 열수 추출물보다 낮아 본 연구에서 추출된 토사자 에탄올 추출물이 더 높은 항산화 활성을 가지고 있는 것으로 나타났다.
- 4%의 저해율을 보여, 실험에 사용된 모든 농도에서 90% 이상의 항돌연변 이 활성을 갖는 것으로 나타났다(Table 3). 토사자 에탄올 추출물의 농도가 증가할수록 두 가지의 직접돌연변이원에 의해 유발된 돌연변이 저해 효과가 높아졌으며, sodium azide보다는 4-NQO에 대하여 상대적으로 더 높은 돌연변 이 유발 억제 능력을 보였다. 토사자 에탄올 추출물의 변이 원 sodium azide에 대한 항돌연변이 활성은 Ahn BY 등 (1999)에 의해 보고된 단삼의 항돌연변이 활성(26%)보다 높게 나타났고, 변이원 4-NQO에 대한 항돌연변이 활성 역시 Ahn BY 등(1999)에 의해 보고된 생약재 빈랑의 항돌연 변이 활성(71%)보다 높게 나타났으며, Lee KI 등(1992)의 연구에서 보고된 비름(92%), 콩나물(94%)의 항돌연변이 활 성과 비슷하게 나타났다
- 토사자 에탄올 추출물의 농도가 증가함에 따라 DPPH 라디칼에 대한 전자공여 효과도 증가하였다. 토사자 에탄올 추출물은 비교적 저농도인 100 ppm, 200 ppm에서는 합성항산화제인 BHH보다 유의적으로 높은 항산화 활성을 나타내었고, 300 ppm, 400 ppm, 500 ppm의 농도에서는 BHT의 항산화 활성과 유의적으로 차이가 없는 것으로 나타나 토사자 에탄올 추출물이 높은 항산화 활성을 가지고 있음을 보여주었다.
- 측정한 결과는 Table 4에 제시되어 있다. 토사자 에탄올 추출물의 총 폴리페놀 함량은 20.1 mg/g이고 플라보노이드 함량은 1.9 mg/g으로 나타났다. 토사자 에탄올 추출물의 폴리페놀 함량은 황기, 작약 에탄올 추출물보다 높았으며, 국화, 감초, 당귀 에탄올 추출물보다는 낮게 나타났다(Park YS 2002).
- 토사자 에탄올 추출물은 100 ppm, 200 ppm의 농도에서 BHH보다 높은 항산화 활성을 나타내었다. 토사자 추출물은 본 연구에서 사용한 농도에서는 돌연변이를 유발하지 않았으며, 직접돌연변이원인 4-NQO 에 의해 유발된 돌연변이를 90% 이상 억제시키는 효과를보여주어 우수한 항돌연변이능을 가지고 있는 것으로 나타났다. 또한 토사자 에탄올 추출물은 폴리페놀 화합물을 다량 함유하고 있어 이들 항산화 물질이 토사자의 항산화 효과와 항돌연변이 활성에 영향을 주었을 것으로 사료되었다.
- 또한 토사자 에탄올 추출물은 둥글레, 하수오, 황기 및 황정 열수 추출물에 비해 더 많은 플라보노이드를 함유하고 있었다(Kim EY 등 2004). 토사자에 함유된 폴리페놀 함량은 플라보노이드 함량보다 10배 이상 높게 나타났다. Kim EY 등(2004)은 20여종의 약용식물 열수 추출물의 폴리페놀 및 플라보노이드 함량을 측정한 결과대부분의 식물에서 폴리페놀의 함량이 높을수록 항산화 활성이 높았으며 폴리페놀의 함량이 플라보노이드의 함량보다 현저히 많은 식물에서 항산화 활성이 높게 나타났다고보고하였다.
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