Objective: The purpose of this study was to evaluate on the antimicrobial effect on the periodontal pathogens and anti-inflammatory effect of Eriobotryae folium. Eriobotryae folium are constituent herbs of Gagamgamroum, which has been used for a long time in oriental medicine as a herbal medicine fo...
Objective: The purpose of this study was to evaluate on the antimicrobial effect on the periodontal pathogens and anti-inflammatory effect of Eriobotryae folium. Eriobotryae folium are constituent herbs of Gagamgamroum, which has been used for a long time in oriental medicine as a herbal medicine for treating halitosis and toothache. Method: Eriobotryae folium was prepared by extracting medicinal herb with water. We investigated antimicrobial activity by the minimum inhibitory concentration (MIC) test. We also investigated inhibition of $IL-1{\beta}-induced$ collagenase (mmp-1), stromelysin-1 (mmp-3), interleukin-6 gene expression in human gingival fibroblasts using RTPCR analysis. Result: The antimicrobial effects of Eriobotryae folium was evaluated with MIC against periodontopathogens; Porphyromonas gingivalis 2561, W50, A7A1-28, 9-14K-1, Prevotella intermedia 28, and Actinobacillus actinomycetemcomitans Y4. MICs of Eriobotryae folium were 1.25 mg/ml, 2.5 mg/ml, 0.625 mg/ml, 1.25 mg/ml, 10 mg/ml and 10 mg/ml. The anti-inflammatory effect of Eriobotryae folium was evaluated with influence of herbs on the $IL-1{\beta}-induced$ expression of mmp-1, mmp-3, and interleukin-6. $IL-1{\beta}$ increased mmp-1, mmp-3, and interleukin-6 mRNA levels. Eriobotryae folium significantly inhibited $IL-1{\beta}-induced$ mmp-1, mmp-3, and interleukin-6 gene expressions in a dose-dependent manner. Conclusion: These results suggested that Eriobotryae folium might reduce the excessive proteolytic capacity of the gingival fibroblast during inflammation and could be developed as a new drug for periodontitis.
Objective: The purpose of this study was to evaluate on the antimicrobial effect on the periodontal pathogens and anti-inflammatory effect of Eriobotryae folium. Eriobotryae folium are constituent herbs of Gagamgamroum, which has been used for a long time in oriental medicine as a herbal medicine for treating halitosis and toothache. Method: Eriobotryae folium was prepared by extracting medicinal herb with water. We investigated antimicrobial activity by the minimum inhibitory concentration (MIC) test. We also investigated inhibition of $IL-1{\beta}-induced$ collagenase (mmp-1), stromelysin-1 (mmp-3), interleukin-6 gene expression in human gingival fibroblasts using RTPCR analysis. Result: The antimicrobial effects of Eriobotryae folium was evaluated with MIC against periodontopathogens; Porphyromonas gingivalis 2561, W50, A7A1-28, 9-14K-1, Prevotella intermedia 28, and Actinobacillus actinomycetemcomitans Y4. MICs of Eriobotryae folium were 1.25 mg/ml, 2.5 mg/ml, 0.625 mg/ml, 1.25 mg/ml, 10 mg/ml and 10 mg/ml. The anti-inflammatory effect of Eriobotryae folium was evaluated with influence of herbs on the $IL-1{\beta}-induced$ expression of mmp-1, mmp-3, and interleukin-6. $IL-1{\beta}$ increased mmp-1, mmp-3, and interleukin-6 mRNA levels. Eriobotryae folium significantly inhibited $IL-1{\beta}-induced$ mmp-1, mmp-3, and interleukin-6 gene expressions in a dose-dependent manner. Conclusion: These results suggested that Eriobotryae folium might reduce the excessive proteolytic capacity of the gingival fibroblast during inflammation and could be developed as a new drug for periodontitis.
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문제 정의
비파엽 추출물이 치은섬유아세포의 세포활성을 억제시키는지 알아보고자 MTS assay를 시행하였다. 비파엽 500 ㎍/ml이하의 농도들에서 세포활성도가 유의한 변화를 나타내지 않았다.
이러한 선행연구를 바탕으로 枇杷葉의 치주염세균에 대한 항균효과 및 항염효과를 알아보고자 齒周炎의 原因菌들 중 Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Actinobacillus actinomycetemcomitans 에 대한 枇杷葉의 亢菌作用를 조사하고, 치은섬유아세포(Human Gingival Fibroblast)를 배양하여 IL-1β로 MMP-1, MMP-3, IL-6를 活性化시킨 후 枇杷葉의 추출물을 처치하여 MMP-1과 MMP-3 및 IL-6 활성억제 효과를 관찰하여 유의성 있는 결과를 얻었기에 이에 보고하는 바이다.
치주염과 관련한 혐기성 세균들에 대한 연구는 Socransky(1970)에 의해 시작되었고, 1976년 Loesche, Slots 및 Newman 등에 의해 혐기성 세균 분리 검정이 시작되면서 본격화 되었다25). 치주질환 환자에게 항생제를 투여하는 목적은 통상적인 기계적 치주치료 후에 남아있는 치은연하 세균을 제거함으로써 감염을 극복하는데 있어서 숙주의 방어작용을 지지하고 기계적 치주 치료의 효과를 강화하는 데 있다. 그러나 치주염 환자에게 항생제인 tetracycline, metronidazole 및 clindamycin의 부가적 치료 후 임상적 치주 지수 등이 향상되었다는 보고가 있으나 구강 내 세균에서 기존의 항생제에 대한 내성균들이 확인되면서 항생제의 적용에 대한 한계를 드러내었다.
한의학에서 구취 및 어혈치통에 사용하는 처방인 加減甘露飮의 구성 약재중 비파엽의 치주염치료제의 가능성을 알아보고자 치주염 원인균에 대한 항균효과와 치주조직 파괴 및 치조골 흡수에 관여하는 효소인 MMP-1과 MMP-3와 cytokine 중 IL-6의 활성 억제에 대한 실험을 시행하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
항염제에 대한 연구는 치주질환의 진행 및 조직파괴와 관련한 중요한 요소인 cytokine, prostaglandin, collagenase 등에 관련된 것으로, 이는 염증의 과정이 세균의 감염에 대한 숙주의 반응과정에서 각종의 염증성 cytokinee이 분비되고 다시 염증성 cytokine에 의해서 prostaglandin이나 collagenase 등이 활성화되어 조직을 파괴하는 일련의 과정을 억제 내지는 중지하고자 함이다.
제안 방법
또한 보다 정확히 하기 위하여 각각의 well에서의 배양액을 일부 취하여 agM배지에 배양하였다. 48시간 37℃ 혐기 배양한 후 결과를 관찰하여 흡광도 값으로 결정된 MIC 값을 보정하였다.
actinomycetemcomitans 균주는 10% CO2 37℃ 배양기에서 24시간 배양한다. 570 nm 파장에서 흡광도를 측정하고, 약물처리하지 않은 대조군의 값을 참조하여 MIC를 결정하였다. 또한 보다 정확히 하기 위하여 각각의 well에서의 배양액을 일부 취하여 agM배지에 배양하였다.
비파엽 500 ㎍/ml이하의 농도들에서 세포활성도가 유의한 변화를 나타내지 않았다. 따라서 본 연구에서는 세포활성을 저해하지 않는 것으로 확신할수 있는 비파엽 500 ㎍/ml이하의 농도를 적용하였다 (Fig. 1).
)를 이용하여 제조사의 지시내로 3-(4,5-dimethyl-thiazole-w-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide 용액 20 μl 첨가하고 4시간 동안 배양하였다. 반응이 끝난 후 ELISA plate reader(Microplate manager, BioRad, U.S.A)로 파장 490nm에서의 흡광도를 측정하였다. 이 실험을 3회 반복 시행하였으며 각각의 추출물 농도에 대한 세포활성도 효과는 O.
세포를 24~36시간 배양 후 10% FBS를 포함된 DMEM 배양액으로 교환하고 해당 농도의 추출물을 첨가하였다. 배양 2일 후에 MTS assay를 시행하였다. 각 well에서 배양액을 제거하고 생리식염수로 2회 세척 후 Cell Titer 96 Aqueous Cell Proliferation Assay kit(Promega, U.
아무것도 처치하지 않은 군을 음성대조군으로, IL-1β만 적용한 군을 IL-1β 자극군, 추출물의 농도별(100, 200, 500 μg/ml)로 처치 후 IL-1β로 자극한 군으로 하였으며 각 군들에 적절한 처치를 시행한 후 12시간 동안 배양하였다. 배양 후 Trizol-reagent (Promega, U.S.A.)를 이용하여 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA에서 reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)을 수행하여 cDNA를 합성하고, cDNA를 증폭하였다.
세절한 치은조직은 조직의 가장자리가 잘 부착되도록 주의하면서 dish에 잘 펴놓은 후 pipette을 이용하여 각 dish 당 2ml 의 배양액을 주입하여 37℃, 5% CO2, 습도 100% 배양기 (Shel-Lab, USA)에서 배양하였다. 배양액으로는 10% FBS와 1% 항생제를 첨가한 a-MEM을 사용하고 단일 세포층이 형성될 때까지 3일 간격으로 교환하였다. Petri dish (Corning Co.
)를 이용하여 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA에서 reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)을 수행하여 cDNA를 합성하고, cDNA를 증폭하였다. 사용한 primer 는 다음과 같다.
사용하였다. 비파엽 92g에 상수 1000ml을 가하여 대웅약탕기에 본탕과 재탕을 하는 방식으로 2회 추출하였다. 이렇게 얻어진 추출액을 농축하고 동결 건조하여 DMSO(Dimethylsulfbxide)에 20 mg/ml로 녹여서 실험 시료로 사용하였다.
세포가 밀생에 도달하면 10% FBS가 포함된 DMEM 배양액으로 교환하여 12-14시간 동안 다시 배양하였다. 사람 치은 섬유아세포에서 추출물에 의한 MMP-1, MMP-3, IL-6 유전자들의 억제 효과를 비교하기 위하여 5개 군으로 나누어 처치하였다. 아무것도 처치하지 않은 군을 음성대조군으로, IL-1β만 적용한 군을 IL-1β 자극군, 추출물의 농도별(100, 200, 500 μg/ml)로 처치 후 IL-1β로 자극한 군으로 하였으며 각 군들에 적절한 처치를 시행한 후 12시간 동안 배양하였다.
사랑니 발치를 위하여 내원한 세 명의 환자 의제 3 소구치를 발치하면서 발치와 주위의 치은을 절제하였다. 절제한 치은은 40% 우태아 혈청(fetal bovine serum<FBS>, Gibco Co.
)에 12,500 cell/well로 분주하였다. 세포를 24~36시간 배양 후 10% FBS를 포함된 DMEM 배양액으로 교환하고 해당 농도의 추출물을 첨가하였다. 배양 2일 후에 MTS assay를 시행하였다.
사람 치은 섬유아세포에서 추출물에 의한 MMP-1, MMP-3, IL-6 유전자들의 억제 효과를 비교하기 위하여 5개 군으로 나누어 처치하였다. 아무것도 처치하지 않은 군을 음성대조군으로, IL-1β만 적용한 군을 IL-1β 자극군, 추출물의 농도별(100, 200, 500 μg/ml)로 처치 후 IL-1β로 자극한 군으로 하였으며 각 군들에 적절한 처치를 시행한 후 12시간 동안 배양하였다. 배양 후 Trizol-reagent (Promega, U.
절제한 치은은 40% 우태아 혈청(fetal bovine serum, Gibco Co., Grand Island, NY, USA)와 20% 항생제 (penicillin G, streptomycin, amphotericin B 포함, Gibco co., Grand Island, NY, USA)가 첨가된 a-minimum essential medium (a-MEM, L-glutamine 포함, Gibco Co., Grand Island, NY, USA)에서 3회 세척하였다.
100mm dish(Corning-Costar, U.S.A.)에 치은섬유아세포를 분주하고 10% FBS 가 함유된 DMEM 배지에 배양하였다. 배양액은 세포가 밀생에 도달할 때까지 3일 간격으로 교환하였다.
Porphyromonas gingivalis 2561, W50, A7A1-28, 9-14K-1 와 Prevotella intermedia 참고 균주를 80% N2, 10% H2, 및 10% CO2를 함유한 37℃ 혐기성 세균 배양기(Shelcon Manufacturing Inc., Cornelius, OR, USA) 에서 hemin (5 μg/ml)과 vitamin K1 (0.2 μg/ml) 이 첨가된 harf-strength BHI (HK-BHI) 배지에서 48시간 배양하여 사용하였고, Actinobacillus actinomycetemcomitans 참고 균주를 10% CO2 배양기 (Vision Co., Seoul, Korea)에서 thioglycollate(Difco LAB. Co., Detroit, MI, USA) 액체배지에 배양하여 사용하였다.
본 실험에 사용한 비파엽(Eriobotrya Japonica, 원산지 중국)은 서울 노원구 상계동 소재 임수훈 약업사를 통해 구입하여 사용하였다. 비파엽 92g에 상수 1000ml을 가하여 대웅약탕기에 본탕과 재탕을 하는 방식으로 2회 추출하였다.
데이터처리
모든 측정값은 평균값 ± 표준오차(Mean ± standard error)로 나타내었으며, oneway - ANOVA로 통계 검정한 뒤 Newman-Keuls 방법을 사용하여 사후 분석하였다. 유의수준 p < 0.
A)로 파장 490nm에서의 흡광도를 측정하였다. 이 실험을 3회 반복 시행하였으며 각각의 추출물 농도에 대한 세포활성도 효과는 O.D. 값으로 표시하였다.
이론/모형
Porphyromonas gingivalis, P. intermedia, A. actinomycetemcomitans 균주와 추출물의 최소억제농도 (minimum inhibitory concentration, MIC)를 측정하기 위해 액체배지 희석법을 이용하였다. 액체배양시킨 균주액을 희석하여(1/25)하여 96 well plate에 0.
성능/효과
MMP-1과 MMP-3를 가장 효과적으로 발현시키기 위한 IL-1β의 농도와 시간을 결정하기위하여 100mm dish에서 배양된 치은섬유아세포가 밀생상태에 이르면 IL-1β처리 24시간 전에 항생제를 배제한 0.1% FBS가 함유된 DMEM로 교체하여 24시간 배양 후 IL-1β를 첨가하지 않는 군을 대조군으로 하고 0.01, 0.10, 1.00, 2.00 ㎍/㎖ 농도의 IL-1β를 첨가하여 12, 24, 36, 48시간 배양한 다음 RT-PCR을 이용하여 각 농도에 따른 MMP-1과 MMP-3의 발현을 평가하여 본 결과, MMP-1과 MMP-3를 발현시키기 위한 가장 효과적인 IL-1β의 기준 농도와 시간은 각각 0.1 ㎍/㎖와 12시간인 것으로 관찰되었다(Fig. 2).
둘째, 배양된 사람의 치은섬유아세포에 IL-1β로 MMP-1과 MMP-3를 활성화 시킨 후 枇杷葉을 처리한 결과 MMP-1과 MMP-3의 활성이 유의하게 억제되었다.
본 연구에서 비파엽 추출물이 치주인대 및 치은의 파괴와 치조골의 흡수와 관련이 있는 cytokine 인 IL-1β로 활성화시킨 사람의 치은섬유아세포에서의 MMP-1, MMP-3의 활성도 억제 대한 실험을 진행하였는데, IL-1β로 사람의 치은섬유아세포에서 MMP-1과 MMP-3가 활성화 된다는 것은 이미 밝혀졌는데 본 실험에서도 배양한 치은섬유아세포에 IL-1β를 투여하여 MMP-1과 MMP-3의 활성화가 확인 되었고, 비파엽 추출물을 처치하여 MMP-1와 MMP-3의 활성이 억제되는 것을 확인하였다. 이는 비파엽이 치주염에서 치주조직의 파괴를 억제함으로써 염증을 조절할 수 있음을 의미한다.
이는 비파엽이 치주염에서 치주조직의 파괴를 억제함으로써 염증을 조절할 수 있음을 의미한다. 본 연구에서는 IL-1β로 배양된 사람의 치은섬유아세포에서 IL-6가 활성화 되는 것도 확인할 수가 있었으며 비파엽이 IL-6의 활성도 억제하는 것도 확인할 수가 있었다. 이 역시 치주질환에서 치주 염증의 억제를 확인해 주는 결과라 할 수 있다.
본 연구에서는 한의학적으로 치주염과 관련이 있는 비파엽의 약재를 선정하여 치주염 원인균에 대한 항균효과에 대하여 알아보기 위하여 혐기성 그란음성균인 Porphyromonas gingivalis 2561, W50, A7A1-28, 9-14K-1, Prevotella intermedia28, 통기성 그람 음성균인 Actinobacillus actinomycetemcomitans Y4에 대한 최소성장억제농도(MIC)를 측정하였는데 비파엽(枇把葉) 추출물이 Porphyromonas gingivalise에세는 MIC가 0.625mg/ml~2.5mg/ml 최소 억제 효과가 나타났으며 Prevotella intermedia와 Actinobacillus actinomycetemcomitans 에서는 10mg/ml이상으로 항균효과를 인정할 수가 없었다.
사람의 치은섬유아세포에서 비파엽에 의한 IL-6 cytokine mRNA 발현 억제 효과를 관찰하기 위하여 아무것도 처치하지 않은 정상군, IL-1β만 적용한 대조군, 비파엽 100, 200 및 500 ㎍/㎖을 각각 농도별로 처치한 후 IL-1β로 자극한 실험군 등 총 5개의 군으로 나누어 실험한 결과, IL-6에 대해서 대조군에 비하여 실험군의 농도별로 각각 8.1%, 57.2% (p<0.001), 91.6% (p<0.001)의 유의한 발현억제를 보였다(Fig. 4).
사람의 치은섬유아세포에서 비파엽에 의한 MMP-1, MMP-3 mRNA 발현 억제 효과를 관찰하기 위하여 아무것도 처치하지 않은 정상군, IL-1β만 적용한 대조군, 비파엽 100, 200 및 500 ㎍/㎖을 각각 농도별로 처치한 후 IL-1β로 자극한 실험군 등 총 5개의 군으로 나누어 실험한 결과, MMP-1에 대해서는 대조군에 비하여 실험군이 농도별로 각각 5.5%, 11.2%, 22.8%의 유의한 발현억제를 보였으며 (p<0.05), MMP-3에 대해서도 농도별로 각각 15.4%, 45.1% (p<0.001), 84.4% (p<0.001)의 유의한 억제율을 보였다(Fig. 3).
셋째, 배양된 사람의 치은섬유아세포에서 IL-1β로 IL-6를 활성화 시킨 후 枇杷葉을 처리한 결과 IL-6활성이 유의하게 억제되었다. 이상의 결과로 비파엽은 치주염병인균인 Porphyromonas gingivalis에 내한 抗菌作用과 MMP-1과 MMP-3 효소 및 IL-6 cytokine과 관여된 抗炎作用이 있는 것으로 確認 되었다.
IL-6활성이 유의하게 억제되었다. 이상의 결과로 비파엽은 치주염병인균인 Porphyromonas gingivalis에 내한 抗菌作用과 MMP-1과 MMP-3 효소 및 IL-6 cytokine과 관여된 抗炎作用이 있는 것으로 確認 되었다.
첫째, 此杷葉은 치주염병인균인 Porphyromonas gingivalis에서는 MIC가 0.625mg/ml~2.5mg/ml로 최소 억제 효과가 나타났다.
이상의 비파엽에 대한 항균실험 결과와 치은섬유아세포에서의 MMP-1, MMP-3 및 IL-6 유전자 발현 억제에 대한 실험결과를 볼 때 비파엽은 MMP-1과 MMP-3 및 IL-6의 유전자 발현 억제와 항균작용을 가진 약재로써 치주염의 치료 효과가 인정되며 치주염 치료제로서의 개발가능성을 시사한다.
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