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문제 정의
- 본 연구는 고추 역병 발생지역의 건전토양으로부터분리된 저영양세균 중 고추역병에 대하여 항균력을지닌 저영양세균을 선발하여 계통분류학적 특성을 검토하고 향후 식물병원균에 대한 생물학적 방제 등에활용하기 위한 기초 연구를 수행하였다.
제안 방법
- , 1993). 균체에 500“l 의 TE buffer(100mM Tris HCl, 40mM EDTA pH 8.0)를 첨가하여 잘 현탁시킨 후 100“1의 10% sodim dodecyl sulfate(SDS)와 300“1의 benzyl chloride(Katayama chemicals Co.)를 첨가하여 50"C에서 30분간 반응시켰다. 균체에 10」1의 3M sodium acetate(pH 5.
- APl 50CH를 이용하였다. 28C 항온기에서잘 배양된 균의 single colony를 0.85% NaCl의 40ml에현탁하여 API 20NE test를 수행하였다.
- 50종의 탄소원이 포함된 APl 50CH는 각각 표준방법에 의거하여 생화학적 검사를 실시하였다. API의각 당 이용별로 노란색 혹은 초록색의 색깔변화를 보이는데 노란색인 경우는 각 당을 이용할 수 있다는것을 보이는 표시이며, API에서 제공하는 웹 (www.
- in vivo test를 실시하였다. 60일 정도 자란 고추유묘에 B. vallismortis 1A(109 CFU/ml) 4ml을 토양관주 접종하고 3일후 고추역병의 포자 현탁액(104 spores/ml) 4ml 접종 하였으며 대조구로는 10mM MgSO4를 처리하여 25일간 고추역병 발생을 조사 하였다. 전형적인 고추역병 증상으로 고추의 전반부가고사되어 적갈색을 띄며 잎은 마르고 줄기부분은 말라 딱딱해지는 현상을 볼 수 있었는데 특히 대조구인경우 접종 후 5일부터 고추역병이 나타나기 시작해서 7일 이후에는 급격히 이병율이 올라가서 15일째는 76%, 25일째는 87%까지의 이병율을 보였다(Fig.
- 2加M 27F(5- AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3) primer 1此 16S rDNA sample 1“l(90ng)에 총량이 20“1가 되도록 멸균된 3차 증류수를 sequencing PCR tube에 넣고 잘 혼합한 다음 조건에 따라 cycle sequencing 반응을 실시하였다. 96C 에서 30초, 43C에서 30초, 60 C에서 4분간, 25 cycle로 수행하였다. 이렇게 얻어진 PCR 산물에 -20C에 보존된 100% ethanol 50“1와 3M sodium acetate(pH 5.
- 250“1의 70% ethanol을이용하여 세척한 다음 건조시킨 후 TSR(template suppression reagent) 20“1를 첨가하여 95C에서 2분동안 denaturation 한 후 얼음 위에서 냉각시켰다. ABI PRISM 310 Genetic Analyser (Applied Biosystems)를 사용하여 16S rDNA를 sequencing하였다.
- API의각 당 이용별로 노란색 혹은 초록색의 색깔변화를 보이는데 노란색인 경우는 각 당을 이용할 수 있다는것을 보이는 표시이며, API에서 제공하는 웹 (www.API.com)의 database를 통해 분석하였다. 이를토대로 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology16S rDNA 염기서열 분석 Chromosomal DNA 분 색 인을 이용하여 동정하였다(Holt et al.
- )으로 확인하였다. DNA 농도와 순도를 측정하기위하여 spectrophotometer로 260nm와 280nm에서 흡광도를 측정하였다.
- , 1993; Au, 1995) 94C에서 5 분간 변성시킨 뒤 94C에서 1분, 30C에서 1분30초, 72C에서 2분간, 34 cycle로 PCR을 수행하였다. PCR 증폭산물 중 1.5~1.6kb에 해당하는 단편을 0.8% agarose gel, 0.5XTAE buffer에서 100V, 25mA로 30 분간 전기영동하여 ethidium bromide에 15분간 염색하여 UV에서 확인하고 Qiagen PCR Purification Kit(Qiagen Inc.)로 정제하였다.
- Sequencing PCRe BigDye 5“1, 3.2加M 27F(5- AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3) primer 1此 16S rDNA sample 1“l(90ng)에 총량이 20“1가 되도록 멸균된 3차 증류수를 sequencing PCR tube에 넣고 잘 혼합한 다음 조건에 따라 cycle sequencing 반응을 실시하였다. 96C 에서 30초, 43C에서 30초, 60 C에서 4분간, 25 cycle로 수행하였다.
- 고추역병 뿐만 아니라 다른 식물병원균에 길항력을 가지는 1A 균주에 대하여분류 동정을 실시하였다. 주사전자현미경으로 관찰한결과 1A 균주는 전형적인 Bacillus 속에서 볼 수 있는간상형 모양과 내열성 포자가 관찰되었으며, 그람염색결과 gram positive, 운동성을 가졌으며, Bacillus 배지인 TSB 배지에서 관찰되는 형태적 특징인 묽고 끈적하게 자라는 것을 볼 수 있었다(Table 3).
- 고추역병 에 강한 활성을 가지는 11개 저영양 세균중 대표적인 5균주에 대하여 고추역병 이외의 중요한 식물병원성진균 즉 고추작물의 수확량에 피해를 입히는 고추탄저병균(Colletotrichum gloeosporioides), 딸기 잿빛곰팡이병(Botrytis cinerea), 토마토 시들음병(Fusarium oxysoporum), 인삼 잘록병(Rhizoctonia solani), 벼 도열병(Pyricularia grisea) 등 식물병원균에 대한 항균활성을 조사하였다(Table 2). 대부분의 선발 균주들은고추역병에 대하여는 강한 활성을 나타냈으나 다른식물병원균에는 약한 활성을 보였다.
- 고추역병의 포자형성을 유도하기 위하여 oat meal agar에서 1주일 동안 배양하고 다시 1주일동안 광처리를 하여 유주자낭의 형성을 유도하였다. 유주자낭으로부터 유주자를 나출 시키기 위해 4C에서 30분간 저온 처리 하였다.
- 대치 배양으로 선발된 길항미생물인 1A 균주가 고추역병에 대해 토양 내에서 실제로 그 생물학적 방제력이있는지 확인하기 위해 기주식물로는 고추를 대상으로하여 in vivo test를 실시하였다. 60일 정도 자란 고추유묘에 B.
- 운반하였다. 배지는 저영양세균의 분리용으로저영양배지인 R2A 배지와 지시균 배양용으로 PDA 배지(Potato Dextrose Agar)를 각각 사용하였으며, R2A배지의 조성은 Yeast extract, 0.5g; Proteose peptone, 0.5g; Casamino acids, 0.5g; Glucose, 0.5g; Soluble starch, 0.5g; Na-pyruvate, 0.3g; K2HPO4, 0.3g; MgS04 7H2O, 0.05g; distilled water, 1000ml이며 pH 7.0-7.2로 조정하였다. 또한, 선발된 길항균의 생리, 생화학적 실험을 위한 표준균주로써 B.
- 분리된 저영양 세균들 중에 식물병원성 진균의 항균력을 가진 세균을 선발하기 위해 PDA배지 상에서 3일정도 배양된 식물 병원성 진균에 일정간격을 두고저영양 세균(109 CFU/ml)을 1“1씩 loading 한 후 28 C 항온기에서 3일간 대치배양 하면서 inhibition zone 형성여부를 관찰하였다.
- 분리하였다. 분리된 저영양세균중 고추역병에 강한 활성을 가지는 1A 균주를 선발 하였으며 16S rDNA 와 표준균주(B. vallismortis, B. mojavensis)를 이용한 생리, 생화학적 실험으로 B. vallismortis로 최종동정 되었다. 1A균주는 Rhizpctonia, Magnaporthe 균을 제외하고 Phytophthora, Collectotrichum, Botrytis, Fusarium 균등에서 폭넓게강한 활성을 나타내었다.
- 분리한 DNA로부터 16S rRNA gene을 증폭하기 위하여 fD1(5'-AGAGTTT GATCCTGGCTCAG-3')과 rP2(5'-ACGGCTACCTTGTTACGA CTT-3') primer 를 이용하여(Zhu et al., 1993; Au, 1995) 94C에서 5 분간 변성시킨 뒤 94C에서 1분, 30C에서 1분30초, 72C에서 2분간, 34 cycle로 PCR을 수행하였다. PCR 증폭산물 중 1.
- 생리 화학적 방법에 의한 동정 선발된 저영양 세균의 생리, 생화학적 특성을 조사하기 위해 API 20NE와 APl 50CH를 이용하였다. 28C 항온기에서잘 배양된 균의 single colony를 0.
- 염기서열의 상동성은 DDBJ/NCBI/GenBank database의 Blast program을 이용하여 비교하였으며각 염기서열의 alignment는 DNA Plus version 3.0 sequence alignment program(Scientific and Educational Software)을 이용하여 병렬로 정렬하였고, MEGA version 3.0 근린 결합법에 의거하여 저영양세균의 계통분류학적 위치를 결정하였다(Saitou et al., 1987).
- 고추역병의 포자형성을 유도하기 위하여 oat meal agar에서 1주일 동안 배양하고 다시 1주일동안 광처리를 하여 유주자낭의 형성을 유도하였다. 유주자낭으로부터 유주자를 나출 시키기 위해 4C에서 30분간 저온 처리 하였다. 또한, 선발된 B.
- 정제한 16S rDNA를 주형으로 ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems)를 사용하여 염기서열을 결정하였다. Sequencing PCRe BigDye 5“1, 3.
- , 1998). 지역별로 수집된 토양시료를 평판희석법으로 저영양 배지인 R2A 배지에 배양한 결과 총 9, 354 균주가 분리되었으며 분리된 저영양 세균에 대한 고추역병(P. capsici) 길항력 검정은 대치배양으로 실시하였다. 분리된 전체 저영양세균 중 1차 대치배양한결과 고추역병에 대하여 371개의 저영양세균이 고추역병균에 대하여 생육이 저해되는 것을 관찰할 수있었다(Table 1).
- 침전된 DNA를 70% ethan이로 세척한 다음진공건조 시켰다. 최종적으로 50“1의 멸균수를 첨가하여 DNA를 추출하여 전기영동(Mupid-21, Cosmo Bio Co.)으로 확인하였다. DNA 농도와 순도를 측정하기위하여 spectrophotometer로 260nm와 280nm에서 흡광도를 측정하였다.
- akibai 와도 유사한것으로 나타났다. 최종적으로 생리, 생화학적 특성을표준균주인 B. vallismortis KACC 12149, B. mojavensis KACC 12096와 비교하여 조사 하였다. 생화학적 특성은 potassium nitrate, esculin, gelatin, 4- nitrophenyl-D-galactopyranoside를 가수분해하는 양성반응을 보였으며, L-tryptophane, D-glucose, L- arginine, urea의 효소반응에는 음성반응을 보였다.
- 최종적으로 얻어진 상등액에 동량의 2- propan이을 첨가한 후 30분간 정치하여 DNA를 침전시켰다. 침전된 DNA를 70% ethan이로 세척한 다음진공건조 시켰다. 최종적으로 50“1의 멸균수를 첨가하여 DNA를 추출하여 전기영동(Mupid-21, Cosmo Bio Co.
- 한편, 고추 역병효과를 관찰하기 위하여 원예상토에고추종자(금당)을 60일 동안 경상북도 영양고추시험장 유리온실에서 생육 시켰으며 접종은 선발된 B. vallismortis 1A 균주(109 CFU/ml)를 pot(4 cm X 4 cm X 4.5 cm)당 4ml씩 고추토양에 직접 분주 하였고 3일후 고추역병 유주자(104 spores/ml)를 4 ml씩 토양에접종하여 고추역병 발병을 유도하였으며 발생정도를 25일간 조사 하였다.
- 항진균성 활성을 가지는 저영양세균을 분리하기 위하여 토양시료는 경북 영양, 충북 제천, 충북 음성, 충북 괴산, 충남 논산 등지의 고추 밭에서 수집하였고 R2A배지를 이용하여 평판희석법으로 9, 354여 균주의저영양세균을 분리하였다. 분리된 저영양세균중 고추역병에 강한 활성을 가지는 1A 균주를 선발 하였으며 16S rDNA 와 표준균주(B.
대상 데이터
- 2로 조정하였다. 또한, 선발된 길항균의 생리, 생화학적 실험을 위한 표준균주로써 B. vallismortis KACC 12149, B. mojavensis KACC 12096 와 지시균인 P. capsici KACC 40483, Colletotrichum gloeosporioides KACC 40003, Botrytis cinerea KACC 40573, Fusarium oxysoporum KACC 40052, Rhizoctonia solani KACC 40109, Pyricularia grisea KACC 40425 등을 한국농용미생물보존센타 (KACC) 로부터 분양 받아 사용하였다.
- 식물병의 길항세균을 분리하기 위하여 경북 영양, 충북 제천, 충북 괴산, 충남논산 지역 고추밭 토양에서 역병이 발병되지 않은 고추의 근권토양을 대상으로 하여시료를 채취하고 polyethylene vinyl bag에 넣은 후 실험실로 운반하였다. 배지는 저영양세균의 분리용으로저영양배지인 R2A 배지와 지시균 배양용으로 PDA 배지(Potato Dextrose Agar)를 각각 사용하였으며, R2A배지의 조성은 Yeast extract, 0.
- 생화학적 특성은 potassium nitrate, esculin, gelatin, 4- nitrophenyl-D-galactopyranoside를 가수분해하는 양성반응을 보였으며, L-tryptophane, D-glucose, L- arginine, urea의 효소반응에는 음성반응을 보였다. 탄소원 이용성은 mannose, mannitol, N-acetyl- glucosamine, maltose, gluconate등의 당을 이용하였다 (Table 3). 따라서, 표준균주와 비교하여 보면 1A 균주는 B.
이론/모형
- 리는 benzyl chloride 방법으로 수행 하였다 (Miyagawa et al., 1993). 균체에 500“l 의 TE buffer(100mM Tris HCl, 40mM EDTA pH 8.
- 선발균주에 의한 고추역병 억제효과는 토양관주 방법으로검정하였다. 고추역병의 포자형성을 유도하기 위하여 oat meal agar에서 1주일 동안 배양하고 다시 1주일동안 광처리를 하여 유주자낭의 형성을 유도하였다.
- com)의 database를 통해 분석하였다. 이를토대로 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology16S rDNA 염기서열 분석 Chromosomal DNA 분 색 인을 이용하여 동정하였다(Holt et al., 1994).
성능/효과
- vallismortis로 최종동정 되었다. 1A균주는 Rhizpctonia, Magnaporthe 균을 제외하고 Phytophthora, Collectotrichum, Botrytis, Fusarium 균등에서 폭넓게강한 활성을 나타내었다. 고추 유묘검정에서 대조구가 89%정도의 발병율을 보인 반면에 1A 처리구에서는 29%의 발병율을 나타내어 고추역병의 길항균으로써의 미생물제제 가능성이 있는 것으로 판단된다.
- vallismortis와 99%의 유연관계를 나타내었다. 계통분류학적 분석결과는 Fig. 1 에서 보는바와 같이 1A 균주는 B. vallismortis, B. mojavensis과 가장 유연관계가 밀접한 하나의 소그룹을 형성하였고, B. licheniformis, B. subtilis, B. akibai 와도 유사한것으로 나타났다. 최종적으로 생리, 생화학적 특성을표준균주인 B.
- 1A균주는 Rhizpctonia, Magnaporthe 균을 제외하고 Phytophthora, Collectotrichum, Botrytis, Fusarium 균등에서 폭넓게강한 활성을 나타내었다. 고추 유묘검정에서 대조구가 89%정도의 발병율을 보인 반면에 1A 처리구에서는 29%의 발병율을 나타내어 고추역병의 길항균으로써의 미생물제제 가능성이 있는 것으로 판단된다.
- 이는 토양시료 채취시고추역병이 포장에서 많이 발생하는 장마철 이후부터 9월 중순에 걸쳐 수집된 반면 논산토양인 경우 5월경수집 된 것으로 고추역병이 크게 발병 되기 전 수집된 시료 때문 것으로 사료된다. 따라서 고추역병에 강한 항균력을 가지는 균주를 분리하기 위해서는 고추역병이 심하게 발병되는 시기에 시료수집을 하여야함을 알 수 있었다.
- 탄소원 이용성은 mannose, mannitol, N-acetyl- glucosamine, maltose, gluconate등의 당을 이용하였다 (Table 3). 따라서, 표준균주와 비교하여 보면 1A 균주는 B. vallismortis와 거의 같은 반응을 보였으나 B. mojavensis 와는 urea, N-acetyl-glucosamine, maltose 등 에서 확연히 다른 반응을 보여서 최종적으로 1A 균주는 B. vallismortis 로 동정 되었고 B. vallismortis 1A 균주로 명명하고 최종선발 하였다.
- 2). 반면에 B. vallismortis 1A를 처리한 구에서는 접종후 10일 까지도 5.4%의 낮은 이병율을 보였으며 10일 이후에도 완만하게 29%까지 이병율을 보여 고추역병에대한 탁월한 방제효과가 있음을 알 수 있었다.
- capsici) 길항력 검정은 대치배양으로 실시하였다. 분리된 전체 저영양세균 중 1차 대치배양한결과 고추역병에 대하여 371개의 저영양세균이 고추역병균에 대하여 생육이 저해되는 것을 관찰할 수있었다(Table 1). 특히, 영양, 제천 고추밭 토양에서는고추역병에 강한 활성을 가지는 저영양 세균이 3-4균주가 분리 되었으나 논산 토양인 경우에는 강한 활성을 가지는 균주가 전혀 없었다.
- 주사전자현미경으로 관찰한결과 1A 균주는 전형적인 Bacillus 속에서 볼 수 있는간상형 모양과 내열성 포자가 관찰되었으며, 그람염색결과 gram positive, 운동성을 가졌으며, Bacillus 배지인 TSB 배지에서 관찰되는 형태적 특징인 묽고 끈적하게 자라는 것을 볼 수 있었다(Table 3). 분자생물학적 동정은 1A 균주의 genomic DNA로부터 약 1.5kb 크기의 16S rDNA를 PCR로 증폭하여 순수 정제하고 sequencing 후 Blast search 비교 분석 하였으며 그 결과 B. vallismortis와 99%의 유연관계를 나타내었다. 계통분류학적 분석결과는 Fig.
- mojavensis KACC 12096와 비교하여 조사 하였다. 생화학적 특성은 potassium nitrate, esculin, gelatin, 4- nitrophenyl-D-galactopyranoside를 가수분해하는 양성반응을 보였으며, L-tryptophane, D-glucose, L- arginine, urea의 효소반응에는 음성반응을 보였다. 탄소원 이용성은 mannose, mannitol, N-acetyl- glucosamine, maltose, gluconate등의 당을 이용하였다 (Table 3).
- vallismortis 1A(109 CFU/ml) 4ml을 토양관주 접종하고 3일후 고추역병의 포자 현탁액(104 spores/ml) 4ml 접종 하였으며 대조구로는 10mM MgSO4를 처리하여 25일간 고추역병 발생을 조사 하였다. 전형적인 고추역병 증상으로 고추의 전반부가고사되어 적갈색을 띄며 잎은 마르고 줄기부분은 말라 딱딱해지는 현상을 볼 수 있었는데 특히 대조구인경우 접종 후 5일부터 고추역병이 나타나기 시작해서 7일 이후에는 급격히 이병율이 올라가서 15일째는 76%, 25일째는 87%까지의 이병율을 보였다(Fig. 2). 반면에 B.
- 동정을 실시하였다. 주사전자현미경으로 관찰한결과 1A 균주는 전형적인 Bacillus 속에서 볼 수 있는간상형 모양과 내열성 포자가 관찰되었으며, 그람염색결과 gram positive, 운동성을 가졌으며, Bacillus 배지인 TSB 배지에서 관찰되는 형태적 특징인 묽고 끈적하게 자라는 것을 볼 수 있었다(Table 3). 분자생물학적 동정은 1A 균주의 genomic DNA로부터 약 1.
- 분리된 전체 저영양세균 중 1차 대치배양한결과 고추역병에 대하여 371개의 저영양세균이 고추역병균에 대하여 생육이 저해되는 것을 관찰할 수있었다(Table 1). 특히, 영양, 제천 고추밭 토양에서는고추역병에 강한 활성을 가지는 저영양 세균이 3-4균주가 분리 되었으나 논산 토양인 경우에는 강한 활성을 가지는 균주가 전혀 없었다. 이는 토양시료 채취시고추역병이 포장에서 많이 발생하는 장마철 이후부터 9월 중순에 걸쳐 수집된 반면 논산토양인 경우 5월경수집 된 것으로 고추역병이 크게 발병 되기 전 수집된 시료 때문 것으로 사료된다.
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