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문제 정의
- 지금까지의 클로렐라 관련 연구는 클로렐라 열수추출물 또는 가수 분해물(15)을 이용하였으나, 본 연구에서는 용매 추출법을 이용한 해수클로렐라 추출물의 여러가지 생리활성 중 항균 및 항곰팡이 활성, 항산화 활성, 미백과 용혈 활성을 검토하여보고 하고자 한다.
제안 방법
- Tyrosir比을 기질로 이용한 tyrosinase 효소활성의 저해는 Ishihara(28)등의 방법을 변형하여 실시하였다. 0.
- 표준시료로는 ascrobic acid를 사용하였다. 시료의 흡광도를 (As)로 표준시료의 홉광도를 (Ao)로 하여 항산화 효과를 측정하였다.
- 용혈활성을 측정하기 위해서 신선한 적혈구를 150 mM NaCl을 포함한 50 mM phosphate buffer (pH 7.4)로 세척하여 최종 적혈구의 농도를 5% (v/v%)가 되도록 조정하였다 (27). 적혈구 용액과 연속적으로 희석한 해수클로렐라 추출물을 넣어 37℃에서 1시간 배양 후, 원심분리 (8, 000 g X 10 min, 4℃)를 행하였다.
- 그 상층액을 microplate multi-detection reader (Synergy HTf Biotek, USA)을 이용하여 450 nm에서 측정하였다. 적혈구에 시료액이 포함되지 않은 것을 0% (C)로 하고, 1.0% Triton X-100을 넣었을 때의 흡광도를 100% (B)로 정의하여, 시료용액을 첨가했을 때 나타나는 상대적인 흡광도 (S)로부터 용혈활성 %를 계산하였다. 표준시료로는 강력한 벌독 유래의 mastoparaii이라는 물질을 사용하였다.
- 해수클로렐라 (Chlorella elliposidea CO20) 에탄올 추출물로부터 항균 및 항곰팡이 활성, 항산화활성, tyrosinase inhibitory 활성 (미백효과)과 용혈활성을 실험하였다. 효율적인 추출을 위해서 동결건조 후 95% 에탄올로 2시간 추출하는 것이 가장 좋다는 것을 알 수 있었다.
-
Tyrosinase 효소활성 저해
해수클로렐라 에탄올 추출물의 tyrosinase 효소활성 저해는 tyrosine을 기질로 이용하여 측정하였다. 해수 클로렐라 에탄올 추출물의 tyrosinase 저해 활성 IC50는 10.
- 해수클로렐라 에탄올 추출물의 항균 및 항곰팡이에 대한 활성을 최소저해농도 (minimal inhibitory comcentration, MIC) 와 최소살균농도 (minimal bacteriocidal concentration, MBC)로 측정하였다. Table 2의 결과를 보면, gram-positive bacteria인 B.
- 해수클로렐라로부터 효율적인 추출을 위해 동결해동 (freeze-thawing), 동결건조 (lyophilization), 초음파 파쇄 (ultrasonication)를 실시하였다. 동결해동인 경우 95% 에탄올 추출물이 가장 추출 효율이 좋았으며(Fig.
- 초음파파쇄를 이용한 시료 제조는 -20℃에서 보관 후 실온에서 해동한 균체에 각각의 용매를 넣어서 추출하였다. 효율적인 추출을 위하여 메탄올, 에탄올, 아세톤과 에탄올+아세톤 (1:1, V/V%)을 이용하여 4℃, 2시간동안 3회 추출을 반복 실시하였다.
대상 데이터
- Trifluroacetic acid (TFA), ascorbic acid 및 DPPH (1, l-diphenyk2-picrylhydrazyl), mushrum tyrosinase 및 tyrosine 는 Sigma사 (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였고, 그 이외의 모든 시약은 특급을 사용하였다.
- Tryptic Soy Broth (TSB)와 Lactose-Boullion (LB), Potato Dextrose Agar (PDA) 및 Muller-Hinton Broth (MHB)는 Merck사 (Darmstadt, Germany)에서 구입하여 실험에 사용하였다. Trifluroacetic acid (TFA), ascorbic acid 및 DPPH (1, l-diphenyk2-picrylhydrazyl), mushrum tyrosinase 및 tyrosine 는 Sigma사 (St.
- 적혈구 막에 대한 해수클로렐라 에탄올 추출물의 용혈 활성을 조사하기 위하여 인간의 적혈구를 사용하였다. 인간의 적혈구에 대한 해수클로렐라 에탄올 추출물 중 가장 높은 농도인 1.
- 5 mM Tyrosine 40 pL, 시료 20 11L의 혼합용액에 mushrum tyrosinase (1500 U/mL~2OO0 U/mL)를 20 iiL를 첨가하여 37℃ 에서 10분간 반응시킨 후 96 well plate에 반응액 200 皿를 넣고, 그 상충액을 microplate multi-detection reader (Synergy HT, Biotek, USA) 을 이용하여 490 nm에서 측정하였다. 표준시료로는 albutin 을 사용하였다.
- Ltd, Korea) 517 nm 에서 즉정한다. 표준시료로는 ascrobic acid를 사용하였다. 시료의 흡광도를 (As)로 표준시료의 홉광도를 (Ao)로 하여 항산화 효과를 측정하였다.
- 0% Triton X-100을 넣었을 때의 흡광도를 100% (B)로 정의하여, 시료용액을 첨가했을 때 나타나는 상대적인 흡광도 (S)로부터 용혈활성 %를 계산하였다. 표준시료로는 강력한 벌독 유래의 mastoparaii이라는 물질을 사용하였다.
- 해수클로렐라 (Chlorella elliposidea CO20)은 한국 해양 조류은행에서 분양받아 사용했으며, 배양 후 원심분리 한 균체를 95% 에탄올로 2회 세척 한 후 사용할 때까지 -20 ℃ 에서 보관하였다. Chlorella elliposidea CO20은 f/2 건H지 (Table 1)에서 광 3500 lux, 14시간:10시간 (light : dark) 광주기 조건으로 25℃ 에서 10일 동안 배양하였다.
- 해수클로렐라 추출물의 최소저해 농도 (minimal inhibitory concentration, MIC)와 최소살균농도 (minimal bacteriocidal concentration, MBC)를 조사하기 위해 gram-positive bacteria 로서 Bacillus subtilis PM125, Bacillus licherufornds, Micrococcus luteus KCTC1056 및 Staphylococcus aureus KCTC1916 등을 사용하였고, gram-negative bacteria로는 Escherichia coli D31, Escherichia coli KCTC1184, Enterobacter aerogenes KCTC2190, Klebsiella pneumoniae KCTC 2208, Pseudomonas aeruginosa KCTC2004 및 Salmonella typhimurium KCTC 1925를 사용하였으며, 어병 세균으로는 Vibrio parahaemolyticus KCTC2471 과 Edward tarda NUF251 을 사용하였다.
이론/모형
- Free radical scavenging activity를 측정하기 위하여 1, 1 -diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 방법을 사용하였다(27). DPPH 16 mg을 100 mL 에탄올에 녹여 준비하고 시료 50 μL 에 DPPH stock 용액을 500 11L 넣은 다음 total volume이 1.
- 항곰팡이의 활성 측정은 liquid growth assay method로 측정하였다(26). Candida albicans KCTC1940는 potato dextrose broth (PDB) 배지를 사용하여 30℃에서 48시간 배양하였다.
성능/효과
- 戒泣如饨에 대하여서는 활성을 나타내지 않았으며, 인간의 적혈구로 용혈활성 실험한 결과, 아주 낮은 활성을 나타내었다. DPPH방법을 이용하여 항산화 능력을 측정한 결과, 2 mg/mL에서 75% 라디칼 소거 능력을 나타내었다. 해수클로렐라 에탄올 추출물의 tyrosinase 저해 활성 IC50는 10.
- 0 mg/mL의 농도에서 75% DPPH 소거능을 보였다. IC50 (50% Inhibitory Concentration)^ 1.35 m흥/mL로 이전 해양 미세조류에서 연구된 IC50 400 陽/n丄(29) 보다 현저히 높은 수치로 DPPH 소거능은 약한 것을 알 수 있었다(Fig. 4).
- 측정하였다. Table 2의 결과를 보면, gram-positive bacteria인 B. subtilis PM125와 B. lichenif이%馆에 대해서만 최소저해농도와 최소살균농도로 125 也g/mL에서 활성을 나타내었다. 특히, gram-positive bacteria인 Bacillus sp.
- 1C). 각 시료를 용매별로 추출한 결과, 시료에 따른 추출용매의 차이는있었지만, 95% 에탄올이 가장 좋은 주출 용매임을 알 수 있었다(Fig. 1). 동결건조 한 시료는 1회의 추출로 대부분 추출되는 반면, 동결-해동한 시료의 경우에는 효율적인 추출을 위해서 2회 추출까지 필요함을 알 수 있었다.
- 다음으로 DPPH 방법을 이용하여 항산화 능력을 측정한 결과, 2.0 mg/mL의 농도에서 75% DPPH 소거능을 보였다. IC50 (50% Inhibitory Concentration)^ 1.
- 실시하였다. 동결해동인 경우 95% 에탄올 추출물이 가장 추출 효율이 좋았으며(Fig. 1A), 동결건조인 경우 역시 95% 에탄올 추출물이 가장 추출 효율이 좋았으며(Fig. IB), 다음으로 초음파 분쇄인 경우에는 3분일 때가 추출 효과가 가장 높은 것으로 나타났다(Fig. 1C). 각 시료를 용매별로 추출한 결과, 시료에 따른 추출용매의 차이는있었지만, 95% 에탄올이 가장 좋은 주출 용매임을 알 수 있었다(Fig.
- 0 mg/mL에서도 3%라는 아주 낮은 활성을 나타내었다. 이러한 결과로 해수클로렐라 에탄올 추출물이 적혈구에 손상을 주지 않음을 알 수 있었다(Fig. 3).
- 해수클로렐라 에탄올 추출물의 항균 및 항곰팡이에 대한 활성을 즉정한 결과, B. subtilis PM125와 B. licheniformis, V. pamhem이yticus와 E. tarda NUF251에서 활성을 나타내었다. 그러나, 곰팡이인 C.
- 12 mg/L로 가장 높은 함량이 추출되었다. 효율적인 추출을 위해서 동결건조 후 95% 에탄올로 2시간 추출 하는 것이 가장 좋다는 것을 알 수 있었다.
- 12 mg/L로 가장 높은 함량이 추출되었다. 효율적인 추출을 위해서 동결건조 후 95% 에탄올로 2시간 추출 하는 것이 가장 좋다는 것을 알 수 있었다.
후속연구
- 87 n垠/mL로 나타났다. 이러한 결과를 바탕으로 해수클로렐라 에탄올 추출물로부터 다양한 생리활성물질을 개발하여 고부가가치 제품을 창출할 수 있을 것으로 판단된다.
- tarda NUF251 에서만 각각 125 俺/mL, 250 題/mL에서 활성을 나타내었다. 해수클로렐라 추출물이 어류 병원성 세균에 대해 항균 활성을 나타내므로, 고부가가치 어류 사료로 개발이 가능하다고 판단된다. 반면에, 곰팡이인 C.
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