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문제 정의
- 따라서 본 연구는 녹차 함유 카테친 화합물 및 카페인을 동시에 분석할 수 있고, 재현성이 증진된 최적의 HPLC 분석 조건을 검토하여 고 기능성 유용 차나무 품종육성 및 이용성 증진 연구의 기초 자료를 제공하고자 하였다.
제안 방법
- Agillent 1200 series(USA)를 사용하였으며, 최적 HPLC 분석 조건 확립을 위해 사용된 분석 컬럼은 Table 1과 같이 C18 및 C8 컬럼 12종을 사용하였다. HPLC 분석에 이용된 이동상 조건은 2상(two phase) 농도구배 조건으로 유기용매는 메탄올을, 수용매는 0.1% 인산함유 - 증류수를 사용하여 다양한 선형 농도 구배법으로 분리양상을 검토하였다.
- 구입한 각 표준물질은 HPLC 이동상 조제에 사용된 메탄올, 증류수 및 인산이 20 : 79.9 : 0.1(v/v)로 혼합된 용액을 이용하여 500~IQOOppm의 stock solution을 조제한 후, -20℃ 조건의 저온고에 보관하면서 사용하였고, 분석의 재현성 검정을 위해 사용된 녹차 추출액은 녹차 분쇄시료 0.1 g에 2% 인산 - 50% EtOH용액 20 mL를 첨가한 후 상온에서 2 시간 추출한 후 Whatman No. 2 여과지로 1차 여과하였으며, HPLC 분석 직전 syringe fllter(0.45 |im)로 2차 여과를 실시하고 분석에 사용하였다.
- 녹차 함유 catechin 화합물 및 caffeine 분석을 위한 최적 HPLC 분석 조건의 최소 검출한계(LOD, Limit of Detection)를 확인하기 위해 catechin 화합물 및 caffeine 표준품 을 농도별로(0.5 ng/mL ~ 1,000 ng/mL) 조제하여 HPLC 분석을 수행하였다. 최소 검출한계를 확인하기 위한 HPLC 분석조건은 확립된 최적의 HPLC 분석조건과 동일한 조건 이었으며, 단지 검출기의 sign시 대비 noise 비율(S/N ratio) 이 3이 되는 조건에서 농도별 catechin 화합물 및 caffeine 표준품을 분석하고, 검출되는 peak 양상을 확인하여 최소 검출한계를 검토하였다.
- 최근 HPLC 분석에 사용빈도가 극히 높은 C18 및 C8 계 열의 컬럼 12종을 대상으로 녹차 함유 9종의 catechin 화합물 및 caffeine 동시분석을 위해 선발된 최적의 이동상 농도 구배 조건을 적용하였을 때, 각 컬럼별 분석 parameter 및 분리효율을 검정하였다. 그 결과 12종의 컬럼 중 Hamilton PRP-1 컬럼을 포함한 7종의 컬럼은 컬럼의 길이 및 충진물 의 입자크기와 관계없이 10종의 화합물 중 7~9종의 물질만 을 분리, 검출하였고, Zorbax Eclipse XDB C18을 포함한 5종의 컬럼은 녹차 함유 9종의 catechin 화합물 및 caffeine 성분 10종을 동시에 분리해 내는 것으로 조사되었다(Table 3 및 Fig.
- 5 ng/mL ~ 1,000 ng/mL) 조제하여 HPLC 분석을 수행하였다. 최소 검출한계를 확인하기 위한 HPLC 분석조건은 확립된 최적의 HPLC 분석조건과 동일한 조건 이었으며, 단지 검출기의 sign시 대비 noise 비율(S/N ratio) 이 3이 되는 조건에서 농도별 catechin 화합물 및 caffeine 표준품을 분석하고, 검출되는 peak 양상을 확인하여 최소 검출한계를 검토하였다.
- 최적의 분리효율을 나타내었던 YMC-pak ODS-AM 303 컬럼을 이용한 HPLC 분석 조건에서 동일 시료를 10번 계속 반복하여 분석하였을 때, HPLC 분석요인에 대한 재현성을 검정하였다(Table 5~6 및 Fig. 4). 그 결과 10종의 catechin 화합물 및 caffeine 모두 머무름 시간(Rt.
대상 데이터
- Baker Inc.(USA)로부터 구입하여 사용하였으며, 초순수 증류수는 초순수 제조기(Milli-Q system, USA)에서 비저항값이 18 MQ 이상으로 제조된 증류수를 사용하였고, phosphoric acid는 일본 화광순약주 식회사의 특급시약을, 기타 추출용매로 사용된 에탄올은 국산 GR 등급을 구입하여 사용하였다.
- 녹차 함유 catechin 화합물 및 caffeine 분석에 사용된 HPLC는 Agillent 1200 series(USA)를 사용하였으며, 최적 HPLC 분석 조건 확립을 위해 사용된 분석 컬럼은 Table 1과 같이 C18 및 C8 컬럼 12종을 사용하였다. HPLC 분석에 이용된 이동상 조건은 2상(two phase) 농도구배 조건으로 유기용매는 메탄올을, 수용매는 0.
- 본 실험에 사용된 녹차 잎은 제주특별자치도 소재 (주) 아모레퍼시픽 설록차 연구소에서 재배된 국내 재래종 차나무의 잎을 1심 5엽기 때 신초 상위 제 1엽 ~ 3엽까지 100g을 채취하여 증열기(TERADA)에서 40초간 통과시켜 찌고, 다시 건조시킨 후 분말로 가공하여 60 mesh 체로 사별한 후 시료로 사용하였다.
성능/효과
- 4). 그 결과 10종의 catechin 화합물 및 caffeine 모두 머무름 시간(Rt.)의 변이계수는 최대 1.23%, peak area의 변이계수는 최대 5.13% 미만을 나타내므로 높은 분석 재현성을 나타내었다. 따라서 상기 조건에 의해 확립된 녹차 함유 catechin 화합물 및 ca feine의 HPLC 정량 분석법은 재현성이 높은 정량적 분석방법으로 판단된다.
- 최근 HPLC 분석에 사용빈도가 극히 높은 C18 및 C8 계 열의 컬럼 12종을 대상으로 녹차 함유 9종의 catechin 화합물 및 caffeine 동시분석을 위해 선발된 최적의 이동상 농도 구배 조건을 적용하였을 때, 각 컬럼별 분석 parameter 및 분리효율을 검정하였다. 그 결과 12종의 컬럼 중 Hamilton PRP-1 컬럼을 포함한 7종의 컬럼은 컬럼의 길이 및 충진물 의 입자크기와 관계없이 10종의 화합물 중 7~9종의 물질만 을 분리, 검출하였고, Zorbax Eclipse XDB C18을 포함한 5종의 컬럼은 녹차 함유 9종의 catechin 화합물 및 caffeine 성분 10종을 동시에 분리해 내는 것으로 조사되었다(Table 3 및 Fig. 3). 그러나 각 컬럼별 분석성분의 이론단수(No.
- 녹차 함유 9종의 catechin 화합물 및 을 동시에 정량적으로 분석할 수 있는 최적의 HPLC 분석 이동상 조건을 확립하기 위해 다양한 농도구배 조건으로 분리효율 시험 을 실시한 결과 최적의 용매계는 A용매로 0.1% 인산 - 증 류수와 B용매로 100% MeOH를 사용하는 것이 극성이 높은 gallic acid부터 caffeinee- 포함하여 극성이 낮은 ECG까 지 10성분을 동시에 분리 할 수 있는 최적의 용매계로 선정 되었고(data 미제시), 예비실험에서 분리능이 양호한 것으로 조사된 Shiseido Capcell pak C18(4.6x250 mm) 컬럼을 대상으로 용매의 농도구배 조건별 분리양상을 검토한 결과 용매 programing 조건을 0분 : 80%A, 25분 : 80%A, 50분 : 70%A, 51분 : 80%A, 55분 : 80%A 조건으로 분당 1 mL 의 유속으로 농도구배 분석(gradient elution)을 실시할 경우 50분 안에 녹차 함유 9종의 catechin 화합물 및 cafBine 성 분의 동시분석이 가능하였다.
- 녹차 함유 9종의 catechin 화합물 및 카페인 성분을 동시에 정량적으로 분석할 수 있는 최적의 HPLC 분석파장을 검토하기 위하여 자외선 210~400 nm 범위에서 각 성분별 흡수 분광특성을 검토한 결과 gallic acid(216 nm)를 제외한 9종의 화합물 모두 최대 흡수 파장이 210 nm 미만과 271~ 279 nm에서 최대 흡광 특성을 나타내었다(Fig. 1 및 Table 2). 이 결과로 볼 때 210 nm의 경우 메탄올을 포함한 대부분의 HPLC용 유기용매에서 uv-cut of가 일어나는 파장과 근접하며, 용매에 의한 peak noise가 극대화 될 수 있는 파 장이므로, 210 nm에 비해서 상대적으로 흡광력은 낮지만 다른 파장 영역에 비해 흡수분광이 높이 일어나는 파장인 280 nm에서 검출하는 것이 가장 바람직한 것으로 조사되었다.
- 1 및 Table 2). 이 결과로 볼 때 210 nm의 경우 메탄올을 포함한 대부분의 HPLC용 유기용매에서 uv-cut of가 일어나는 파장과 근접하며, 용매에 의한 peak noise가 극대화 될 수 있는 파 장이므로, 210 nm에 비해서 상대적으로 흡광력은 낮지만 다른 파장 영역에 비해 흡수분광이 높이 일어나는 파장인 280 nm에서 검출하는 것이 가장 바람직한 것으로 조사되었다.
- 최적 HPLC 분석 조건에서 녹차 함유 10종의 catechin 화합물 및 caffeine 성분을 동시에 분석하였을 때 분석 가능한 최소 검출한계(LOD, Limit of Detection)를 평가하기 위해 각 성분별 표준품을 농도별(0.5 ng/mL ~ 1,000 ng/mL) 로 가공하고, 검출기의 signal/noise ratio = 3인 조건에서 최소 검출한계를 조사한 결과 모든 성분이 최소 50 ppb(0.050 ppm, 50 ng/mL)이하에서도 완벽하게 검출되는 양상을 나타내므로 (Fig. 5) 상기 실험에서 확립된 HPLC 분석법은 녹차의 작물학적 특성 평가용으로 활용하기에 전혀 무리가 없는 분석법으로 판단된다.
- 특히 녹차 함유 9종의 catechin 화합물 및 caffeine 성분 10종을 동시에 완전하게 분리해 내는 5종의 컬럼 중 분리 효율에 영향을 미치는 요인들을 상호비교 검토하였을 때 YMC-pak ODS-AM 303 컬럼이 크로마토그램상의 분리 양상, 분리 parameter의 이론치 비교 및 극성이 유사하여 분리가 불량한 GA와 GC, EGC와 C사이의 resolution 비교에서도 가장 우수한 분리 양상을 나타내는 컬럼으로 조사되었다.
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