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문제 정의
- 본 시험에서는 이러한 견지 하에서 자유 라디칼 소거 효과를 가지며, MMP-1 생성을 억제하는 동시에 콜라겐 생합성을 촉진해주고, 엘라스틴을 분해하는 효소인 엘라스테이즈의 활성을 억제해 주는 물질을 찾아 이 물질의 in vitro에서의 효과를 검증하고자 하였으며 더 나아가서는 이 물질을 이용하여 항노화 화장품 개발에 적용하고자 하였다.
- 는 MMPs의 발현을 촉진하여 콜라겐 분해를 가속화시키고 결과적으로 주름이 생성되게 된다[16]. 본 시험에서는 인위적으로 피부세포에 H2O2를 첨가해주고 여기에 하고초 추출물을 첨가하여 하고초 추출물이 H2O2에 의해 야기되는 세포사멸을 얼마나 억제하는가에 대하여 확인하고자 하였다.
- 본 연구에서는 하고초 추출물의 콜라겐 생성 촉진 효과, MMP-1 생성 억제 효과, 엘라스테이즈 활성 억제 효과 및 항산화 효과 등을 in vitro에서 확인하고, 이 중 맹검 임상 연구를 통하여 하고초 추출물을 함유하는 제형의 피부 표면에 대한 영향을 알아보고자 하였다.
- 본 연구에서는 하고초 추출물의 항노화 효과에 대하여 알아보고자 하였다. 시험 결과, 하고초 추출물은 매우 우수한 콜라겐 생성 촉진 효과, MMP-1 생성 억제 효과, 엘라스테이즈 활성 억제 효과를 나타내었으며, 또한 하고초 추출물의 항산화 효과 측정을 위한 자유 라디칼 소거 효과 시험과 과산화수소에 의해 유발된 세포사멸 억제 효과 시험에서도 우수한 효과를 나타내었다.
- 피부 노화에 주요한 역할을 하는 MMP-1은 콜라겐을 분해시키는 역할을 한다. 이러한 MMP-1 생성에 하고초 추출물이 어떠한 영향을 미치는지 알아보고자 하였다.
제안 방법
- 하고초 추출물 함유 크림의 피부주름 개선 효과에 대한 평가는 (주)엘리드 피부과학연구소에서 실시하였다. 34세에서 48세까지의 피험자 22명을 대상으로 얼굴의 좌우를 나누어 한쪽은 하고초 추출물 4.0 % 함유 크림을, 다른 한쪽은 placebo cream을 하루 두 차례 12주 동안 도포하도록 하였다. 시험부위 측정방법은 전문가의 육안평가에 의한 눈가의 주름정도를 global photodamage score (0; none, 1; none / mild, 2; mild, 3; mild / moderate, 4; moderate, 5; moderate / severe, 6; severe, 7; very severe)로 평가하였다.
- 4.0 % 농도로 하고초 추출물이 함유된 제형을 12주 동안 시험부위에 도포하여 주름개선 효과를 확인하였다. 시료 도포 4주, 8주 후의 photodamage score 변화에 따른 주름개선 효과가 시험제품과 대조군의 통계적으로 유의한 수준의 차이는 없었다.
- MTT를 이용한 세포 독성 시험은 Mosmann법을 변형하여 사용하였다[15]. NIH3T3 cell을 96-well plate에 1 × 104 cells / well 되도록 접종하고 24 h 배양하였다.
- 기질인 N-succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide가 엘라스테이즈에 의해 분해되어 생성되는 물질인 p-nitro-aniline (PNA) 양을 흡광도를 이용하여 측정함으로써 하고초 추출물의 엘라스테이즈 활성 억제 효과를 평가하였다.
- 노란색의 MTT가 살아있는 세포의 mitochondria에 의해 흡수되어 insoluble dark blue formazan으로 변화하는 원리를 이용하여 cytotoxicity를 측정하는 방법인 MTT assay를 이용하여 하고초 추출물의 세포 생존에 미치는 영향을 조사하였다.
- 시험부위 측정방법은 전문가의 육안평가에 의한 눈가의 주름정도를 global photodamage score (0; none, 1; none / mild, 2; mild, 3; mild / moderate, 4; moderate, 5; moderate / severe, 6; severe, 7; very severe)로 평가하였다. 또한, 시료 도포에 따른 피부주름 개선 효과를 비지오메터를 이용하여 분석하였다. 피험자의 지정된 눈가 부위에 모사판을 제작하여 화상분석을 통해 수치화하였으며, 이때 주름측정의 임의적 단위인 R2, R3를 측정하여 피부주름 개선 정도를 평가하였다.
- 0 % 함유 크림을, 다른 한쪽은 placebo cream을 하루 두 차례 12주 동안 도포하도록 하였다. 시험부위 측정방법은 전문가의 육안평가에 의한 눈가의 주름정도를 global photodamage score (0; none, 1; none / mild, 2; mild, 3; mild / moderate, 4; moderate, 5; moderate / severe, 6; severe, 7; very severe)로 평가하였다. 또한, 시료 도포에 따른 피부주름 개선 효과를 비지오메터를 이용하여 분석하였다.
- 여기에 H2O2 3 mM과 하고초 추출물을 농도별로 첨가하여 24 h 배양한 후 MTT 용액(5 mg/mL)을 10 µL씩 첨가하였다.
- 여기에 하고초 추출물을 농도별로 각각의 well에 첨가하여 24 h 배양 후 배지를 버리고 새로운 배지와 함께 MTT 용액(5 mg/mL)을 10 µL 씩 첨가하였다.
- 8 mM 농도의 기질(N-succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide) 20 µL, 10 µg/mL 농도의 효소(elastase)를 20 µL 넣고 25 ℃에서 15 min 동안 반응시킨 후 410 nm에서 ELISA reader를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 이 때 대조군은 시료 대신 Tris buffer를 넣은 것으로 하였으며, 효소를 넣지 않은 공시험의 흡광도를 뺀 값을 elastase 활성 억제 효과 평가에 이용하였다.
- 진피의 대부분을 차지하는 성분인 콜라겐은 나이가 듦에 따라 그 양이 감소하여 피부의 주름 생성에 주요한 원인이 되므로 하고초 추출물의 콜라겐 생합성에 미치는 영향을 알아보고자 사람의 정상 섬유아세포(CCD-986sk cell)에 하고초 추출물을 첨가하여 배양한 후 콜라겐 량을 측정하였다.
- 또한, 시료 도포에 따른 피부주름 개선 효과를 비지오메터를 이용하여 분석하였다. 피험자의 지정된 눈가 부위에 모사판을 제작하여 화상분석을 통해 수치화하였으며, 이때 주름측정의 임의적 단위인 R2, R3를 측정하여 피부주름 개선 정도를 평가하였다.
- 하고초 추출물 함유 크림의 피부주름 개선 효과에 대한 평가는 (주)엘리드 피부과학연구소에서 실시하였다. 34세에서 48세까지의 피험자 22명을 대상으로 얼굴의 좌우를 나누어 한쪽은 하고초 추출물 4.
- cells/well 되게 접종하고 24 h 배양하였다. 하고초 추출물을 serum이 없는 DMEM 배지에 농도별로 첨가하여 교체한 후 24 h 동안 더 배양하여 세포 배양액을 취하였다. 세포 배양액 내 콜라겐 양은 procollagen type I C-peptide (PIP) EIA kit (Takara Bio, Japan)을 사용하여 정량하였다.
- 하고초 추출물의 free radical 소거능을 측정하기 위해 Blois의 방법을 약간 변형하여 사용하였다[14]. DPPH를 400 mM 농도로 에탄올에 녹여 준비하고, 시료와 DPPH 용액을 1 : 1 비율로 섞어 상온에서 30 min 동안 반응시킨 후 520 nm에서 ELISA reader를 이용하여 흡광도를 측정하였다.
대상 데이터
- 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), Tris buffer, elastase, butylated hydroxytoluene (BHT), N-succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide, 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), Dulbeco's modified Eagle's medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS) 시약들은 Sigma (USA)사 제품으로 사용하였다.
- 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), Tris buffer, elastase, butylated hydroxytoluene (BHT), N-succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide, 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), Dulbeco's modified Eagle's medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS) 시약들은 Sigma (USA)사 제품으로 사용하였다. Procollagen type I C-peptide (PIP) EIA kit는 Takara Bio (Japan), MMP-1 assay kit는 Amersham (USA)사 제품을 사용하였다. 또한 Mouse immortalized fibroblast (NIH3T3 cell), Human normal fibroblast (CCD-986sk cell) 세포주들은 한국 세포주 은행에서 구입하였으며, enzyme linked immuno solvent assay (ELISA) reader는 SpectraMAX Plus 384 (Molecular devices Inc.
- 또한 Mouse immortalized fibroblast (NIH3T3 cell), Human normal fibroblast (CCD-986sk cell) 세포주들은 한국 세포주 은행에서 구입하였으며, enzyme linked immuno solvent assay (ELISA) reader는 SpectraMAX Plus 384 (Molecular devices Inc., USA)를, 비지오메터는 Skin-visiometer SV600 (Courage & Khazaka, Germany)를 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 하고초(Prunella vulgaris)는 국내 약초시장에서 국내산으로 구입하여 사용하였다. 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), Tris buffer, elastase, butylated hydroxytoluene (BHT), N-succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide, 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), Dulbeco's modified Eagle's medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS) 시약들은 Sigma (USA)사 제품으로 사용하였다.
데이터처리
- 모든 실험 결과의 통계적 유의성은 Student’s t-test로 하였으며 p 값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다.
이론/모형
- 세포 배양액 내 MMP-1 양은 배양액을 취하여 MMP-1 assay kit (Amersham, USA)을 사용하여 정량하였다. 측정된 MMP-1 양은 Lowry assay으로 구한 총 단백질 양으로 보정하였다.
- 세포 배양액 내 콜라겐 양은 procollagen type I C-peptide (PIP) EIA kit (Takara Bio, Japan)을 사용하여 정량하였다. 측정된 콜라겐 양은 Lowry assay으로 구한 총 단백질 양으로 보정하였다.
성능/효과
- H2O2에 의해 야기되는 세포 사멸을 MTT assay를 통하여 확인한 결과 하고초 추출물을 0.5 % 적용하였을 때 H2O2에 의한 세포 사멸을 20.3 %, 1.0 %일 때 38.0 %, 2.0 %일 때 49.9 % 억제하는 것으로 나타났다(Figure 2). 이러한 결과를 통하여 하고초 추출물은 H2O2로부터 피부 세포를 보호하는 능력을 갖고 있음을 알 수 있다.
- 그러나 12주 경과 후 대조군이 -0.14 ± 0.35인 것에 반해 시험제품은 -0.32 ± 0.48 (p< 0.05)로 통계학적으로 유의하게 호전되어 주름개선 효과를 나타냄을 확인하였다(Table 3).
- 또한 시험부위의 모사판을 제작하여 시료 도포 전과 12주 후의 모사판 화상분석 변화에 대한 통계분석 결과 R2, R3에서 통계적으로 유의한 수준 (p < 0.05)의 차이(⊿R2 p = 0.013, ⊿R3 p = 0.040)가 발생함을 확인하였기 때문에 하고초 추출물을 함유한 시험제품은 주름개선에 유의한 효과가 있다는 것을 알 수 있었다(Figure 5).
- 9 %로 나타났다. 또한, 하고초 추출물의 농도가 높아짐에 따라 free radical 소거 효과가 높아졌으며, 하고초 추출물의 농도가 2.0 %일 때 소거율이 약 77.0%로 나타났다(Table 1).
- 0 % 농도로 하고초 추출물이 함유된 제형을 12주 동안 시험부위에 도포하여 주름개선 효과를 확인하였다. 시료 도포 4주, 8주 후의 photodamage score 변화에 따른 주름개선 효과가 시험제품과 대조군의 통계적으로 유의한 수준의 차이는 없었다. 그러나 12주 경과 후 대조군이 -0.
- 시험 결과, 하고초 추출물은 2.0 % 농도까지 세포 독성을 전혀 나타내지 않았으며, 4.0 % 농도에서도 약 85% 이상의 세포 생존율을 나타내어 세포 독성이 낮은 것으로 확인되었다(Table 2).
- 본 연구에서는 하고초 추출물의 항노화 효과에 대하여 알아보고자 하였다. 시험 결과, 하고초 추출물은 매우 우수한 콜라겐 생성 촉진 효과, MMP-1 생성 억제 효과, 엘라스테이즈 활성 억제 효과를 나타내었으며, 또한 하고초 추출물의 항산화 효과 측정을 위한 자유 라디칼 소거 효과 시험과 과산화수소에 의해 유발된 세포사멸 억제 효과 시험에서도 우수한 효과를 나타내었다. 하고초 추출물의 피부에 대한 영향을 알아보기 위하여 22명의 지원자를 대상으로 실시한 이중 맹검 임상 연구 결과, 하고초 추출물 4.
- 시험결과, 비교물질 transforming growth factor-β (TGF-β)는 10 ng/mL 농도로 처리 시 65.4 %의 저해 효과를 보였으며, 하고초 추출물은 150 µg/mL 농도에서 57.6 %, 200 µg/mL 농도에서 90.2 %의 생성 억제율을 나타내어 MMP-1 생성 억제 효과를 나타내었다(Figure 4).
- 68 %의 억제 효과를 나타내었다(Figure 1). 이러한 결과를 통하여 0.5 % 이상의 농도에서 하고초 추출물은 엘라스테이즈 활성을 저해 하는 효과를 가짐을 알 수 있다.
- 9 % 억제하는 것으로 나타났다(Figure 2). 이러한 결과를 통하여 하고초 추출물은 H2O2로부터 피부 세포를 보호하는 능력을 갖고 있음을 알 수 있다.
- 하고초 추출물 0.125 ~ 2.0 %의 농도 범위에서 엘라스테이즈 활성 억제 효과 시험을 수행한 결과, 0.5 %일때 14.49 %, 1.0 %일 때 34.62 %, 2.0 %일 때 43.68 %의 억제 효과를 나타내었다(Figure 1). 이러한 결과를 통하여 0.
- 하고초 추출물 농도가 150 µg/mL일 때 69.3 %, 250µg/mL일 때 75.7 %의 콜라겐 생합성 촉진효과를 나타내었고, 비교물질인 ascorbic acid는 50 µg/mL일 때 56.4 %의 생합성 촉진 효과가 있는 것으로 나타났다 (Figure 3).
- 하고초 추출물과 비교물질인 BHT의 DPPH radical 소거 활성(SC50)을 측정한 결과, BHT는 15 µg/mL, 하고초 추출물은 0.9 %로 나타났다.
- 하고초 추출물의 피부에 대한 영향을 알아보기 위하여 22명의 지원자를 대상으로 실시한 이중 맹검 임상 연구 결과, 하고초 추출물 4.0 % 함유 제형을 12주 동안 도포하였을 때, 대조군과 비교하여 전문가의 육안평가, 모사판을 제작하여 주름의 정도를 분석한 결과 주름 개선에 현저한 효과가 있음을 확인하였다(p < 0.05).
후속연구
- 05). 이러한 결과를 통해 하고초 추출물은 피부의 탄력과 주름을 효과적으로 개선함으로써, 천연 항노화 소재로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
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