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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 생산 장류의 품질 균일화를 위한 우수 균주를 확보하고, 실험 mixturee 최적화 기법을 이용하여 그 균주들의 최적 배합비를 창출하여 고품질의 장류를 제조하고자 하였다.
- 본 연구는 청국장의 품질을 향상시키고 최적화시키기 위해 경기도 이천에서 높은 효소가를 가진 균주를 분리 . 동정하며 선택된 균주들을 이용하여 최적배합비를 산출하고자 하였다.
제안 방법
- 속성장류 제조는 대두를 상온에서 20시간 동안 물에 침지하여 건져낸 후 12TC에서 30분간 증자하고, 증자된 대두 콩 80g에 IxlO7 cells/g。〕되도록 전배양한 선별 균주 Bacillus sp. SC-1, SC-3, SC-5, 그리고 SC-20을 접종하여 42。(2에서 24시간 동안 발효시킨 후 41에서 3일간 후숙시켜 제조하고, 최적화 공정 확립을 위한 일반분석에 사용하였다.
- 05 g, 1,000 mL 증류수를 섞은 용액 (A)와 N&HPCQ . 12HQ 0.9 g과 NaOH 6 g과 NaOCl lOmL와 1,000 mL 증류수를 섞은 용액(B)을 각각 2mL씩 넣어 37℃에서 20분간 반응 시킨 후, 630nm에서 spectrophotometer(UV-1201, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 이용하여 흡광도를 측정하여, ammonia sulfate를 이용하여 표준곡선을 토대로 암모니아태질소량을 계산하였다 .
- 염기서열 분석을 통하여 얻은 각 균주의 염기서열은 Blast Network Service를 이용하여 NCBI GenBank database의 염기서열과 비교함으로써 계 통분류학적 유연관계를 분석하였다. Chromas lite(version 2.01)를 이용하여 분석된 염기서열을 확인하고, 유연관계가 있는 database 와 비교분석 후, 비교된 서열을 Jphydit version 1.0(phylogenetic sequence editor for JAVA)을 사용하여 염기서열을 재작성하고, NCBI GenBank database를 이용하여 최종적으로 계통분류학적 유 사도를 분석하였다.
- PCR 반응 조건은 97。(2에서 5분 동안 변성시키고, 각 단계 94℃에서 1분, 56。(2에서 1분, 72。(2에서 1분 30초 동안 DNA 증폭 반응을 30회 실시하고 마지막으로 72。(：에서 4분 동안 반응을 실시하였다. PCR 증폭된 DNA band를 gene clean kit(WelPrep™ gel extraction kit, Daegu, Korea)를 이용하여 정제한 후, 염기서열 분석을 (주)마크로젠(Seoul, Koiea)에서 실시하였다. 염기서열 분석을 통하여 얻은 각 균주의 염기서열은 Blast Network Service를 이용하여 NCBI GenBank database의 염기서열과 비교함으로써 계 통분류학적 유연관계를 분석하였다.
- sp. SC-1, SC-3, SC-20 세 균주를 사용하여 최적의 생산 배합비를 설정하였다(Table 5). 설정 범위로는 아미노태질소와 선호도 최대로, 암모니아태질소와 항산화는 최소로 예측하였다.
- 균주가 관여하기(18) 때문인 것으로 사료된다. 고품질의 장류생산 및 최적화 공정을 확립하기 위한 수집된 장류로부터 효소활성이 우수한 균주를 선별하기 위하여 발효 시 장류의 품질 및 기능성에 매우 중요한 전분 분해효소, 단백질분해효소, 지방분해 효소, 섬유소분해효소의 활성을 측정하였으며, 그 결과는 Fig. 1과 같다. 분리된 29종의 발효균마다 효소활성은 많은 차이가 났으며, 이 중 전반적인 청국장류에서는 효소활성이 우수한 5균주(Bacillus sp.
- 이천에서 높은 효소가를 가진 균주를 분리 . 동정하며 선택된 균주들을 이용하여 최적배합비를 산출하고자 하였다. 16S rDNA와 PCR을 이용하여 균주를 동정한 결과, 39개의 균주 대부분이 B.
- 고품질의 장류 생산 및 최적화 공정을 확립하기 위해 분리 . 동정한 균주중에서 amylase, protease, lipase와 cellulase의 활성이 높은 균주를 3개 선택하여 최적화 공정작업에 이용하였고 실험법에 의해 청국장을 제조하였다. 암모니아태질소, 선호도, 아미노태질소 및 항산화가에 근거를 두어 contour map과 numerical 최적화를 한 결과, 50%의 Bacillus sp.
- 분석은 모델에 대한 F-test를 통하여 유의성 검사를 하였다. 또한 contour plot을 이용하여 일정한 비율에서 다른 요소들이 고정되는 동안 각 혼합물 성분변화에 따른 영향을 나타내었다. 아미노태질소와 암모니아태질소, 항산화는 linear model이 선택되었고, 선호도는 비선형 형태인 quadratic model이 선택되었다(p<0.
- 활용하였다. 마쇄한 청국장 10 g에 소금을 1g 첨가하여 상온에서 1시간 동안을 끊여 준비하였으며 평가항목은 향, 색상, 이취, 맛(선호도)어】 대하여 9점 척도법을 사용하였다. 또한 통계분석은 SAS(version 8.
- 분리 , 동정된 장류 발효균주로부터 protease, cellulase, amylase 및 lipase의 효소 활성이 우수한 균주를 최종 선별하기위하여, 각 효소 활성을 즉정할 수 있는 1% skim milk(protease 활성측정용), 0.5% carboxymethyl cellulose(cellulase 활성측정용), 3% soluble starch(amylase 활성측정용) 및 0.5% tri-butyrin(lipase 활성측정용) 을 첨가한 고체 LB배지의 0.6mm 종이 디스크 위에 37℃에서 24시간 동안 전배양된 각 균의 0.45 皿 여과막을 이용하여 제균한 상등액 10pL를 접종하고 37℃에서 12시간 배양한 후 배지 상의 투명 환을 비교하여 효소의 활성이 우수한 균주를 최종 선별하였다. Cellulase 및 amylase의 활성에 따른 투명 환을 관찰하기 위해서 각각 0.
- 분리된 각각의 분획들을 전자공여에 의해 2, 2-diphenyl-l-picryl- hydrazyl(DPPH)의 유리 라디칼이 소거되어 hydrazine 형태로 환원되고 이에 따라 색이 보라색에서 노란색으로 탈색되는 원리를 이용하여 DPPH의 전자 공여능을 측정하였다. DPPH를 이용한 전자 공여능 측정은 Lee 등(16)의 방법을 토대로 70% MeOH 추출한 청국장 추출물 50|11码 0.
- 상호 균주들 간 혼합물 design, data 분석 및 혼합 최적화는 design expert 7(Stat-묘藍y Co., Minneapolis, MN, USA)을 이용하 였고, constraint 값으로는 아미노태질소, 암모니아태질소, 선호도, 항산화 활성으로 정하였다. 세 균주 총 함량 100% 내에서 각 물 질의 최소 및 최대비율은 0-100%로 정하고 각 조성에 따른 성 분들의 반응을 보기 위하여 contour plot을 이용하였다.
- , Minneapolis, MN, USA)을 이용하 였고, constraint 값으로는 아미노태질소, 암모니아태질소, 선호도, 항산화 활성으로 정하였다. 세 균주 총 함량 100% 내에서 각 물 질의 최소 및 최대비율은 0-100%로 정하고 각 조성에 따른 성 분들의 반응을 보기 위하여 contour plot을 이용하였다. 최적화는 canonical 모형의 수치 최적화(numerical optimization)를 통하여 성 분비를 선정하고, 그때의 점을 예측흐】였다• 수치 최적화는 canonical 모형을 근간으로 하는 모델의 수에 각 반응에 대한 목표(goal area)를 설정하고 다음 식에 의하여 구하였다(17).
- PCR 증폭된 DNA band를 gene clean kit(WelPrep™ gel extraction kit, Daegu, Korea)를 이용하여 정제한 후, 염기서열 분석을 (주)마크로젠(Seoul, Koiea)에서 실시하였다. 염기서열 분석을 통하여 얻은 각 균주의 염기서열은 Blast Network Service를 이용하여 NCBI GenBank database의 염기서열과 비교함으로써 계 통분류학적 유연관계를 분석하였다. Chromas lite(version 2.
- 장류 생산 최적화하기 위해 제조한 장류로부터 분리된 효소 활성이 우수한 균주를 이용하여 청국장을 제조 후 이에 따른 결과물들을 일반특성 분석하여 완성하였다. 청국장류 생산 최적화에 이용된 균은 총 4종으로 Bacillus sp.
- 장류들로부터 분리된 각 균주들을 동정하기 위하여, 16S rDNA 염기서열 분석을 실시하였다. 16S rDNA 염기서열 분석을 위한 PCR 반응은 각 균의 single colony를 이용하여 실시하였으며, primer는 Weisburg 등(14)이 제안한 primer를 기초로 제작된 forward primer인 5'-AGAGnTGATCMTGGCTCAG-3'와 reverse primer인 5LGGYTACCTTGTTACGACTT-3을 사용하였다.
- 활성이 높은 3균주(SC-1, 3, 20)를 선택하였고, 그 균주들의 제한 범위를 0-100%로 설정하였으며, 그 범위들을 modified distance design에 적용하여 혼합물 내 실험점을 설정하였다. 총 15개의 실험점 중, 6개의 실험점과, lack of fit의 계산을 위한 5개 실험점, 그리고 4개의 반복점이 설정되었다.
대상 데이터
- 45 皿 여과막을 이용하여 제균한 상등액 10pL를 접종하고 37℃에서 12시간 배양한 후 배지 상의 투명 환을 비교하여 효소의 활성이 우수한 균주를 최종 선별하였다. Cellulase 및 amylase의 활성에 따른 투명 환을 관찰하기 위해서 각각 0.1% congo red와 iodine 용액을 사용하였다.
- 경희대 식품공학과 대학원생 10명을 선발하여 관능검사 요원으로 활용하였다. 마쇄한 청국장 10 g에 소금을 1g 첨가하여 상온에서 1시간 동안을 끊여 준비하였으며 평가항목은 향, 색상, 이취, 맛(선호도)어】 대하여 9점 척도법을 사용하였다.
- 장류생산 최적화 공정 확립을 위한 모델 장류로써 속성 장류인 청국장을 제조하였다. 속성장류 제조는 대두를 상온에서 20시간 동안 물에 침지하여 건져낸 후 12TC에서 30분간 증자하고, 증자된 대두 콩 80g에 IxlO7 cells/g。〕되도록 전배양한 선별 균주 Bacillus sp.
- 장류제조 주 원료인 대두는 정협농협(Suwon, Korea)에서 구입하였으며, 장류발효균주의 분리에 필요한 장류는 (주)상촌식품 (Ybngin, Korea)에서 제조된 장류를 사용하였다.
데이터처리
- 마쇄한 청국장 10 g에 소금을 1g 첨가하여 상온에서 1시간 동안을 끊여 준비하였으며 평가항목은 향, 색상, 이취, 맛(선호도)어】 대하여 9점 척도법을 사용하였다. 또한 통계분석은 SAS(version 8.0, 1999, Statistical Analysis System Institute, Caiy, NC, USA)를 사용하였고, 시료 간의 차이를 검증하기 위하여 유의차 0.05 수준에서 Duncan의 다중비교를 수행하였다.
- 그 결과는 Table 4에 나타내었다. 분석은 모델에 대한 F-test를 통하여 유의성 검사를 하였다. 또한 contour plot을 이용하여 일정한 비율에서 다른 요소들이 고정되는 동안 각 혼합물 성분변화에 따른 영향을 나타내었다.
이론/모형
- 장류들로부터 분리된 각 균주들을 동정하기 위하여, 16S rDNA 염기서열 분석을 실시하였다. 16S rDNA 염기서열 분석을 위한 PCR 반응은 각 균의 single colony를 이용하여 실시하였으며, primer는 Weisburg 등(14)이 제안한 primer를 기초로 제작된 forward primer인 5'-AGAGnTGATCMTGGCTCAG-3'와 reverse primer인 5LGGYTACCTTGTTACGACTT-3을 사용하였다. PCR 반응 조건은 97。(2에서 5분 동안 변성시키고, 각 단계 94℃에서 1분, 56。(2에서 1분, 72。(2에서 1분 30초 동안 DNA 증폭 반응을 30회 실시하고 마지막으로 72。(：에서 4분 동안 반응을 실시하였다.
- DPPH의 전자 공여능을 측정하였다. DPPH를 이용한 전자 공여능 측정은 Lee 등(16)의 방법을 토대로 70% MeOH 추출한 청국장 추출물 50|11码 0.04% DPPH 용액 200]丄L을 혼합 후 70% MeOH로 ImL 맞춘 후 실온에 방치하면서 10분 간격으로 517nm에서 흡광도 변화를 측정하였다.
- 또한 contour plot을 이용하여 일정한 비율에서 다른 요소들이 고정되는 동안 각 혼합물 성분변화에 따른 영향을 나타내었다. 아미노태질소와 암모니아태질소, 항산화는 linear model이 선택되었고, 선호도는 비선형 형태인 quadratic model이 선택되었다(p<0.05). 순수오차와 잉여 오차의 비교에 의한 lack of fit test는 아미노태질소는 0.
- 구하였다. 조단백질은 Kjeldahl법을 이용하였고, 아미노태질소는 중성 formalin을 이용한 적정법을 이용하였다. 암모니아태질소는 In 등(15)을 토대로 아미노태질소 측정 시 감압 여과한 여액 0.
성능/효과
- 동정하며 선택된 균주들을 이용하여 최적배합비를 산출하고자 하였다. 16S rDNA와 PCR을 이용하여 균주를 동정한 결과, 39개의 균주 대부분이 B. subtiliser B. 归函彻mis이었으며 곰팡이는 검줄되지않았고 그 중 5개의 균주가 높은 역가를 나타내었다. 고품질의 장류 생산 및 최적화 공정을 확립하기 위해 분리 .
- 분리된 29종의 발효균마다 효소활성은 많은 차이가 났으며, 이 중 전반적인 청국장류에서는 효소활성이 우수한 5균주(Bacillus sp. SC-1, SC-2, SC- 3, SC-8, SC-20X 확인할 수 있었고, 된장액류에서는 Hpase 활성이 선별 배지상에서 분리된 균의 모든 상등액에서 거의 검출이 되지 않을 정도로 매우 약한점을 제외하고는, 전반적으로 모든 효소활성이 궁중장이라는 된장(Fig. IB의 strain number 7-13) 에서분리된 균주들의 상등액에서 효소활성이 우수하였다(Table 1).
- SC-1 번 균주로 제조한 청국장이 진득진득한 성질을 가지고 있었고, Bacillus sp. SC-20번 균주로 제조한 청국장은 점질물이 묽은 성질을 가지고 있었으나 모든 청국장에서 점질물 형성 정도는 잘 이루어진 것으로 보였다. 수분함량, 단백질, 아미노태질소, 암모니아태질소, 관능 선호도에 대한 결과는 Table 2에 나타내었다.
- SC-1 균주 약 50%와 Bacillus sp. SC-3 균주 50%를 혼합하여 청국장을 제조 시 암모니아태질소, 아미노태질소, 선호도 및 항산화 능이 최적인 청국장이 생산되었다.
- 특히, 예측된 canonical 식에서 결정된 계수들은 Bacillus sp. SC-3 균주들에 의한 효과가 반응에 미치는 영향을 수치로 보여주고 있는 것으로, 암모니아태질소에서는 모든 혼합성분들이 기여하는 정도는 같은 정도의 기여도 및 linear 모델을 나타내어 각 성분들의 독립적 기여도를 나타내었다.
- 이것은 Bacillus sp. SC-3번 균주로 제조한 청국장의 아미노태질소의 함량이 높아 구수한 맛을 내고 불쾌 취는 적게 발생시킨 결과로 생각되며, 또한 고품질의 장류 제조는 효소 활성이 우수한 균으로부터 제조됨을 확인할 수 있었다.
- 수분함량, 단백질, 아미노태질소, 암모니아태질소, 관능 선호도에 대한 결과는 Table 2에 나타내었다. 수분함량은 62.5에서 66.8%, 조 단백질은 6.0에서 6.5 mg%의 범위를 보여 각 균주별로 특별한 유의적 차이를 보이지 않았다. 청국장의 원료인 대두 단백질이 미생물에 의해 분해되어 구수한 맛을 내는 아미노태질소의 생성실험 결과, 아미노태질소의 양은 Bacillus sp.
- 05). 순수오차와 잉여 오차의 비교에 의한 lack of fit test는 아미노태질소는 0.0224의 낮은 probability를 나타내었으며, 선호도는 0.0001 이하의 비교적 낮은 probability 값을 가져 모델에 대한 적합성을 확인하였다(Table 4). 특히, 예측된 canonical 식에서 결정된 계수들은 Bacillus sp.
- sp. 으로 Bacillus licheniformis와 B. subtilis와 높은 상동성을 갖는 균주 20종을 확인하였다(Table 1). 된장류에서의 곰팡이류는 분리되지 않았으며, 이는 숙성 단계인 된장에서는 메주 띄우는 단계에서와는 달리 곰팡이가 아닌 Bacillus sp.
- 설정 범위로는 아미노태질소와 선호도 최대로, 암모니아태질소와 항산화는 최소로 예측하였다. 이것을 만족하는 수치점을 예측한 결과 아미노태질소 23.01%, 암모니아태질소 35.297%, 선호도 5.46, 항산화 1.37로 계산되었다. 또한, contour plot을 통한 model 분석에 있어서는 각 성분들이 선호도, 암모니아태질소, 아미노태질소, 항산화에 미치는 영향을 나타내는 것으로 contour plot는 색 변화에 따른 함량 변화 및 그에 따른 모델을 나타내고 있다.
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