선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 침전시킨 다음, CM-sepharose 및 Mono-S column chromatography를 실시하고 최종적으로 Superose 12 HR 10/30 gel permeation column chroma- tography를 실시하는 보다 복잡한 정제과정을 사용하였다. 본 연구에서는 S. lividans TK24/pWHM3-T보다 월등히 생산성 이 높은 S. griseus IFO 13350/pWHM3-TRlR2 형질전환체로부터 트립신 발현을 극대화 할 수 있는 배지 조건을 수립하였고, 배양액으로부터 트립신을 정제하는 보다 개선한 방법을 수립하였다. 그러나, 최종 정제산물의 수율이 정제 전 배양액의 총 트립신 활성의 1.
- 이러한 배경 하에 본 연구에서는 재조합 방선균에서 트립신 생산을 극대화하기 위해 재조합 균주의 배양조건을 탐색하고, 생산된 방선균 트립신의 분리정제 조건을 개선 하는 연구를 수행하였다.
제안 방법
- 5% glycine을 포함한 50 mL 의 R2YE에 접종해서 2일 배양하였다. Lysozyme (1 mg/ mL)을 포함한 20 mL의 P buffer (sucrose, 103 g; K2SO4, 0.25 g; MgCh - H2O, 2.03 g; trace elements, 2 mL를 800 mL2] 증류수에 녹여서 멸균한 후, 0.5% KH2PO4, 10 mL; 3.68% CaCl2 H2O, 100 mL; 5.73% TES (pH 7.2), 100 mL를 혼합)를 넣고 30℃에서 15-60분 정도 처리하면서 반응 중간에 protoplast 형성 정도를 현미경으로 확인하였다. protoplast (10&9 cells) 에 plasmid DNA (1 μg)를 pipette— 로 섞어준 다음 1분 후에 1 mL의 P buffer (25% PEG 1, 000 포함)를 첨가하였다.
- S. griseus와 S. lividans TK24의 protoplast는 Kieser 등의 방법 [13]을 약간 변형해서 준비하였다. Streptomyces 균주들을 10 ml의 R2YE 배지에서 28℃에서 2일 배양한 후 250 mL baffled flask에서 0.
- Skim milk 배 지 (skim milk 0.5%, peptone 0.5%, glucose 0.1%, agar 1.5%)로 만든 평판 배지 위에 pWHM3 또는 pWHM3-TRlR2를 형질 전환 시킨 방선균주를 접종하고, 28℃에서 3-5 일 배양한 후 protease에 의해 skim milk 가 분해되어 나타난 투명환을 관찰하였다.
- Trypsin activity는 호소분해 작용에 의하여 N-a-benzoyl- DL-arginine-p-nitroanilide 에서 p-nitroanilidee} 유리되는 것에 대한 흡광도를 측정함으로써 분석하였다[16]. 먼저 reaction buffer (50 mM Tris-Cl [pH 8.
- 선정하여 생산성을 조사하였다. 각 배지의 조성은 Table 1과 같으며, 이들의 생산성을 이전의 보고에 사용했던 R2YE 배지와 비교하였다(Fig. 2). 각각의 배지에서 7 일간 방선균주를 배양하여 배양일에 따른 트립신 역가를 측정한 결과, S.
- 3A). 그러나, SDS-PAGE 분석 결과, 여러 종류의 단백질 밴드가 섞여있는 것으로 나타났기 때문에 , 고순도의 트립신을 생산하기 위해서 strong cation exchanger 인 SP-sepharose로 FPLCf- 수행하였다.
- 5 mL/minS. 단백질을 gradient elution을 실시 하였고, 2.5ML 분취하였다. FPLC 결과, 단일 peak를 관찰할 수 있었고, 그 peak에 해당하는 fraction (13, 14, 15)에서 트립신 역가가 높게 나타났다.
- griseus IFO 13350에 도입하여 R2YE 배지에서 배양했을 때, sprT 유전자의 전사량이 가장 많고 trypsin의 생산성도 최대 임을 보고한 바 있다[18]. 따라서 본 연구에서는 대조군으로는 pWHM3벡터의 형질전환체를 사용하고, 생산 균주로는 pWHM3-TRlR2가 도입된 형질전환체를 사용하여 트립신의 생산성을 더욱 증대 시킬 수 있는 배지를 조사하였다.
- 상기 단백질 용액(14, 15, 16번 분획)을 buffer A에 투석 시켜 염을 제거하였고, 이를 buffer A로 평형화 시킨 SP- Sepharose™ Fast Flow column에 loading하였다. SP column을 20배의 buffer A로 충분히 씻고 난 후, buffer A 100%부터 buffer B (buffer A + 0.
- 0], 10% glycerol, 1 mM EDTA)에 용해하였다. 상기 단백질 용액을 bufifer A에서 투석시켜 염을 제거하고, 이를 buffer A로 평형화 시킨 CM column (HiPrep 16/10 Sepharose CM FF, Amersham Biosciences Inc.) 또는 SP column (HiPrep 16/ 10 Sepharose™ FF IEX Column, ID 1.6 x 10 cm, Amersham Biosciences Inc.)에 loading하였다. 단백질의 용출은 buffer A 100%부터 buffer B (buffer A + 0.
- 5 mL/min로 gradient elutione 실시하였다. 용출된 분획은 2.5 mL씩 분취하였고트립신 역가 측정, 단백질 정 량, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis 분석 등에 사용하였다. 단백질의 정량은 Bradford 방법을 사용하였고, standard로는 bovine serum albumin (BSA)을 이용하였다[1]
- 우선 각 형질전환체가 protease 활성을 어느 정도 나타내는지를 상대적으로 비교하기 위해 skim milk hydrolysis plate assay를 수행하였다. 방선균에서 분비하는 protease에 의해 배지의 단백질 성분인 skim milk가 분해되어 투명한 원을 형성하였다.
- 이와 같은 형질전환 방선균의 트립신 생산에 적합한 배지를 선별하기 위해 방선균배양에 널리 쓰이는 4가지 배지를 일차적으로 선정하여 생산성을 조사하였다. 각 배지의 조성은 Table 1과 같으며, 이들의 생산성을 이전의 보고에 사용했던 R2YE 배지와 비교하였다(Fig.
- 이전의 트립신 정제 단계는 supernatant를 25%- 55% ammonium sulfateS. 침전시킨 다음, CM-sepharose 및 Mono-S column chromatography를 실시하고 최종적으로 Superose 12 HR 10/30 gel permeation column chroma- tography를 실시하는 보다 복잡한 정제과정을 사용하였다. 본 연구에서는 S.
대상 데이터
- 이에 따라 추후의 트립신 정제 실험은 s. griseus IFO 13350 균주를 C5/L 배지에서 배양하여 진행하였다.
이론/모형
- 5 mL씩 분취하였고트립신 역가 측정, 단백질 정 량, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis 분석 등에 사용하였다. 단백질의 정량은 Bradford 방법을 사용하였고, standard로는 bovine serum albumin (BSA)을 이용하였다[1]
- 28℃에서 24-48시간 배양 후에 thiostrepton을 최종 25 gg/mL 농도로 평판배지 위에 도말한 후 28OC에서 3-5일 동안 배양하여 형질전환체를 선별하였다. 한편, shuttle 벡터를 대장균에서 분리하는 방법은 Sambrook 등의 방법으로 수행하였다[19].
성능/효과
- 방선균에서 분비하는 protease에 의해 배지의 단백질 성분인 skim milk가 분해되어 투명한 원을 형성하였다. 3일간 배양한 결과, 예상했던 것처럼 pWHM3 벡터만을 가진 균주보다 pWHM3-TRlR2의 형질전환체가 더 큰 casein 분해 영역을 형성하였고, S. lividans TK24 균주보다는 S. griseus IFO13350 균주가 더 큰 분해영역을 형성하였다(Fig. 1A). 이와 같은 결과는, BANPt 이용하여 배지에 생성된 트립신 활성을 직접 측정했던 이전의결과와도 일치하고 있다[18] 또한 각각의 형질전환체가 생산한 트립신은 SDS-PAGE 분석에서도 확인할 수 있었다 (Fig.
- IB). 5일간 배양한 S. lividans TK24 시료의 경우 예상되는 28 kDa의 SGT 단백질이 pWHM3-TRlR2 형질전환체에서만 나타났으며, S. griseus IFO 13350의 경우 PWHM3-TR1R2 형질전환체가 대조군에 비해 더욱 많은 양의 SGT 단백질이 존재함을 보여주었다.
- 5ML 분취하였다. FPLC 결과, 단일 peak를 관찰할 수 있었고, 그 peak에 해당하는 fraction (13, 14, 15)에서 트립신 역가가 높게 나타났다. SDS-PAGE 결과, 13, 14, 15번 fraction에서 깨끗한 트립신 밴드를 확인하였다(Fig.
- 06 unit/mL) 순으로 나타났다. S. griseus IFO 13350/pWHM3-TRlR2의 경우에는 전반적으로 배양 7일에 트립신 활성이 가장 높았으며, C5/L (1.518 unit/mL), R2YE (1.284 unit/mL), NDSK (0.932 unit/mL), Livid (0.295 unit/mL) 순으로 나타났다. 따라서, 효소 활성은 S.
- griseus IFO 13350으로부터 클로닝 하여 분석한 결과, sprT 유전자 바로 하류에 존재하는 두 유전자가 많은 생물체에서 보고된 조절 유전자들과 큰 상동성이 있음을 알게 되었다[3]. sprT 유전자와 두 개의 조절유전자 sgtRl,sgtR2의 관계를 분자생물학적인 방법으로 연구한 결과, 두 조절 유전자에 의하여 트립신의 발현량이 트립신 유전자의 단독 발현시에 비해 약 20-30배 증가함을 확인하였다[18]. 또한, 이러한 발현양의 증가는 조절 유전자에 의해 sprT 유전자의 전사량이 증가하는 것에서 기 인하며 , 이는 AdpA와는 무관하게 독립적으로 일어나는 현상임을 밝힌 바 있다.
- 2). 각각의 배지에서 7 일간 방선균주를 배양하여 배양일에 따른 트립신 역가를 측정한 결과, S. lividans TK24/pWHM3-TRlR2의 경우 배양 5일을 기준으로 R2YE에서 가장 높은 생산성 (0.74 unit/mL) 을 나타냈고, C5/L (0.66 unit/mL), Livid (0.08 unit/mL), NDSK (0.06 unit/mL) 순으로 나타났다. S.
- griseus IFO 13350/pWHM3-TRlR2 형질전환체로부터 트립신 발현을 극대화 할 수 있는 배지 조건을 수립하였고, 배양액으로부터 트립신을 정제하는 보다 개선한 방법을 수립하였다. 그러나, 최종 정제산물의 수율이 정제 전 배양액의 총 트립신 활성의 1.4% 밖에 되지 않아, 트립신의 정제 회수율이 극히 낮은 걸로 조사되었다. 배양액을 농축하기 위한 ammonium sulfate precipitation 단계에서 대부분의 loss가 발생하였는데 , 추후 이를 개선하는 연구가 필요할 것으로 판단된다.
- 27 배였으며, 순수정제된 트립신의 specific activity는 69, 252 unit/mg으로 조사되었다. 대조군으로 사용한 Sigma사에서 시판하고 있는 트립신(T1426, Trypsin from bovine pancreas) 은 13, 500 unit/mg으로, 순수정제한 방선균 트립신은 이보다 5배 이상의 활성을 가진 것으로 나타났다. 이는 효소 활성 면에서 방선균 트립신이 동물췌장에서 추출한 트립신보다 월등함을 시사하고 있다.
- 295 unit/mL) 순으로 나타났다. 따라서, 효소 활성은 S. lividans TK24보다는 S. griseus IFO 13350 균주가 실험에 사용한 모든 배지에서 월등하게 높았으며, 최대 활성은 S. griseus IFO 13350 균주를 C5/L(GYE) 배지에서 배양했을 때 나타났다. 이에 따라 추후의 트립신 정제 실험은 s.
- 6배 증가하는 것으로 밝혀 졌다[4]. 본 연구진은 sprT 유전자를 포함하는 염색체 DNA 6.4 kb (GenBank accession no. AY588948)를 S. griseus IFO 13350으로부터 클로닝 하여 분석한 결과, sprT 유전자 바로 하류에 존재하는 두 유전자가 많은 생물체에서 보고된 조절 유전자들과 큰 상동성이 있음을 알게 되었다[3]. sprT 유전자와 두 개의 조절유전자 sgtRl,sgtR2의 관계를 분자생물학적인 방법으로 연구한 결과, 두 조절 유전자에 의하여 트립신의 발현량이 트립신 유전자의 단독 발현시에 비해 약 20-30배 증가함을 확인하였다[18].
- 5 mL/ min의 유속으로 gradient elution을 실시하였다. 이와 같은 FPLC 결과, 3개의 main peak가 관찰되었고, 그 중 3번째 peak에 해당하는 14, 15, 16번 fraction에서 높은 트립신 역가를 보였다(Fig. 3A). 그러나, SDS-PAGE 분석 결과, 여러 종류의 단백질 밴드가 섞여있는 것으로 나타났기 때문에 , 고순도의 트립신을 생산하기 위해서 strong cation exchanger 인 SP-sepharose로 FPLCf- 수행하였다.
- Table 2에 요약하였다. 최종 purification fold는 3.27 배였으며, 순수정제된 트립신의 specific activity는 69, 252 unit/mg으로 조사되었다. 대조군으로 사용한 Sigma사에서 시판하고 있는 트립신(T1426, Trypsin from bovine pancreas) 은 13, 500 unit/mg으로, 순수정제한 방선균 트립신은 이보다 5배 이상의 활성을 가진 것으로 나타났다.
후속연구
- 4% 밖에 되지 않아, 트립신의 정제 회수율이 극히 낮은 걸로 조사되었다. 배양액을 농축하기 위한 ammonium sulfate precipitation 단계에서 대부분의 loss가 발생하였는데 , 추후 이를 개선하는 연구가 필요할 것으로 판단된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.