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문제 정의
- 돌나물 추출물이 멜라닌 생성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 항산화 효과 및 B16 melanoma 세포를 이용하여 세포 내 tyrosinase 저해효과, 멜라닌생성 저해효과, t四rosinase와 관련 단백질 및 유전자에 미치는 영향을 연구하였다. 돌나물 주줄물의 DPPH 소거효과와 superoxide radical 소거효과가 우수하게 나타났으며, B16 melanoma세포를 이용한 세포 내 tyrosinase 활성은 51% 저증H하였고, 멜라닌 생성은 100 昭/血 농도를 처리한 실험군에서 46% 감소하였다.
- 돌나물의 함유성분으로는 sedoheptulose, sucrose, fructose 등의 당질과 특히 비타민 C, 철분 및 칼슘 등을 풍부하게 함유하고 있다. 이러한 돌나물의 생리활성 연구로는 terpenoids에 의한 간보호 효과/ 돌나물에서 분리한 flavonoids인 quercetin, isoriiamnetiii과 kaempferol 등의 배당체들에 의한 angiotensin converting enzyme 저해효과, ” 돌나물 추출물이 각질형성세포에서의 hyaluronan 생성 촉진 작용이 있다는 것이 보고 되었다/⑼ 본 연구에서는 천연물로부터의 미백제를 개발하기 위하여 수종의 천연물을 검색하였으며 돌나물의 멜라닌 생성 저해 효과를 발견하고 돌나물 추출물의 활성산소 소거활성 및 B16 melanoma 세표를 이용하여 멜라닌생성 저해 효과를 연구하였다.
제안 방법
- 3-(4, 5-dimethythiazol-2-yl)-2-5-diphenytetazoliuni bromide (MTT) 정량은 MosmaniE의 방법을 변형하여 실시하였다. B16 melanoma 세포를 1 x 10° cells/well 농도로 24 well plate에 분주한 세표에 시료를 처리하고 48시간 동안 배양하였다.
- 5분, 72℃ 遨, 20~29 cycles로 반응시켰다. PCR에 의하여 생성된 산물을 1.5% agarose gel에서 전기영동하여 tyrosinase, TRP-1, TRP-2 와 |3-actin 유전자의 발현을 image analyzer(BIS303PC, DNR Imaging Sy야ems Ltd, UIQ로 확인 하였으며, 각 band의 density는 densitometric programCNIH Image software, MD, USA)을 이용증卜 였다. Tyrosinase, TRP-1, TRP-2 3] oligonucleotide 서열은 tyrosinase: sense; 5'-GAGAAGCGAGTCTTGATTA(A3', antisense; 5'WGGTGCTTCATGGGCAAAATC瑚', TRP-1: sense; 5'~GCTG- CAGGAGCCTTCTTTCTC-3\ antisense; 5七AAGACGCTGCAC- TGCTGGTCT3, TRP-2: sence; 5七CCTGTCTCTCCAGAAGTT- TG-3; antisence; 5-CGTCTGTAAAAGAGTGGAGG3이며, |3- actin3] oligonucleotide 서열은 sense; 5-ATGAGAAGGAGATC- ACTGC3, antisense; 5'-CTGCGCAAGTTAGGTTTTGT3이다.
- 5 pM), 1 unit RNase inhibitor 그리고 4 unit Omniscript reverse transcriptase(Qiagen, Hilden, Germany)-^ 37℃에서 60분, 9%C에서 5분 heating 시킴으로서 반응을 중지시켰다. Polymerase chain reaction(PCR>fr cDNA로부터 tyrosinase, TRP-1, TRP-2, |3-actin< 증폭하기 위하여 cDNA, 0.5 μM의 5 과 3'pHmei; 10 xbuffer(10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KC1, 0.1% Triton X-100), 200 μM dNTR 25 mM MgCl2, 2.5 unit Thq polymerase(Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 PCR을 실시하였다. PCR 증폭은 94℃ 0.
- 이를 3% skim milk 가 함유된 tris-buffed]서 tyrosinase(sc-7833), TRP-l(sc-10443), TRP-2(sc-10452), |3-actin(sc-1616) 항체와 각각 반응시킨 후, alkaline phosphatase가 결합된 항체를 가한 후, 5-bromo-4- chloro-3-indoly-l-phophate/nitro blue tetrazolium(BCIP/NBT) 을 가하여 발색시켰다. Western blot 결과는 Calibrated densitometer GS-800(Biorad, CA, USA)를 이용하여 분석하였다.
- 유해산소라 불려지는 활성산소는 세포 생체막으] 구성성분인 불포화지방산을 공격하여 지질과산화 반응을 일으켜 체내 과산화지질을 축적함으로 인해 생체기능이 저하되고 동시에 색소침착, 노화 및 성인병 질환을 유발하는 것으로 알려져 있다.圮 돌나물 추출물의 항산화 작용이 있는 지를 확인하기 위하여 DPPH를 이용한 유리 라디칼 소거 반응을 관찰하였다. 돌나물 추출물을 50, 100, 500 昭 向의 농도로 처리한 경우 각 DPPH radical 소거능은 18.
- 양성대조군으로 사용한 알부틴은 100 敏成에서 약 35% 멜라닌 감소 효과를 나타냈다. 또한 멜라닌 합성 억제효과를 육안。고 관친하기 위하여 각 시료당 1X106 개의 세포를 수집하여 관찰하였다. 대조군으로서 멜라닌 생성을 촉진시키는 호르몬인 a-MSH를 치리한 세포군에서는 벤라닌이상당히 증가되었음을 확인하였다.
- 돌나물 주줄물이 세포 독성에 미치는 농도를 조사하여 미백 실험에 사용될 농도 범위결정을 위해서 MTT assay를 시행하였다. B16 melanoma 세포에 대한 돌나물 추출물의 세포독성을 즉정한 결과, 돌나물 주줄물은 100 이하의 농도로 처리 시 세포생존율이 90% 이상으로 나타났으며, 그 이상의 농도에서는 생존율이 저하되었다(Fig.
- 대조군으로서 멜라닌 생성을 촉진시키는 호르몬인 a-MSH를 치리한 세포군에서는 벤라닌이상당히 증가되었음을 확인하였다. 돌나물 추출물 치리군은 대소군 보나 벤라닌 색소가 김소하였고, 특히 100 pg/m/ 농노에서 현저히 김소 하였다(Fig. 3).
- 돌나물 추출물이 멜라닌 생합성에 관여하는 유전자의 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여 RT-PCR을 수행하였다. 실험 결과 돌나물 추출물은 tyrosinase, TRB1의 발현을 저해하는 것으로 나타났지만 TRB2의 발현량에는 영향을 미치지 않았다.
- 돌나물 추출물이 멜라닌 합성에 미치는 영향을 확인하기 위해 B16 melanoma세포를 이용하여 멜라닌 생성 저해 효과를 측정하였다. 순비된 세포에 돌나물 주줄물을 농도별로 처리하고 48 시간 동안 배양하였다.
- 멜라닌 정량은 Hosoiu) 등의 방법을 변형하여 사용하였다. 6 well plate에 3xl05cells/welR 세포를 분주하였고, 시료를 처리하고 48시간 동안 37℃ CO2 배양기에서 배양하였다.
- 여기서 얻은 pellet에 IN NaOH(10% DMSO) 200 讨를 첨가하고 vortex 후 405nm에서 값을 측정하였다. 멜라닌 표준품(Sigma, USA)으로 얻은 표준 검량선을 이용하여 각 well 에서 생성된 멜리닌 양을 산출하였다. 멜라닌은 단위세포(1(尹cells) 에서의 멜라닌 생성량을 비교하였다.
- 멜라닌 표준품(Sigma, USA)으로 얻은 표준 검량선을 이용하여 각 well 에서 생성된 멜리닌 양을 산출하였다. 멜라닌은 단위세포(1(尹cells) 에서의 멜라닌 생성량을 비교하였다.
- 벤라닌 생성에 관련하는 세포 내 tyrosinase의 환성 저혜효과를 측정하였다. 돌-나물 추출물을 치리한 세포를 수지하여용혜시킨 후, 0.
- Xanthine oxidase에 의해 형성되는 superoxide anion의 생성저해의 결과는 Table I에 나티내었다. 양성 대조군으로 BHA를 이용하여 돌나물 추출물의 superoxide radical 소거효과를 비교하였다. 그 결과 돌나물 추출물은 투여농도 의존적으로 superoxide radical 소거작용을 나타내 50, 100, 500 μ或mZ의 농도로 처리한 경우 각 superoxide radical 소거 능은 39.
- 12% 소거효과를 나타내었다. 양성 대조군으로는 항산화 효과가 알려진 3-f-butyl4hydroxyanisole(BHA)을 이용하여 돌나물 추출물의 항산화 효과를 비교하였다. 그 결과 BHA는 100 ng/mZ 에서 75.
- 이러한 결과가 멜라닌 생성에 관련된 단백질 발현과도 연관성이 있는지를 확인하기 위해 tyrosinase, TRP-1, TRR2의 항체를 이용한 western blot으로 관련 단백질의 발현량 변화에 대하여 조사하였다(Fig. 5). 돌나물 추출물은 tyrosinase, TRP-1의 발현을 저해하는 것으로 나타났으며 TRP-2의 발현량에는 영향을 미치지 않았다.
- 여기서 얻은 상층액을 12% SDS-R\GE를 이용해 전기영동하고 이를 nitrocellulose membrane으로 이전시켰다. 이를 3% skim milk 가 함유된 tris-buffed]서 tyrosinase(sc-7833), TRP-l(sc-10443), TRP-2(sc-10452), |3-actin(sc-1616) 항체와 각각 반응시킨 후, alkaline phosphatase가 결합된 항체를 가한 후, 5-bromo-4- chloro-3-indoly-l-phophate/nitro blue tetrazolium(BCIP/NBT) 을 가하여 발색시켰다. Western blot 결과는 Calibrated densitometer GS-800(Biorad, CA, USA)를 이용하여 분석하였다.
대상 데이터
- B16F10은 쥐의 melanoma 세포주로 서울대학교 한국 세포주 은행에서 구입하였다. 구입한 세포는 5% fetal bovine serum(Bio Whittakei; MD, USA), 1% penicillin-streptomycin(Gibco BRL, MD, USA) 을 함유한 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) 배지에 100nM a-melanocyte stimulating hormone (MSH, Sigma, USA>를 첨가하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
- 구입한 세포는 5% fetal bovine serum(Bio Whittakei; MD, USA), 1% penicillin-streptomycin(Gibco BRL, MD, USA) 을 함유한 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) 배지에 100nM a-melanocyte stimulating hormone (MSH, Sigma, USA>를 첨가하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. Tyrosinase, TRP-1, TRP-2, |3-actin 항체는 Santa Cruz Biotechnology(CA, USA)에서 구입하여 사용하였다.
- 구입하였다. 구입한 세포는 5% fetal bovine serum(Bio Whittakei; MD, USA), 1% penicillin-streptomycin(Gibco BRL, MD, USA) 을 함유한 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) 배지에 100nM a-melanocyte stimulating hormone (MSH, Sigma, USA>를 첨가하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. Tyrosinase, TRP-1, TRP-2, |3-actin 항체는 Santa Cruz Biotechnology(CA, USA)에서 구입하여 사용하였다.
- 본 실험에서 사용한 돌나물(&血洌 smentosum Bunge)은 국내익초(경동}시장에서 구입하였다. 그늘진 곳에서 건조한 돌나물 100 g 을 분쇄하여 70% EtOH 1Z로 환류하면서 3시간^ 2회 반복 추출하였다.
- 19%로 우수한 superoxide radical 소거효과를 나타내었다. 양성 대조군인 BHA는 100昭/成에서 51.38%의 superoxide radicat을 소거하였다.
- 그늘진 곳에서 건조한 돌나물 100 g 을 분쇄하여 70% EtOH 1Z로 환류하면서 3시간^ 2회 반복 추출하였다. 이를 감압 농축, 동결 건조하여 그 분말을 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 모든 실험결과는 평균土표준편차로 표기하였고, 통계적 유의성은 Students Hest로 하였으며 p 값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다.
이론/모형
- 1 - Relative cell viability of SSE on B16 melanoma cells by MTT assay The cells were treated with various concentration of SSE for 48 h. The cell viability was measured by the MTT method. Data ace normalized by taking 100% as viability of non-treated cells.
- Xanthinq/xanthine oxidase 반응에서 형성된 superoxide radical 소거효과는 nitroblue tetrazoliumCNBT) 방법에 의해 측정하였다.(2) 0.
- 세포 내 tyrosinase 활성 측정법은 Pawell과 Pomerantz1Ofl6) 방법을 사용하였다. 6 well plate에 5xl05cells/welE 세포를 분주하고 하루 동안 배양한 후 시료를 처리하였다.
- 항산화 활성은 IJ-diphenyl-S-picrylhydrazyKDPPH, Aldrich, USA)를 이용하여 시료의 라디칼 소거효과를 측정하는 Blois법 (1) 을 활용하였다. 0.
성능/효과
- 특히 tyrosinase 는 이들 두 가지 타입의 melaniii합성에 필요하며, TRR1과 DCTer eumelanin*] 합성에 더 낞이 관여하는 깃으로 일려겨 있다.5)시금까지 알려겨있는 미백물질들은 작용 기선에 따라 자외선 흡수제나 산란제, 알부틴 (arbutin), 코직산(kojic add) 등과 긷은 tyrosinase 환성 저해제, 활성 산소종을 소거하는 아스코르빈산(ascorbic acid) 및 유도체, coenzyme Q10, 토코페롤 등으로 분류할 수 있다. 또한 상년耳耳, 당귀, 고삼, 감초, 백작약, 유기노, 삼릉 등의 다양한 식물추출물이 미백효과가 있는 것으로 나타나고 있다.
- B16 melanoma 세포에 대한 돌나물 추출물의 세포독성을 즉정한 결과, 돌나물 주줄물은 100 이하의 농도로 처리 시 세포생존율이 90% 이상으로 나타났으며, 그 이상의 농도에서는 생존율이 저하되었다(Fig. 1). IC50 값은 413 昭向로 나타났다.
- 또한 tyrosinase 단백질 발현량은 29% 감소, TRP-1V 13% 감소시켰으나 TRB2에 대한 저해효과는 나타나지 않았다. RT-PCR을 이용한 유전자 발현을 평가한 결과 tyrosinase, TRR1의 mRNA 발현도 감소하였으나, TRR2의 발현은 변화가 없었다. 돌나물 추출물은 항산화 효과 및 멜라닌 생합성에 관여하는 단백질과 유전자의 발현조절 경로를 통하여 멜라닌 생합성 저해 효과를 나타내는 것으로 보이며 향후 미백제로 응용 할 수 있을 것으로 생각된다.
- 양성 대조군으로는 항산화 효과가 알려진 3-f-butyl4hydroxyanisole(BHA)을 이용하여 돌나물 추출물의 항산화 효과를 비교하였다. 그 결과 BHA는 100 ng/mZ 에서 75.27%의 DPPH radical을 소거하였으며, 돌나물 추출물은 투여 농도 의존적으로 DPPH radical 소거작용을 나타내었다 (Table I).
- 양성 대조군으로 BHA를 이용하여 돌나물 추출물의 superoxide radical 소거효과를 비교하였다. 그 결과 돌나물 추출물은 투여농도 의존적으로 superoxide radical 소거작용을 나타내 50, 100, 500 μ或mZ의 농도로 처리한 경우 각 superoxide radical 소거 능은 39.74%, 63.28%, 89.19%로 우수한 superoxide radical 소거효과를 나타내었다. 양성 대조군인 BHA는 100昭/成에서 51.
- 또한 멜라닌 합성 억제효과를 육안。고 관친하기 위하여 각 시료당 1X106 개의 세포를 수집하여 관찰하였다. 대조군으로서 멜라닌 생성을 촉진시키는 호르몬인 a-MSH를 치리한 세포군에서는 벤라닌이상당히 증가되었음을 확인하였다. 돌나물 추출물 치리군은 대소군 보나 벤라닌 색소가 김소하였고, 특히 100 pg/m/ 농노에서 현저히 김소 하였다(Fig.
- 및 유전자에 미치는 영향을 연구하였다. 돌나물 주줄물의 DPPH 소거효과와 superoxide radical 소거효과가 우수하게 나타났으며, B16 melanoma세포를 이용한 세포 내 tyrosinase 활성은 51% 저증H하였고, 멜라닌 생성은 100 昭/血 농도를 처리한 실험군에서 46% 감소하였다. 또한 tyrosinase 단백질 발현량은 29% 감소, TRP-1V 13% 감소시켰으나 TRB2에 대한 저해효과는 나타나지 않았다.
- 5). 돌나물 추출물은 tyrosinase, TRP-1의 발현을 저해하는 것으로 나타났으며 TRP-2의 발현량에는 영향을 미치지 않았다. 또한 이에 대한 density를 측정한 결과, 100 回mJ에서 tarosinase발현을 29%, TRR1의 발현을 13% 감소시키는 것으로 나타닜■고, TRP-2 발현량은 변화가 없었나.
- 돌나물 주줄물의 DPPH 소거효과와 superoxide radical 소거효과가 우수하게 나타났으며, B16 melanoma세포를 이용한 세포 내 tyrosinase 활성은 51% 저증H하였고, 멜라닌 생성은 100 昭/血 농도를 처리한 실험군에서 46% 감소하였다. 또한 tyrosinase 단백질 발현량은 29% 감소, TRP-1V 13% 감소시켰으나 TRB2에 대한 저해효과는 나타나지 않았다. RT-PCR을 이용한 유전자 발현을 평가한 결과 tyrosinase, TRR1의 mRNA 발현도 감소하였으나, TRR2의 발현은 변화가 없었다.
- 실험 결과 돌나물 추출물은 tyrosinase, TRB1의 발현을 저해하는 것으로 나타났지만 TRB2의 발현량에는 영향을 미치지 않았다. 또한 이에 대한 density를 측정한 결과, 100 μ度mZ에서 tyrosinase 발현을 21%, TPR-1의 발현을 12% 감소시키는 것으로 나타났고, TRP-2 발현량은 변화가 없었다(Fig. 6).
- 돌나물 추출물은 tyrosinase, TRP-1의 발현을 저해하는 것으로 나타났으며 TRP-2의 발현량에는 영향을 미치지 않았다. 또한 이에 대한 density를 측정한 결과, 100 回mJ에서 tarosinase발현을 29%, TRR1의 발현을 13% 감소시키는 것으로 나타닜■고, TRP-2 발현량은 변화가 없었나. Yoon 등略)에 의한 tyrosinase와 TRP-12] 발현 저혜는 제주조릿대 잎 열수추출물이 a-MSH에 의한 세포신호선달 경完 중 시속적인 ERK 환성화를 저혜힘:。로써 tyrosinase와 TRP-12] 빌현을 저허]하는 깃-。로 보고뇌고 있나.
- 세포 내 tyrosinase 저해 실험의 결과로 돌나물 추출물은 세포 내 tyrosinase활성을 저해하여 m읹anin 생성을 감소시켰다. 이러한 결과가 멜라닌 생성에 관련된 단백질 발현과도 연관성이 있는지를 확인하기 위해 tyrosinase, TRP-1, TRR2의 항체를 이용한 western blot으로 관련 단백질의 발현량 변화에 대하여 조사하였다(Fig.
- 순비된 세포에 돌나물 주줄물을 농도별로 처리하고 48 시간 동안 배양하였다. 세포수를 수집하여 멜라닌 양을 측정한 결과, 돌나물 추출물 처리군 모두가 농도에 비례하여 멜라닌 합성이 저해되었으며 100 μ以成 농도에서 약 46% 멜라닌 생성저해 효과가 있었다(Fig. 2). 양성대조군으로 사용한 알부틴은 100 敏成에서 약 35% 멜라닌 감소 효과를 나타냈다.
- 실험 결과 돌나물 추출물은 tyrosinase, TRB1의 발현을 저해하는 것으로 나타났지만 TRB2의 발현량에는 영향을 미치지 않았다. 또한 이에 대한 density를 측정한 결과, 100 μ度mZ에서 tyrosinase 발현을 21%, TPR-1의 발현을 12% 감소시키는 것으로 나타났고, TRP-2 발현량은 변화가 없었다(Fig.
후속연구
- 19以)MITF 는 멜라닌 생합성에 관여하는 신호전달 경로 중 a-MSffl] 의한 cAMP 경로를 통하여 발현이 증가되고, extracellular signal- regulated kinase(ERK)에 의해 인산화되어 발현이 저해된다.暴跑) 따라서, Mosinase와 TRP-1 유전자 발현을 저해한 돌나물 추출물은 MITF를 조절하는 신호전달 과정에 관여하여 멜라닌 생성을 저해하는 것으로 추측되며 향후에 추가적인 연구가 필요하다고 생각된다.
- RT-PCR을 이용한 유전자 발현을 평가한 결과 tyrosinase, TRR1의 mRNA 발현도 감소하였으나, TRR2의 발현은 변화가 없었다. 돌나물 추출물은 항산화 효과 및 멜라닌 생합성에 관여하는 단백질과 유전자의 발현조절 경로를 통하여 멜라닌 생합성 저해 효과를 나타내는 것으로 보이며 향후 미백제로 응용 할 수 있을 것으로 생각된다.
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