[논문]새로운 플루오로 퀴놀론계 항균제에 대한 내성 MRSA 균주의 In Vitro 선발과 그 내성 기전 분석

윤은정; 김현지; 이춘영; 최응칠; 심미자

새로운 플루오로 퀴놀론계 항균제에 대한 내성 MRSA 균주의 In Vitro 선발과 그 내성 기전 분석
In Vitro Selection of MRSA Strains Resistant to Some New Fluoroquinolone Antibiotics and Characterization of their Resistance Mechanisms 원문보기

약학회지 = Yakhak hoeji, v.52 no.3, 2008년, pp.219 - 224

윤은정 (서울대학교 약학대학종합 약학 연구소) , 김현지 (서울대학교 약학대학종합 약학 연구소) , 이춘영 (서울시립대학교 생명과학과) , 최응칠 (서울대학교 약학대학종합 약학 연구소) , 심미자 (서울시립대학교 생명과학과)

Abstract ▼ AI-Helper

Clinically isolated methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains were exposed to subinhibitory concentration of DW286, DW-224a, gemifloxacin, trovafloxacin, sparfloxacin and ciprofloxacin during 26- to 39-days period. Subculturing led to resistance development, and most of the selected mutants were above susceptible breakpoints. Selected mutants had broad cross resistance to other quinolone antibiotics and only one mutant was completely susceptible to all fluoroquinolones. Twenty five among 42 mutants revealed mutations on DNA gyrase and topoisomerase IV by sequencing. Also 16 mutants had fluoroquinolones MICs that were 4-32 times lower in the presence of reserpine. In conclusion, alterations in DNA gyrase or topoisomerase IV and action of efflux pumping out system are the resistance mechanisms of DW-224a.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

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문제 정의

DW・224a는 MRSA, QRSA 및 폐렴쌍구균을 포함하는 그람 양성 구균에 효과적인 in vitro 활성을 보。]는 것으로 알려져 있으며, 그람 양성 구균에 의한 마우스의 전신 감염증에 대한 in vivo 적용에도 좋은 효과를 보인 바 있다.&W) 본 실험에서는, 퀴놀론계 항균제에 감수성인 7개 MRSA 균주를 DW-224a 및 다른 퀴놀론계 항균제에 순차적으로 노출시켜 내성을 유발하고, U) 이들을 대상으로 다른 퀴놀론계 항균제에 대한 교차내성을 관찰하고, DNA g界ase와 topoisomerase IV 에 일어난 돌연변이를 관찰하여 내성의 분자생물학적 기전을 분석함으로써 감염증의 치료과정에서 발생할 수 있는 내성을 예측해 보고자 하였다.

제안 방법

이 균 액을 MIC의 선 후 2단계 계열 희석 항균제를 포함하는 broth에 최종 104cfu/mM 노]基록 저종하였다. 37°C에서 24시간 동안 키운 후, 항균제가 들어있지 않은 배시와 긷은 탁소를 가시는 최고 농노의 계열 희석액을 골라긷은 방弔으로 계대 배양을 실시하였다. 이와 긷은 순차 계대 배양은 약 40일간 반보하였다.
항균제 유출 펌프가 작동되고 있다고 판단한다.均 선발된 돌연변이 체들과 모균주를, 20 jig/m/S] reserpine(Sigma, St Louis, MO, USA)이 포함되어있는 배지와 포함되어있지 않은 배지에서 각각 MIC를 결정하여 차이가 생기는지를 비교하였다.
, Ltd, Tokyo, Japan)를 이용하여 각 균 액을 5 讨씩접종하였다. 균의 성장을 관찰할 수 없는 최소 농도를 MIC로결정하였고, 내성의 기준은 CLSI의 breakpoint 등에 따라 CIP迁卩gE, GEM<1 pLg/mZ, SPXV0.5 曲/m/, TVA<1DW286<1 DW・224a<L 昭向로 하였다.询
순차 계대를 통해 선발된 돌연변이체들의 퀴놀론계 항균제 표적 부위에 어떤 변이가 있었는지를 확인하기 위하여 grlA, grlB, 幻泌와 gyrB를 PCR 地으로 증폭하였다. 幻历創以의 5'primer, CAGCGTTAGATGTAGCAAGC와 3'primer, CAGGACCTTCA- ATATCCTCC兄 1401 bp의 PCR product를 언었고, grlB建rlA 의 5'primer, CGATTAAAGCACAACAAGCAAG 와 3'primer, CTTGATGGCAATACCATTGGTT(淀 1332 bp의 PCR product 를 언었나.
06 pg/ m/이 뇌노록 항균물질 희석계열을 만들었으며, 계열희석된 항균물질의 농基는 CLSI에서 권장하는 ATCC 균수늘 이용하여 quality control 하였다. 여기에 선배 양한 균 액을 희석하여 최종균액 농도가 106CFU/m/7}- 되도록 한두], microinoculator (Sakuma Co., Ltd, Tokyo, Japan)를 이용하여 각 균 액을 5 讨씩접종하였다. 균의 성장을 관찰할 수 없는 최소 농도를 MIC로결정하였고, 내성의 기준은 CLSI의 breakpoint 등에 따라 CIP迁卩gE, GEM<1 pLg/mZ, SPXV0.

대상 데이터

돌연변이체들은 26회에서 39회의 순차계대 배양을 거쳐 선발하였다. 순차 계대 배양에 사용한 MRSA 모 균주의 MIC와 순차계대를 통해 증가된 MIC를 Table I에 나타내었다.
본 실험에 사용된 DW-224a와 DW286은 동화약품 주식회사 (An糸ng, Korea)에서 합성한 깃을 이용하였나. 비교를 우] 혜, 기존에 이용뇌고 있던 플루오로 취놀론계 항균제인 dprofloxacin (CIE Bayer, Inc.
서울의 3차 의료기관에서 1999닌에서 2005닌에 길쳐 임상적으로 분리된 포노:상구균 중 옥사실린에 내성 (oxacillin MIC 4 昭/ ml) 이벼 CIP에 김수성 (CIP MIC 1 咫/m/)인 7주의 MRSA를 선민 하여 이용하였다.
얻어진 최종의 MIC 값과 그에 대한 susceptibility는 플루오로 퀴놀론계 항생제의 세대에 따라 차이를 보였다. 이에 따라 신규 플루오로 퀴놀론계 항균제, DW286은 최상위 단계의 세대로, DW-224a는 GEM과 같은 4세대로 판단하였다.

성능/효과

7개 모 균주로부터 6가지의 퀴놀론계 항생제로 순차 계대 배양하여 선발한 42개 돌연변이체들에 대해 퀴놀론계 항균제에 대한 교차 내성을 확인한 결과, SA2에서 TVA로 선발한 돌연변이를 제외한 모든 균주가 순차 계대 배양 이전에 비해 다양한 플루오로 퀴놀론계 항균제에 교차 내성을 가지게 되었음을 확인하였다 (Table W. 이후의 돌연변이 주에 대한 통계는 이 1개 균주를 제외한 나머지를 41개 주를 대상으로 하였다. 41개 돌연변이주 모두 CIP에 내성이었고, 32주(78.
다만 DW286은 in vivo 실험 후에 그 개발이 중단된 상태이며 TVA는 임상 적용이 중단된 상태임을 감안한다면, GEM과 비슷한 정도의 내성 발전 정도를 가지는 임상에서 사용될 수 있는 가장 효과적인 플루오로 퀴놀론계항균제라고 할 수 있겠다. DW-224a 내성 돌연변이주들은 DNA g泪se의 일부인 如4와 topoisomerase IV으] 일부인 g也의 변이가 확인되었다. 이와 같은 결과는 DNA g取mse와 topoisomerase W} DW-224a의 이중 작용점을 가지고 있음을 증명하는 것이라고 할 수 있다.
03 昭向에서 2~32 卩或mZ로 7에서 10단계 상승하였다. DW286은 모든 대상 균주들에 대해 초기 MIC가 가장 낮았으며, 순차 계대 배양을 실시한 7개의 대상 균주 중 2개 균주만 breakpoint 이상으로 올라갔다. 얻어진 최종의 MIC 값과 그에 대한 susceptibility는 플루오로 퀴놀론계 항생제의 세대에 따라 차이를 보였다.
각각의 모 균주는, 순차 계대 배양에 사용했던 항균제에 따라 서로 조금씩 다른 내성 획득 양상을 보였다. TVA와 DW286으로 처리한 경우의 MIC가 가장 느리게 상승하였으며, CIP로 처리한 경우의 MIC가 가장 빠르고 높게 상승하여 플루오로 퀴놀론계 항균제의 세대별 차이를 확인할 수 있었다. 돌연변이체들은 모두 항균제가 들어있지 않은 배지에서 10회의 계대 배양을 거치며 내성을 안정화시켰다.
정리하였다. 모 균주는 모두 이들 효소에 아무런 변이도 가지고 있지 않음을 미리 확인하였다. DNA gyrase의 gyrA 유전자에서는, 총 6가지의 점 돌연변이와 1가지의 결손 돌연변이가 발견되었다.
DW286은 모든 대상 균주들에 대해 초기 MIC가 가장 낮았으며, 순차 계대 배양을 실시한 7개의 대상 균주 중 2개 균주만 breakpoint 이상으로 올라갔다. 얻어진 최종의 MIC 값과 그에 대한 susceptibility는 플루오로 퀴놀론계 항생제의 세대에 따라 차이를 보였다. 이에 따라 신규 플루오로 퀴놀론계 항균제, DW286은 최상위 단계의 세대로, DW-224a는 GEM과 같은 4세대로 판단하였다.

후속연구

즉 이들 16 개 돌연변이체들은 DNA gyrase 및 topoisomerase IV의 변이가 아닌 NorA에 의해 내성이 발전된 것으로 볼 수 있었다. 또한 reserpine을 처리했을 경우 그 MIC에 영향을 가장 많이 받는 것이 DW-224a인 것으로 보여져 이에 대한 후속 연구가 필요할 것으로 보一인다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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