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문제 정의
- , 2007). 따라서 본 연구는 사슴 미토콘드리아 DNA의 cytochrome b 및 D-loop 유전자 영역의 염기서열 변이성 분석을 통하여 국내에서 유통되고 있는 사슴 녹용의 종 판별과 위품 녹용인 순록을 감별하는 기술을 개발하고자 수행하였다. 또한, 본 연구에서 개발한 미토콘드리아 DNA 분석기술을 이용하여 시중에서 유통되고 있는 녹용 원용을 무작위 표본 추출하여 녹용의 종 감별을 조사하였다.
- 그러나 국내 수요량의 절반 이상을 수입에 의존하는 실정이고 유통단계에서 저가의 녹용이 고가의 녹용으로 둔갑 판매되거나 수입이 금지된 북미산 녹용이 유통이 되는 현실 속에서보다 과학적이고 객관적으로 사슴녹용의 종을 정확히 감별할 수 있는 기술이 요구되어 진다. 본 연구는 사슴 미토콘드리아 내의 cytochrome b와 D-loop 유전자 영역의 종간 염기서열 변이성 분석을 통해 국내에서 유통 판매되고 있는 녹용의 종 판별 기술을 개발하고자 수행하였다. 국제 유전자 은행인 NCBI GenBank database에 등록된 사슴의 cytochrome b와 D-loop 유전자 영역의 특정한 염기서열 정보를 기초로 각 유전자에 해당하는 특이적인 primer 를 설계 합성하고 PCR 증폭을 실시한 결과 Fig.
제안 방법
- PCR 증폭을 위한 반응조건은 Perkin-Elmerthennal cycler(GeneAmp TCR system 9700, PE Biosystem, USA)를 이용하여 cytochrome b 유전자는 94P에서 5분간 예비가열 후, 94℃<2에서 45초간 변성, 53℃(2에서 1분간 중합, 그리고 72℃(2에서 1분 30초간 신장반응을 총 35회 반복한 다음 마지막으로 72℃(2에서 5분간 가열 후 PCR 반응을 종료하였다. D-loop 유전자는 1분간 변성, 63P에서 1분간 중합, 그리고 72℃(:에서 1분 30초간 신장반응을 총 3℃회 반복하여 PCR 반응을 수행하였다. PCR 증폭산물의 확인은2%와 1.
- D-loop 유전자는 1분간 변성, 63P에서 1분간 중합, 그리고 72℃(:에서 1분 30초간 신장반응을 총 3℃회 반복하여 PCR 반응을 수행하였다. PCR 증폭산물의 확인은2%와 1.5% agarose gel(Gellix™ LF AGAROSE, Korea)을 이용하여 TAE buffer(40 mM Tris-acetate, 2 mM EDTA, pH 8.0)로 전기영동한 후 ethidium bromide 염색을 통하여 발현된 각각의 DNA 밴드를 확인하였다.
- 1 |1M, dNTP 각 250 rM, IOx PCR buffer 2 μL 그리고 Taq DNA polymerase 1 unit을 첨가하여 총 volume0] 20 pL가되도록 하였다. PCR 증폭을 위한 반응조건은 Perkin-Elmerthennal cycler(GeneAmp TCR system 9700, PE Biosystem, USA)를 이용하여 cytochrome b 유전자는 94P에서 5분간 예비가열 후, 94℃<2에서 45초간 변성, 53℃(2에서 1분간 중합, 그리고 72℃(2에서 1분 30초간 신장반응을 총 35회 반복한 다음 마지막으로 72℃(2에서 5분간 가열 후 PCR 반응을 종료하였다. D-loop 유전자는 1분간 변성, 63P에서 1분간 중합, 그리고 72℃(:에서 1분 30초간 신장반응을 총 3℃회 반복하여 PCR 반응을 수행하였다.
- mt DNA 유전자의 특정 염기서열 영역의 PCR 증폭을 위한 반응액 조성은 template DNA 50 ng, primer 각 0.1 |1M, dNTP 각 250 rM, IOx PCR buffer 2 μL 그리고 Taq DNA polymerase 1 unit을 첨가하여 총 volume0] 20 pL가되도록 하였다. PCR 증폭을 위한 반응조건은 Perkin-Elmerthennal cycler(GeneAmp TCR system 9700, PE Biosystem, USA)를 이용하여 cytochrome b 유전자는 94P에서 5분간 예비가열 후, 94℃<2에서 45초간 변성, 53℃(2에서 1분간 중합, 그리고 72℃(2에서 1분 30초간 신장반응을 총 35회 반복한 다음 마지막으로 72℃(2에서 5분간 가열 후 PCR 반응을 종료하였다.
- 그 후 최종산물을 3% agarose gel(Gellix™ LF AGAROSE, Korea)을 이용하여 전기영동한 후, ethidium bromide로 염색하고 UV상에 발현된 DNA profile을 검출하였다. 검출된 각 DNA 단편의 크기는 lKb+ DNA ladder(SolGent, KoreaX 이용하여 추정하였다.
- 공시재료로부터 mtDNA를 포함하고 있는 total DNA의 추출 및 정제는 Miller 등(1988)의 방법을 일부 수정하여 실시하였다. 즉, 녹용 3 g에 3배의 lysis buffer I (155 mM NH4C1, 10 mM KHCQ, ImM EDTA)을 첨가한 후 homo genizer! 이용하여 13, 000 rpm으로 균질화시킨 다음 3, 000 rpm으로 10분간 원심분리 하였다.
- 각 제한효소 혼합물 5 unit에 DNA 증폭산물 5 |1L 를 혼합하여 총 volume을 10 μ로 조정한 후, 각 제한 효소 활성 온도인 37℃(2와 6VC에서 3시간 동안 반응을 시켰다. 그 후 최종산물을 3% agarose gel(Gellix™ LF AGAROSE, Korea)을 이용하여 전기영동한 후, ethidium bromide로 염색하고 UV상에 발현된 DNA profile을 검출하였다. 검출된 각 DNA 단편의 크기는 lKb+ DNA ladder(SolGent, KoreaX 이용하여 추정하였다.
- 1에서 보는 바와 같이 5종의 공시 녹용 모두에서 cytochrome b 유전자의 466 bp 단편과 D-loop 유전자의 1175 bp 단편이 각각 검출되어 두 유전자 영역에서 목적으로 하는 DNA 증폭이 성공적으로 이루어졌음을 확인할 수 있었다. 또한 5 종의 사슴 녹용에서 검출한 mt DNA cytochrome b 및 D- loop 유전자의 PCR 증폭산물에 대한 DNA 염기서열 분석하고 종간 염기서열 정보를 비교 분석한 sequence alignment 결괴는 cytochrome b 유전자의 경우 Fig. 2 그리고 D-loop 유전자는 Fig. 3에 각각 제시하였다. 그리고 녹용 종간 mtDNA 영역내 cytochrome b 및 DToop 유전자의 염기서열의 종간 변이성을 분석한 결과는 Table 1과 2에 각각 제시하였다.
- 따라서 본 연구는 사슴 미토콘드리아 DNA의 cytochrome b 및 D-loop 유전자 영역의 염기서열 변이성 분석을 통하여 국내에서 유통되고 있는 사슴 녹용의 종 판별과 위품 녹용인 순록을 감별하는 기술을 개발하고자 수행하였다. 또한, 본 연구에서 개발한 미토콘드리아 DNA 분석기술을 이용하여 시중에서 유통되고 있는 녹용 원용을 무작위 표본 추출하여 녹용의 종 감별을 조사하였다.
- 사슴 미토콘드리아 cytochrome b와 D-loop 유전자의 특정 염기서열 부위의 증폭을 위한 primer의 설계는 NCBIGenBank database0, ] 등록된 cytochrome b(accession no. AB218689) 및 D-loop(accession no. AY970666) 유전자 영역의 염기서열을 이용하였다. 즉, cytochrome b 유전자 영역의 466bp의 단편을 증폭하기 위하여 forward 5-GAT ATG AAA AAC CAT CGT TG-3' 및 reverse 5'-CTC AGC CTG ATA TTT GTC CT-3'의 primer 그리고 D-loop 유전자 영역의 1175 bp의 단편을 증폭하기 위해 D-loopforward 5'-TAA ACC AGA AAA GGA GAG CA-3' 및 reverse 5'-CAA ACC TGT GTG TTT ATG GA-3, 의 염기서열로 구성된 primer를 각각 설계 합성하였다.
- 종 5종의 사슴 녹용에 대한 mt DNA cytochrome b 및 D-loop 유전자의 염기서열을 비교분석한 후, 제한효소 탐색 프로그램 (http://insilico.ehu.es/restrdction/one_seq/)을 활용하여 cytochrome b 유전자에서 순록을 구별할 수 있는 특정 염기서열 부위를 인지하는 2종류의 제한효소 NlaW 와TaqI(New England Biolabs, USA)을 발굴하고 이들 두종류의 제한효소를 각각 이용하여 DNA 증폭산물을 절단하였다. 각 제한효소 혼합물 5 unit에 DNA 증폭산물 5 |1L 를 혼합하여 총 volume을 10 μ로 조정한 후, 각 제한 효소 활성 온도인 37℃(2와 6VC에서 3시간 동안 반응을 시켰다.
- AY970666) 유전자 영역의 염기서열을 이용하였다. 즉, cytochrome b 유전자 영역의 466bp의 단편을 증폭하기 위하여 forward 5-GAT ATG AAA AAC CAT CGT TG-3' 및 reverse 5'-CTC AGC CTG ATA TTT GTC CT-3'의 primer 그리고 D-loop 유전자 영역의 1175 bp의 단편을 증폭하기 위해 D-loopforward 5'-TAA ACC AGA AAA GGA GAG CA-3' 및 reverse 5'-CAA ACC TGT GTG TTT ATG GA-3, 의 염기서열로 구성된 primer를 각각 설계 합성하였다.
- 한편, cytochrome b 유전자에서 녹용 종간 특정 염기서열 부위를 인지하는 NlaN와 Rjgl제한효소를 이용한 PCR- RFLP 기법으로 순록에 특이적인 RFLP profile을 검출하였다(Fig. 4). 즉, NlaW 제한효소를 이용하여 5종의 녹용 DNA 증폭산물을 각각 절단했을 때 순록의 cytochrome b 유전자 영역에서는 제한효소 인지부위가 존재하지 않아 절단되지 않은 446 bp의 단일 DNA band로 출현하였으나 나머지 4개의 녹용 종에서는 제한효소 인지부위가 존재해 322 bp 및 144 bp 두 개의 단편으로 절단된 DNA band 출현 양상을 나타냈다.
대상 데이터
- 공시한 사슴 녹용 가운데 러시아산 마록, 중국산 마록및 알래스카 순록의 표준 녹각절편은 검증된 시료를 다수확보하는 데에 어려움이 있어 한 . 중 사슴 국제 공동연구사업을 통하여 중국 길림성 연변대학에서 시료를 제공받았으며 북미산 수입 엘크 및 꽃사슴은 국내 사슴농장에서 절각한 녹각절편을 사용하였다. 한편, 시중에서 러시아산 원용으로 유통되고 있는 절편 녹용 32개를 무작위 구입하여 사슴 종 검증에 사용하였다.
- 중 사슴 국제 공동연구사업을 통하여 중국 길림성 연변대학에서 시료를 제공받았으며 북미산 수입 엘크 및 꽃사슴은 국내 사슴농장에서 절각한 녹각절편을 사용하였다. 한편, 시중에서 러시아산 원용으로 유통되고 있는 절편 녹용 32개를 무작위 구입하여 사슴 종 검증에 사용하였다.
- 현재 우리나라에서 유통되고 있는 대표적인 녹용으로서 혈연 및 근연관계가 없는 러시아산 원용(Cervas elaphus sibericus, 마록), 숭국산 깔깔이(Cervus elaphus bactrianus, 마록) 및 알래스카산 순록(Rangifer tarandus, 순록) 각각의 사슴 종 3 개체와 북미산 대록(Cervus elaphus canadensis, 엘크), 국산 화용(Cervics nippon, 꽃사슴)의 13 개체의 녹용 시료 20 g을 채취해 건조시킨 후 공시재료로 사용하였다. 공시한 사슴 녹용 가운데 러시아산 마록, 중국산 마록및 알래스카 순록의 표준 녹각절편은 검증된 시료를 다수확보하는 데에 어려움이 있어 한 .
데이터처리
- 0.1)을 이용하여 사슴 종간 염기서열 alignment-!- 통한 변이성을 비교 분석하였다.
이론/모형
- Cytochrome b 및 D-loop 유전자의 염기서열을 분석하기 위하여 PCR Purification kit(SolGent, Korea)를 이용하여 증폭 산물을 정제를 한 후, ABI PRISM 3730 DNA analyzer (Applied Biosystems, USA)를 이용하여 direct sequencing법으로 염기서열을 분석하였다.
성능/효과
- 또한, Taql 제한효소를 이용한 RFLP 표지 인자는 러시아산 원용을 순록 뿔은 물론 나아가 중국산 깔깔이 및 국산 화용의 녹용으로부터 식별이 가능함을 시사하였다. 결론적으로 국내에서 유통되는 녹용의 mt DNA내 cytochrome b 유전자 및 D-loop 유전자 영역의 특정 염기서열의 종간 변이성 비교 분석으로 녹용의 종 감별이 가능하였고, 또한 cytochrome b 유전자의 종 특이적 PCR- RFLP 분자표지 검출을 통해 녹용과 순록 뿔을 보다 간편하게 판별할 수 있었다. 따라서 본 연구에서 사슴 mt DNA 염기서열 변이를 이용한 녹용의 종 감별 기술은 고가의 한약 재료인 녹용의 과학적인 종 감별 및 원산지 추정을 통한 녹용의 둔갑판매 및 불법유통을 방지할 수 있는 판별기술로 활용 가능할 것으로 사료된다.
- 본 연구는 사슴 미토콘드리아 내의 cytochrome b와 D-loop 유전자 영역의 종간 염기서열 변이성 분석을 통해 국내에서 유통 판매되고 있는 녹용의 종 판별 기술을 개발하고자 수행하였다. 국제 유전자 은행인 NCBI GenBank database에 등록된 사슴의 cytochrome b와 D-loop 유전자 영역의 특정한 염기서열 정보를 기초로 각 유전자에 해당하는 특이적인 primer 를 설계 합성하고 PCR 증폭을 실시한 결과 Fig. 1에서 보는 바와 같이 5종의 공시 녹용 모두에서 cytochrome b 유전자의 466 bp 단편과 D-loop 유전자의 1175 bp 단편이 각각 검출되어 두 유전자 영역에서 목적으로 하는 DNA 증폭이 성공적으로 이루어졌음을 확인할 수 있었다. 또한 5 종의 사슴 녹용에서 검출한 mt DNA cytochrome b 및 D- loop 유전자의 PCR 증폭산물에 대한 DNA 염기서열 분석하고 종간 염기서열 정보를 비교 분석한 sequence alignment 결괴는 cytochrome b 유전자의 경우 Fig.
- mt DNA의 염기서열 비교에서 1% 이상의 차이가 존재하면 유전적 차이를 인정하여 종간 구별에 의미가 있다고 판단할 때 cytochrome b 유전자의 경우 러시아산 원용과 북미산 대록간의 염기서열이 100% 일치하여 이 두 종간의 구별이 불가능하였으나 다른 녹용 종(국산 화용, 중국산 마록 및 순록)과는 높은 염기서열 차이로 종간 구별이 가능하였다. 그러나 D- loop 유전자 영역의 염기서열 상동성 분석에서는 러시아산 원용과 북미산 대록간에 약 1.9%의 염기서열 차이가 존재하여 이들 녹용의 종간 판별 가능성을 시사해 주고 있고, 나아가 다른 사슴 종 녹용과도 cytochrome b 유전자 염기서열(3.7~10.7%)에 비해 더 높은 염기서열 차이 (5.0~12.2%)를 보여 D-loop 유전자 영역이 염기서열 분석에 의한 사슴 녹용의 종간 판별에 보다 효과적인 것으로 분석되었다. 이러한 mt DNA 유전자 영역의 염기서열 정보 분석으로 사슴 녹용의 종 및 아종 간 구별이 가능하고 원산지도 어느 정도 추정할 수 있으나 녹용의 정확한 원산지 판정을 위해서는 보다 다양한 사슴의 종과 아종 그리고 더 많은 시료를 대상으로 한 비교 연구가 추진되어야 할 필요가 있다.
- 0%) 시료는 중국산 마록(Ce/ws elaphus bactrianus)으t 염기서열과 99% 일치했고 기타 엘크 아종(Cerws elaphus nelsoni) 및 순록 아종(Rangifer tarandus groenlandicus)의 염기서열과 상동성을 갖는 녹용 시료도 각각 2개 및 1개씩 검출되었다. 그리고 1개 녹용시료는 어느 사슴 종과도 97%의 낮은 상동성을 보여 정확한 녹용 종 판정이 불가능하였다.
- 즉, NlaW 제한효소를 이용하여 5종의 녹용 DNA 증폭산물을 각각 절단했을 때 순록의 cytochrome b 유전자 영역에서는 제한효소 인지부위가 존재하지 않아 절단되지 않은 446 bp의 단일 DNA band로 출현하였으나 나머지 4개의 녹용 종에서는 제한효소 인지부위가 존재해 322 bp 및 144 bp 두 개의 단편으로 절단된 DNA band 출현 양상을 나타냈다. 그리고 Taql 제한효소를 이용하여 DNA 를 절단할 경우 순록은 214 bp 및 252 bp 크기를 갖는 두 개의 DNA bami로 출현하여 절단된 band의 크기와 수에서 다른 사슴의 녹용과 확실한 차이가 인정되어 사슴의 녹용과 순록 뿔의 구별이 가능하였다. 또한, Taql 제한효소의 경우 깔깔이와 화용은 27 bp, 115 bp, 137 bp 및 187 bp 크기의 단편을 나타냈고 원용과 대록은 27 bp, 187 bp 및 252 bp 크기의 단편을 보였다.
- 따라서 cytochrome b 유전자 영역의 염기서열 분석을 통해 러시아산 원용은 북미산 대록과 구별이 불가능하였으나 나머지 녹용 종간 판별은 가능하였다. 다음으로 D-loop 유전자의 녹용 종간 염기서열 정보를 비교 분석한 결과, 러시아산 원용은 북미산 대록과 1.9%의 염기서열 차이를 보였고 국산화용과 5.0%, 중국산 마록과 5.7% 그리고 순록과는 12.2%의 가장 높은 염기서열 차이를 나타냈다. 따라서 이와 같은 생물정보학적 분석에 의한 녹용 종간 유전정보의 동질성 비교를 통해 녹용 종간에 명확한 차이를 보이는 염기서열을 확인할 수 있었고 특히 , D-loop 유전자 영역은 cytochrome b 유전자에 비해 더 높은 염기서열 변이를 나타내 D-loop 유전자 영역의 염기서열 분석으로 녹용 원용 및 종간 판별이 가능하였다.
- 2%의 가장 높은 염기서열 차이를 나타냈다. 따라서 이와 같은 생물정보학적 분석에 의한 녹용 종간 유전정보의 동질성 비교를 통해 녹용 종간에 명확한 차이를 보이는 염기서열을 확인할 수 있었고 특히 , D-loop 유전자 영역은 cytochrome b 유전자에 비해 더 높은 염기서열 변이를 나타내 D-loop 유전자 영역의 염기서열 분석으로 녹용 원용 및 종간 판별이 가능하였다.
- 본 연구에서 녹용 cytochrome b 유전자의 염기서열 비교분석에서 특정 염기서열 부위를 인식하여 DNA를 절단할 수 있는 NlaW 와 Taql 두 종류의 제한효소를 발견하고 이들 제한효소를 각각 이용한 PCR-RFLP 기법을 통해 순록에 특이적으로 발현되는 DNA profile을 검출하였고 녹용과 순록 뿔 간의 판별을 위한 DNA 표지인자로 이용할 수 있을 것으로 기대된다. 또한, Taql 제한효소를 이용한 RFLP 표지 인자는 러시아산 원용을 순록 뿔은 물론 나아가 중국산 깔깔이 및 국산 화용의 녹용으로부터 식별이 가능함을 시사하였다. 결론적으로 국내에서 유통되는 녹용의 mt DNA내 cytochrome b 유전자 및 D-loop 유전자 영역의 특정 염기서열의 종간 변이성 비교 분석으로 녹용의 종 감별이 가능하였고, 또한 cytochrome b 유전자의 종 특이적 PCR- RFLP 분자표지 검출을 통해 녹용과 순록 뿔을 보다 간편하게 판별할 수 있었다.
- 그리고 녹용 종간 mtDNA 영역내 cytochrome b 및 DToop 유전자의 염기서열의 종간 변이성을 분석한 결과는 Table 1과 2에 각각 제시하였다. 먼저 cytochrome b 유전자의 녹용 종간 염기서열 상동성 분석에서 러시아산 원용은 북미산 대록과 염기서열이 100% 일치하였으나 국산화용과는 3.7%, 중국산마록과는 5.0%의 염기서열 차이를 나타냈고 순록과는 10.7%의 염기서열 차이를 보였다. 따라서 cytochrome b 유전자 영역의 염기서열 분석을 통해 러시아산 원용은 북미산 대록과 구별이 불가능하였으나 나머지 녹용 종간 판별은 가능하였다.
- 특히, mt DNA의 유전자 영역 가운데 D-loop는 가장 변이성이 높은 염기서열 영역으로 염기치환율은 다른 염기서열 영역에 비해 약 5배정도 높은 것으로 추정되고 있다(Aquadro and Greenberg, 1983). 본 연구에서도 사슴 녹용 mt DNA의 종간 염기서열 다양성도 D-loop 유전자 영역이 cytochrome b 유전자에 비해 높은 것으로 나타났다. mt DNA의 염기서열 비교에서 1% 이상의 차이가 존재하면 유전적 차이를 인정하여 종간 구별에 의미가 있다고 판단할 때 cytochrome b 유전자의 경우 러시아산 원용과 북미산 대록간의 염기서열이 100% 일치하여 이 두 종간의 구별이 불가능하였으나 다른 녹용 종(국산 화용, 중국산 마록 및 순록)과는 높은 염기서열 차이로 종간 구별이 가능하였다.
- 4). 즉, NlaW 제한효소를 이용하여 5종의 녹용 DNA 증폭산물을 각각 절단했을 때 순록의 cytochrome b 유전자 영역에서는 제한효소 인지부위가 존재하지 않아 절단되지 않은 446 bp의 단일 DNA band로 출현하였으나 나머지 4개의 녹용 종에서는 제한효소 인지부위가 존재해 322 bp 및 144 bp 두 개의 단편으로 절단된 DNA band 출현 양상을 나타냈다. 그리고 Taql 제한효소를 이용하여 DNA 를 절단할 경우 순록은 214 bp 및 252 bp 크기를 갖는 두 개의 DNA bami로 출현하여 절단된 band의 크기와 수에서 다른 사슴의 녹용과 확실한 차이가 인정되어 사슴의 녹용과 순록 뿔의 구별이 가능하였다.
- 한편, 녹용 종간 염 기서 열 변이성이 높은 mt DNA D-loop 유전자의 특정 영역 염기서열 분석 (DNA sequencing) 기법을 이용하여 시중에서 러시아산 원용으로 유통되고 있는 녹용 절편 32개를 무작위로 표본 추출하여 mt DNA를 분리하고 염기서열을 분석하여 러시아산 원용의 염기서열과 상동성 여부를 분석한 결과 이 가운데 20개(62.5%) 시료는 러시아산 원용(Cerws elaphus sibericus)^ 99~100% 일치하였으나 나머지 8개 (25.0%) 시료는 중국산 마록(Ce/ws elaphus bactrianus)으t 염기서열과 99% 일치했고 기타 엘크 아종(Cerws elaphus nelsoni) 및 순록 아종(Rangifer tarandus groenlandicus)의 염기서열과 상동성을 갖는 녹용 시료도 각각 2개 및 1개씩 검출되었다. 그리고 1개 녹용시료는 어느 사슴 종과도 97%의 낮은 상동성을 보여 정확한 녹용 종 판정이 불가능하였다.
후속연구
- 따라서 러시아산 원용은 중국산 깔깔이 및 국내산 화용의 녹용들과는 DNA band 의 크기와 수가 달라 이들 녹용과 판별이 가능하였다. 결론적으로 사슴 mt DNA의 D-loop 유전자의 특정 영역의 염기서열 유전정보 차이를 이용한 분석법으로 녹용의 종감별이 가능하였고, 특히 cytochrome b 유전자의 특정 염기서열 부위를 인지하는 제한효소를 이용한 PCR-RFLP 기법을 이용하여 녹용으로 인정하지 않는 위품 녹용인 순록을 검출할 수 있게 되어 국내 녹용의 둔갑판매 및 불법유통을 검색할 수 있을 것으로 기대된다.
- 결론적으로 국내에서 유통되는 녹용의 mt DNA내 cytochrome b 유전자 및 D-loop 유전자 영역의 특정 염기서열의 종간 변이성 비교 분석으로 녹용의 종 감별이 가능하였고, 또한 cytochrome b 유전자의 종 특이적 PCR- RFLP 분자표지 검출을 통해 녹용과 순록 뿔을 보다 간편하게 판별할 수 있었다. 따라서 본 연구에서 사슴 mt DNA 염기서열 변이를 이용한 녹용의 종 감별 기술은 고가의 한약 재료인 녹용의 과학적인 종 감별 및 원산지 추정을 통한 녹용의 둔갑판매 및 불법유통을 방지할 수 있는 판별기술로 활용 가능할 것으로 사료된다.
- 그러나 염기서열의 분석은 짧은 시간 내에 결과를 얻기가 곤란하고 비용이 많이 소요되기 때문에 다수의 검체를 대상으로 검사할 경우 PCR-RFLP 기법을 이용하는 것이 보다 실용적이고 경제적인 분석방법이라고 할 수 있다. 본 연구에서 녹용 cytochrome b 유전자의 염기서열 비교분석에서 특정 염기서열 부위를 인식하여 DNA를 절단할 수 있는 NlaW 와 Taql 두 종류의 제한효소를 발견하고 이들 제한효소를 각각 이용한 PCR-RFLP 기법을 통해 순록에 특이적으로 발현되는 DNA profile을 검출하였고 녹용과 순록 뿔 간의 판별을 위한 DNA 표지인자로 이용할 수 있을 것으로 기대된다. 또한, Taql 제한효소를 이용한 RFLP 표지 인자는 러시아산 원용을 순록 뿔은 물론 나아가 중국산 깔깔이 및 국산 화용의 녹용으로부터 식별이 가능함을 시사하였다.
- 2%)를 보여 D-loop 유전자 영역이 염기서열 분석에 의한 사슴 녹용의 종간 판별에 보다 효과적인 것으로 분석되었다. 이러한 mt DNA 유전자 영역의 염기서열 정보 분석으로 사슴 녹용의 종 및 아종 간 구별이 가능하고 원산지도 어느 정도 추정할 수 있으나 녹용의 정확한 원산지 판정을 위해서는 보다 다양한 사슴의 종과 아종 그리고 더 많은 시료를 대상으로 한 비교 연구가 추진되어야 할 필요가 있다. Matsunaga 등(1998)은 일본에서 다른사슴육에 비해 높은 가격으로 판매되고 있는 일본 꽃사슴(sika deer, Cervus nippon) 고기의 육종 감별을 위해 붉은사슴(red deer, Cervus elaphus)의 cytochrome b 유전자 염기서열을 분석한 결과 꽃사슴과 94.
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