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문제 정의
- 인 이용가치를 증대하고자 모색하고 있다. 그 중에서도 혈전 분해효소 활성을 가진 균주로부터 우수한 기능의 혈전 분해효소를 분리하고자 하였다[6, 30, 31]. 혈전 형성에 관여하는 주요 단백질로는 fibrin이 보고되어 있는데 이것은 그대로 두면 다시 용해되는데 이것을 섬유소용해라고 한다.
- 따라서 본 연구에서는 늘 가까이에서 접하고 있는 새우젓으로부터 기존의 효소들보다 우수한 기능을 가진 혈전용해제관여 효소와 chitinase를 개발하고자 하였다. 우선 새우젓에서혈전 용해력과 chitin 분해능이 뛰어난 균주를 분리하여 그균주가 생산하는 효소의 특성을 조사하였다.
제안 방법
- B. licheniformis SC082 균주의 chitinase 생산에 colloidal chitin의 농도가 미치는 영향을 알아보기 위하여 효소생산 기본배지 에 colloidal chitin을 0.5, 1.0, 2.0%를 첨가하여 37℃, 200 rpm, 24시간동안 진탕 배 양한 다음 chitinase 활성을 측정하였다. Fig.
- B. lichmifomiis SC082 균주의 혈전분해능을 조사하기 위하여 균주의 배양상등액과 대조구로서 액체배지를 사용하였다. 37℃에서 3시간 반응시킨 후 그 결과는 Fig.
- 5), 1% Triton xl00)에서 24시간 담근 다음, 증류수로 세척한 후 Coomassie brilliant blue R-250로 염색하였다. Chitin 분해능을 지닌 단백질 분획은 활성염색법에의 해 gel상의 glycol chitin을 분해하여 Coomassie blue R-250염색결과 투명대로 활성을 확인하였다.
- Chitinase의 활성 분석은 기질용액으로 1.0% (W/V)의 colloidal chitin을 포함한 25 mM Tris-Cl (pH 7.5) 완충용액을이용하였으며, 25, 35, 45℃에서 또는 pH 3-9에서 1시간 동안 조 효소액과 반응시킴으로써 이루어졌다. 반응이 끝난 다음 5 분간 boiling하여 반응을 정지시킨 후 남아있는 colloidal chi- tin을 제거하기 위하여 원심분리(12,000 rpm, 10분)를 하였고, 그 상등액을 이용하였다.
- Colloidal chitine Roberts 와 Selitrennikoff의 방법 [35] 을변형하여 조제하였다. Chitin (C9213, Sigma-Aldrich Co.
- Stacking 겔과 running 겔의 acrylamide 농도는 3%와 10% 을 각각 사용하였으며/ 단백질은 0.2% Coomassie brilliant blue R-250로 염색하였다.
- 우선, 반응온도에 따른 혈전분해효소의 활성은응고된 fibrin plate에 동량의 조효소액과 plasmin을 점 적하여 25, 30, 35, 40, 45, 50℃에서 1시간 또는 3시 간동안 반응시 켜용해된 분해면적 측정으로 분석하였다. pH에 따른 혈전분해효소의 활성 분석은 pH 6.0-9.0에서 1시간 또는 3시간 동안반응시켜 용해된 분해면적을 측정함으로써 이루어졌다. 효소활성의 세기는 혈전분해효소로 알려져 있는 plasmin에 의해분해된 면적과 비교하여 결정되었다.
- 12% (w/v) 가 되게 polyacrylamide 용액에 혼합한 후 즉시 thrombin (1, 000 unit/ml) 을 첨가하여 제조한 10% fibrin-poly- acrylamide gel에서 수행하였다. 각 lane에 혈전분해능이 우수한 분리균주의 조효소액을 점적한 후 전기영동을 실시한 다음 SDS에 의해 불활성화된 효소를 재활성화 시키기 위하여 gel을 2.5% Triton X-100을 포함한 Tris-HCl (50 mM, pH 7.5)에 30분 동안 침적하여 단백질을 활성화 시킨 후 Triton X-100을 제거하기 위하여 멸균수로 5분 동안 세척하였다. 분획된 단백질의 혈전 분해 활성은 활성반응 완충용액 (50 mM Tris-HCl, pH 7.
- Chitine 불용성의 고분자 화합물로서 게, 새우 등의 갑각류 뿐만 아니라 곤충류와 곰팡이등에 다량 함유되어 있는데 이러한 chitin을 분해함으로써 다분야에서의 이익 창출을 기대하고 있다. 먼저, 농업분야에서는 작물에 해로운 곤충이나 곰팡이의 성분인 chitin을 분해시켜 농작물 피해를 줄이고자 하고 [34], 폐기물로 쌓이고 있는 게와 새우껍질의 성분인 chitin을 분해시킴으로써 환경개선을 추구하고자 한다. 뿐만 아니라, chitin 의 분해산물은 식품분야 및 의약품 분야에서 고부가가치의 물질로써 상업적으로 이용될 수 있다[26, 39, 4이.
- 후 600 nm에서 흡광도를 측정하였다. 배 양조건은 온도(25, 28, 37, 40, 50℃), pH(4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0), salt농도 (0.5, 3, 6, 9, 12, 15%)에 따른 생육특성을 조사하였다.
- 분리 된 균주 B. licheniformis SC082의 chitin 분해 동위효소를 확인하기 위하여 0.1% glycol chitin을 포함한 10% polyacrylamide gel상에서 전기영동을 실시하였다. Chitin 분해능을 지닌 단백질 분획은 활성염색법에 의해 gel상의 glycol chi- tin을 분해하여 Coomassie blue R-250 염색결과에서 투명 대로서 나타났다.
- 분리 된 균주 B. licheniformis SC082의 혈전분해동위효소를확인하기 위하여 fibrinogen 농도가 0.12% (w/v)가 되 게 polyacrylamide 용액 에 혼합한 후 즉시 thrombin (1,000 unit/ml) 을 첨가한 10% fibrin-polyacrylamide gel 상에서 전기 영동을실시하였다. Fibrin 분해능을 지닌 단백질 분획은 활성염색법에 의해 gel상의 fibrin을 분해하여 Coomassie blue R-250 염색결과에서 투명대로서 나타났다.
- 응고된 fibrin plate에 각 시료를 적당량 점 적하여 3시간 동안 37℃에서 반응시켰다. 분리 된 균주의 protease 활성은 skim milk 배지를 이용하였으며, lipase 활성은 tributyrin을 기질로 하여 확인하였고, chitinase 활성은 colloidal chitin agar plate에서 조사하였다.
- 2)에 도말하여 단일 colony 를 분리하였다. 분리된 colony를 LB broth에 접종하여 37℃에서 배 양한 후 그 상등액을 fibrin plate와 1.0% colloidal chitin plate에 20 ul씩 loading하여 혈전과 chitin 분해능이 가장 우수한 균주를 선발하였다. 미생물의 동정은 한국미생물보존센터 (KCCM)에 의 뢰하여 16S rRNA sequence에 의한 유전자간의상동성비교로 동정하였다.
- 분리된 균주의 배양조건에 따른 균주의 특성 분석을 위하여온도, salt농도, pH를 달리하여 37℃에서 24시간동안 진탕배양한 후 600 nm에서 흡광도를 측정하였다. 배 양조건은 온도(25, 28, 37, 40, 50℃), pH(4.
- 새우젓으로부터 분리된 B. licheniformis SC082 균주를 DPPH 법에 따라 균주를 배양한 직후 항산화력을 측정하였다. 배양 상등액에 대한 DPPH 라디칼 소거 활성을 농도별로 측정한 결과 Fig.
- 새우젓으로부터 혈전과 chitin 분해능이 우수한 균주를 선별하기 위하여 LB agar plate (Tryptone 1.0%, Yeast extract 0.5%, NaCl 1.0%, Agar 1.5%, pH 7.2)에 도말하여 단일 colony 를 분리하였다. 분리된 colony를 LB broth에 접종하여 37℃에서 배 양한 후 그 상등액을 fibrin plate와 1.
- 선별된 혈전과 chitin 분해능이 가장 우수한 균주로부터 genomic DNA (gDNA) 분리는 G-spin™ genomic DNA extraction kit (iNtRON Biotechnol.)를 사용하여 분리하였으며 분리 된 gDNA는 16S rRNA sequence 분석을 위한 template로 사용하였다.
- 전자공여능(Electron donating ability, EDA)은 EDA (%)=1-시료첨가구흡광도/대조구흡광도xl00으로 계산하였다. 시료를첨가하지 않은 대조그룹과 흡광도차를 비교하여 프리라디칼의 제거활성을 백분율로 나타내었다.
- 효소와 chitinase를 개발하고자 하였다. 우선 새우젓에서혈전 용해력과 chitin 분해능이 뛰어난 균주를 분리하여 그균주가 생산하는 효소의 특성을 조사하였다.
- 우선, 반응온도에 따른 혈전분해효소의 활성은응고된 fibrin plate에 동량의 조효소액과 plasmin을 점 적하여 25, 30, 35, 40, 45, 50℃에서 1시간 또는 3시 간동안 반응시 켜용해된 분해면적 측정으로 분석하였다. pH에 따른 혈전분해효소의 활성 분석은 pH 6.
- 2에 여과시 켜 만들었고, Blois의방법 에 따라 DPPH 용액 4 ml 균 배양액 1 ml 혼합하여 37℃에서 30분간 반응시킨 후 520nm에서 흡광도를 측정하였다[2]. 전자공여능(Electron donating ability, EDA)은 EDA (%)=1-시료첨가구흡광도/대조구흡광도xl00으로 계산하였다. 시료를첨가하지 않은 대조그룹과 흡광도차를 비교하여 프리라디칼의 제거활성을 백분율로 나타내었다.
- 조효소액을 이용하여 온도 및 pH에 따른 효소의 안정성을실시하였다. 우선, 반응온도에 따른 혈전분해효소의 활성은응고된 fibrin plate에 동량의 조효소액과 plasmin을 점 적하여 25, 30, 35, 40, 45, 50℃에서 1시간 또는 3시 간동안 반응시 켜용해된 분해면적 측정으로 분석하였다.
- 혈전분해 활성은 Astrup와 Hullertz의 방법을 변형하여 사용하였다0.4% fibrinogen (Sigma)을 sodium borate buffer (10 mM sodium borate, 160 mM boric acid, 40 mM NaCl Merck)에 녹인 후 직경 87x15 mm petridish에 10 ml 넣은 후 thrombin (1,000 unit/ml Sigma) 20 unit를 첨가하여 실온에 30분간 방치하여 응고시 켰다. 응고된 fibrin plate에 각 시료를 적당량 점 적하여 3시간 동안 37℃에서 반응시켰다.
- 0에서 1시간 또는 3시간 동안반응시켜 용해된 분해면적을 측정함으로써 이루어졌다. 효소활성의 세기는 혈전분해효소로 알려져 있는 plasmin에 의해분해된 면적과 비교하여 결정되었다.
대상 데이터
- B. licheniformis SC082 균주의 혈전분해능을 조사하기 위하여 동량의 균주 조효소 액과 plasmin을 사용하였다. B.
- 이때 얻은 용액을 조 효소액으로 사용하였으며, 단백질 정량은 Bradford의 방법 [3]에 따라 측정하였다. 흡광도는 595 nm에서 UV-Vis spectrophotometer (Ultrospec® 3000)를 이용하여 측정하였고, 표준단백질로는 bovine serum albumin을 사용하였다.
이론/모형
- DPPH (l, l-Diphenyl-2-picrylhydrazyl) 용액은 100 ml 에탄올에 DPPH 1.5xl04 M을 녹인 후 증류수 100 ml 혼합하여 Whatman filter paper No. 2에 여과시 켜 만들었고, Blois의방법 에 따라 DPPH 용액 4 ml 균 배양액 1 ml 혼합하여 37℃에서 30분간 반응시킨 후 520nm에서 흡광도를 측정하였다[2]. 전자공여능(Electron donating ability, EDA)은 EDA (%)=1-시료첨가구흡광도/대조구흡광도xl00으로 계산하였다.
- SDS-chitin zymogram 분석은 Trudel and Asselin 방법 [37] 에 따라 수행되었다. 단백질 시료에 SDS-PAGE sample buffer 를 넣고 80℃에서 5분 동안 가열한 후 전기영동 시료로 사용하였다.
- Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)은 Laemmli방법 [2이에 따라 수행되었다. Stacking 겔과 running 겔의 acrylamide 농도는 3%와 10% 을 각각 사용하였으며/ 단백질은 0.
- 0% colloidal chitin plate에 20 ul씩 loading하여 혈전과 chitin 분해능이 가장 우수한 균주를 선발하였다. 미생물의 동정은 한국미생물보존센터 (KCCM)에 의 뢰하여 16S rRNA sequence에 의한 유전자간의상동성비교로 동정하였다.
- 5) 완충용액을 이용하여 투석하였다. 이때 얻은 용액을 조 효소액으로 사용하였으며, 단백질 정량은 Bradford의 방법 [3]에 따라 측정하였다. 흡광도는 595 nm에서 UV-Vis spectrophotometer (Ultrospec® 3000)를 이용하여 측정하였고, 표준단백질로는 bovine serum albumin을 사용하였다.
- 반응이 끝난 다음 5 분간 boiling하여 반응을 정지시킨 후 남아있는 colloidal chi- tin을 제거하기 위하여 원심분리(12,000 rpm, 10분)를 하였고, 그 상등액을 이용하였다. 효소 활성의 세기는 DNS (Dinitrosalicylic acid) 법 [28] 으로 colloidal chitin으로부터 유리 된 환원당을 정 량함으로써 알 수 있었고, 표준당으로는 glu- cose를 사용하였다.
성능/효과
- lichmifomiis SC082 균주의 혈전분해능을 조사하기 위하여 균주의 배양상등액과 대조구로서 액체배지를 사용하였다. 37℃에서 3시간 반응시킨 후 그 결과는 Fig. 3A에 나타난바와같으며 B. licheniformis SC082의 현저한 혈전분해능을 관찰할 수 있었다. 이 결과에 의하면 균주의 혈전분해효소는 세포 외로 분비되는 exotype 효소임을 알 수 있다.
- subtilis BB-1 가 알려져 있는데 이 균주의 혈전용해동위효소 분자량은 각각 19, 25, 30, 45, 60 kDa으로 조사되 었다[24]. 5종류의 혈전분해효소 isozyme을 가지고 있는 이 균주는 37℃, pH 7.0에서 6시간 반응으로 plasmin 보다 4배나 높은혈전분해능을 나타내었는데, 이와 같이 매우 높은 혈전분해능은 다수의 혈전용해동위효소에 의한 것임을 본 실험의 결과와함께 증명 되고 있다.
- 0 kDa이 었다. B. lichmiformis SC082 균주가 생성하는 혈전분해효소는 pH 9.0 그리고 50℃까지 안정하게 유지되었고, 이와 더불어, chitinase 활성은 pH 5, 45℃일 때 높게 나타났다. B.
- 0 그리고 50℃까지 안정하게 유지되었고, 이와 더불어, chitinase 활성은 pH 5, 45℃일 때 높게 나타났다. B. lichmiformis SC082 균주의 DPPH 전자공여능법에 의한 항산화력은 농도의 증가에 따라 상승되 었는데 20 의 균상등액에 대한 항산화력은 약 31%으로 나타났다.
- 0%를 첨가하여 37℃, 200 rpm, 24시간동안 진탕 배 양한 다음 chitinase 활성을 측정하였다. Fig. 3D에 나타난 바와 같이 이 균주의 chitin 분해능은균주 배양 시 첨가되는 chitin의 농도에 따라 변화됨을 관찰할수 있었는데, 1%의 chitin 농도에서 균주의 chitin 분해능이높았음을 볼 수 있었다. 이러한 결과는 Serratiae 경우 0.
- 4A에 보이고 있다. Plasmin 1 unit에 대한 혈전 분해 활성을 100%로 하였을 때 그 비교실험을 실시한 결과 25~ 50℃ 범위에서 높은 혈전분해능을 나타냈다. 특히, 체온과 유사한 온도인 35℃에서 3시간 반응 후 혈전분해능을 400%로 확인되고 있는데 이는 plasmin보다 4배나 높은 활성을 의미한다.
- 또한 지질 분해능은 없었고 약한 skim milk 분해력을 가지고 있었다. SDS-PAGE와 zymogram 분석 결과, 이 균은 혈전분해효소 isozyme과 chitinase isozyme을 생성하는 균주로 확인되었다. 그 대략적 인 분자량은 각각 22.
- lichenifomis SC082 균주로부터 생성된 chitinase가 pH의 변화에 다소 안정적임을 시사하고 있다. pH 5.0과 6.0에서는 chitin 분해 활성이 90% 이상 유지되고 있는 것으로 보아 이 균주에 따른 chitinase의최적 pH가 약산성임을 알 수 있었다.
- 1). 따라서 이 균주를 B. licheniformis SC082로 명명하였다.
- 따라서, B. lichmifomiis SC082 균주로부터 생성된 혈전 분해효소는 온도와 pH의 변화에 안정적으로 기능할 수 있음이 증명되 었다.
- 특히, 체온과 유사한 온도인 35℃에서 3시간 반응 후 혈전분해능을 400%로 확인되고 있는데 이는 plasmin보다 4배나 높은 활성을 의미한다. 또한, 혈전분해효소의 활성은 50℃, 3시간 반응에서도 plasmin보다 안정적 일 뿐만 아니라 6배나 높게 나타났다. 이러한 결과로 이 효소는 열에 매우 안정적으로 기능하고 있음을 추정할 수 있다.
- licheniformis SC082 균주를 DPPH 법에 따라 균주를 배양한 직후 항산화력을 측정하였다. 배양 상등액에 대한 DPPH 라디칼 소거 활성을 농도별로 측정한 결과 Fig. 7에 나타난바와 같이 농도가 증가할수록 그 항산화력이 증가함을 관찰할 수 있었다. 즉, 배양상등액의 농도는 Bradford법에 의한 단백질 측정으로 이루어졌으며 10 μg의농도에서는 약 22%의 전자소거능(EDA)을 나타낸 반면 두배농도의 균 상등액에서는 EDA가 약 31%로 증가하였다.
- 0에서 65%의 효소활성을 나타냈다. 이 결과는 B. lichenifomis SC082 균주로부터 생성된 chitinase가 pH의 변화에 다소 안정적임을 시사하고 있다. pH 5.
- licheniformis SC082의 현저한 혈전분해능을 관찰할 수 있었다. 이 결과에 의하면 균주의 혈전분해효소는 세포 외로 분비되는 exotype 효소임을 알 수 있다. 보고된 혈전 분해효소 활성을 가진 균주들은 대부분이 전통발효식품으로부터 분리 된 Bacillus 속 균주로써 본 연구에서 분리 된 B.
- H- chfomis와 가장 유사한 균주임을 확인하였다. 이 균주를 B. lichenifomis SC082로 명 명하였고, 최적 생육조건은 37℃, pH 7.0, 염 농도 6%로 확인되었다. 이 균주의 기질특이성을 조사한 결과, 우수한 혈전분해력을 나타냈으며 1% 농도의 colloidal chitin의 첨가에 의하여 chitinase 활성이 증가됨을 관찰할 수 있었다.
- 0, 염 농도 6%로 확인되었다. 이 균주의 기질특이성을 조사한 결과, 우수한 혈전분해력을 나타냈으며 1% 농도의 colloidal chitin의 첨가에 의하여 chitinase 활성이 증가됨을 관찰할 수 있었다. 또한 지질 분해능은 없었고 약한 skim milk 분해력을 가지고 있었다.
- 전통발효식품인 새우젓으로부터 혈전과 chitin 분해력이 우수한 균을 분리하였으며 16S rRNA 염기서열 분석으로 B. H- chfomis와 가장 유사한 균주임을 확인하였다. 이 균주를 B.
- 7에 나타난바와 같이 농도가 증가할수록 그 항산화력이 증가함을 관찰할 수 있었다. 즉, 배양상등액의 농도는 Bradford법에 의한 단백질 측정으로 이루어졌으며 10 μg의농도에서는 약 22%의 전자소거능(EDA)을 나타낸 반면 두배농도의 균 상등액에서는 EDA가 약 31%로 증가하였다.
- 0 범위에서 혈전분해효소 plasmin 보다 3배 이상의 높은 활성을 나타내고 있다. 특히, pH 9.0에서 3시간의 반응에서도 400%의 혈전분해능을확인 할 수 있었는데, 이는 plasmin보다 4배나 높은 활성을나타내는 것으로 혈전분해효소가 염기성에서도 매우 안정적임 을 증명하고 있다. 이는 B.
- 그 중에서 혈전용해제로 알려져 있는 plasmin과 비교하여 그보다 높은 활성을 나타냄과 동시에 높은 chitin 분해능을 나타내는 9번 균주를 2차로 선별하여 SC082라 명명하였다. 혈전과 chitin 분해능이 우수한 SC082의 동정을 위해서 16s rRNA sequence를 의뢰하여 분석한 결과 그 유전자의 상동성 이 Bacillus Echenifors와 높은 유사성을 가지는 것으로 나타났다(Fig. 1). 따라서 이 균주를 B.
후속연구
- 이 결과에 의하면 균주의 혈전분해효소는 세포 외로 분비되는 exotype 효소임을 알 수 있다. 보고된 혈전 분해효소 활성을 가진 균주들은 대부분이 전통발효식품으로부터 분리 된 Bacillus 속 균주로써 본 연구에서 분리 된 B. liclieiiiformis SC082의 우수한 혈전분해효소가 기대된다[30, 33]. 이 균주 의기 질특이성은 tributyrin, skim milk를 이용하여 그 분해능을 조사함으로써 분석 되 었는데 tributyrin plate에서 분해 현상은 관찰되지 않았다(Fig.
- 특히, 발효식품에서 항산화에 관여하는 균주를 분리하고자 하였는데 Bacillus 속과 같은 프로바이오틱 생균이 항산화력을 나타낸다고 보고되어 왔다[4, 7, 14]. 이것은 본 연구결과와 일치하는 것으로 B. lichenifomis SC082에 대한 앞으로의 연구를 기대하고있다.
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