미생물 셀룰로오스 생산을 위한 당밀의 전처리 및 생산된 셀룰로오스의 물리화학적 특성 Pretreatment of Cane Molasses for Production of Bacterial Cellulose and Its Physico-Chemical Properties원문보기
BC 합성능이 우수하며, 진탕배양에서도 BC를 생산할 수 있는 능력이 있음이 확인된 Aectobacter sp. V6로부터 BC 생산을 위한 당밀전처리 조건을 검토하였으며, 생산된 BC의 물리화학적 특성을 검토하였다. 당밀을 배지성분으로 사용하기 위해 전처리를 실시한 결과, 1%의 TP가 BC 생산에 가장 효율적이었다. 전처리한 당밀배지를 이용하여 정치 및 진탕배양에서 생산된 BC의 물리화학적 특성을 조사한 결과, 모든 BC는 유화능이 있었으나 유화 안정능은 낮았다. 또한 모든 BC에서 높은 수분 보유능이 나타났으며, 특히 정치배양에서 생산된 BC는 $\alpha$-cellulose보다 14배 이상 높았다. BC의 점도는 모두 $\alpha$-cellulose보다 높았으며, 점도계 회전속도의 증가에 따라 급격히 감소하였다. FT-IR을 통한 조성 분석에서 BC는 식물성 셀룰로 오스와 차이가 없었으며, XRD를 통한 결정성 분석에서는 모든 BC가 결정성을 나타내었다. BC의 미세구조를 조사한 결과, 모든 BC가 미세망상구조로 이루어져 있었는데, 이로 인해 BC는 식물성 셀룰로오스와는 달리 독특한 물성을 가지는 것으로 판단되었다. 또한 정치배양에서 생산된 BC는 진탕배양에서 생산된 것보다 셀룰로오스 미세섬유가 조밀하게 얽혀있음을 알 수 있었다.
BC 합성능이 우수하며, 진탕배양에서도 BC를 생산할 수 있는 능력이 있음이 확인된 Aectobacter sp. V6로부터 BC 생산을 위한 당밀 전처리 조건을 검토하였으며, 생산된 BC의 물리화학적 특성을 검토하였다. 당밀을 배지성분으로 사용하기 위해 전처리를 실시한 결과, 1%의 TP가 BC 생산에 가장 효율적이었다. 전처리한 당밀배지를 이용하여 정치 및 진탕배양에서 생산된 BC의 물리화학적 특성을 조사한 결과, 모든 BC는 유화능이 있었으나 유화 안정능은 낮았다. 또한 모든 BC에서 높은 수분 보유능이 나타났으며, 특히 정치배양에서 생산된 BC는 $\alpha$-cellulose보다 14배 이상 높았다. BC의 점도는 모두 $\alpha$-cellulose보다 높았으며, 점도계 회전속도의 증가에 따라 급격히 감소하였다. FT-IR을 통한 조성 분석에서 BC는 식물성 셀룰로 오스와 차이가 없었으며, XRD를 통한 결정성 분석에서는 모든 BC가 결정성을 나타내었다. BC의 미세구조를 조사한 결과, 모든 BC가 미세망상구조로 이루어져 있었는데, 이로 인해 BC는 식물성 셀룰로오스와는 달리 독특한 물성을 가지는 것으로 판단되었다. 또한 정치배양에서 생산된 BC는 진탕배양에서 생산된 것보다 셀룰로오스 미세섬유가 조밀하게 얽혀있음을 알 수 있었다.
The aim of this study is to investigate cane molasses pretreatments for the production of cellulose by Acetobacter sp. V6, which has excellent bacterial cellulose (BC) producing capacity in the shaking culture. Among pretreatments of cane molasses, 1% (w/v) tricalcium phosphate (TP) treatment was mo...
The aim of this study is to investigate cane molasses pretreatments for the production of cellulose by Acetobacter sp. V6, which has excellent bacterial cellulose (BC) producing capacity in the shaking culture. Among pretreatments of cane molasses, 1% (w/v) tricalcium phosphate (TP) treatment was more efficient in BC production. The physico-chemical properties of BCs that were produced in static and shaking cultures were also investigated. Although BC had an emulsifying ability, its emulsion stability was low. Water holding capacity (WHC) of BC was high; the WHC of BC produced in static culture was 14 times higher than that of $\alpha$-cellulose. In addition, the viscosity of BC was higher than that of $\alpha$-cellulose. Composition analysis by FT-IR showed no difference in composition between BC and plant cellulose. In the crystallinity analysis by XRD, all BC samples showed crystallinity. All BC samples showed reticulated structures consisting of ultrafine cellulose fibriles. Microfibriles of cellulose from static culture were especially more compact than those of cellulose from shaking culture.
The aim of this study is to investigate cane molasses pretreatments for the production of cellulose by Acetobacter sp. V6, which has excellent bacterial cellulose (BC) producing capacity in the shaking culture. Among pretreatments of cane molasses, 1% (w/v) tricalcium phosphate (TP) treatment was more efficient in BC production. The physico-chemical properties of BCs that were produced in static and shaking cultures were also investigated. Although BC had an emulsifying ability, its emulsion stability was low. Water holding capacity (WHC) of BC was high; the WHC of BC produced in static culture was 14 times higher than that of $\alpha$-cellulose. In addition, the viscosity of BC was higher than that of $\alpha$-cellulose. Composition analysis by FT-IR showed no difference in composition between BC and plant cellulose. In the crystallinity analysis by XRD, all BC samples showed crystallinity. All BC samples showed reticulated structures consisting of ultrafine cellulose fibriles. Microfibriles of cellulose from static culture were especially more compact than those of cellulose from shaking culture.
TP를 1%와 2%가 되게 처리한 경우, BC 생산량이 가장 많았다. 경제성을 고려한 당밀 용액의 전처리로 1%의 TP 처리방법을 선택하였다. 한편 Roukas [33]는 황산으로 전처리 했을 경우, 가장 우수한 효과를 나타내 었다고 보고하여 본 균주와 상이한 결과를 나타내었다.
, USA)를 이용하여 400-4000 cm-1에서 스펙트럼을 조사하였다. 또한 X-ray diffractometer (Rigaku JU, Rigaku Corp., Japan)를이용하여 40 kV, 30 mA에서 Cu Ka-i radiation에 의한 반사식 측정법으로 결정화도를 조사하였다. Crystallinity (Cr.
51 g/1의 BC가 생성되었으므로 적당한 전처리를 실시할 경우, BC 생산능을 감소시키는 불순물등이 제거될 수 있음을 알 수 있었다. 상기 결과에 의거하여 당밀 전처리법으로 TP 처리를 선정한 후, TP의 농도를 각각 1-4%로 조절하여 30℃에서 7일간 배양한 결과는 Fig. 1에서보는 바와 같았다. TP를 1%와 2%가 되게 처리한 경우, BC 생산량이 가장 많았다.
상기에서 조제한 당밀 기본용액에 활성탄을 1%, A12O3를 5%가 되도록 각각 첨가하여 50℃에서 2시간 동안 교반한 후, 여과(Whatman No. 1)하였다. 당밀의 색도가 없어질 때까지 이 과정을 4~5회 반복하였으며, 마지막으로 여과한 상등액의 pH를 HC1 을 이용하여 6.
상기에서 조제한 당밀 기본용액을 121℃에서 20분간 고압멸균하였다. 실온에서 24시간 동안 교반한 후, 17, 418x g에서 30분 동안 원심분리하여 상등액을 회수하였으며, 이 상등액의 pH를 HC1 을 이용하여 6.
상기에서 조제한 당밀 기본용액을 HC1 을 이용하여 pH 6.5 로 조정하고 100℃에서 15분 동안 가열한 후, PF를 0.5%, EDTA를 0.5%가 되도록 각각 첨가하여 다시 100℃에서 15분간 가열하였다. 실온에서 24시간 동안 교반한 후, 17, 418x g에서 30분 동안 원심분리하여 상등액을 회수하였으며, 이 상등액의 pH를 6.
5% glutaraldehyde 용액에 담구어 실온에서 2시간 동안 방치한 후, phosphate buffered saline으로 세척하였다. 시료를 건조시 킨 후, ion coating (gold coating)을 실시하여 주사전자현미경 (JEOL JSM-6390, JEOL TECHNIC LTD., Japan)으로 미세구조를 관찰하였다.
동결건조시킨 셀룰로오스 시료 1 g을 미리 무게를 측정한 원심분리관에 첨가한 후, 적량의 증류수를 첨가하여 수분이 완전히 흡수될 수 있도록 일정시간 방치하였다. 이것을 8, 320x g에서 10분간 원심분리하여 수분을 제거한 후, 시료가 들어있는 원심분리관의 무게를 측정하였다. 수분 보유력은 다음의 식으로 구하였다.
5 N NaOH 용액에 담구어 90℃에서 2시간 동안 처리함으로써 세포를 용해시켰다. 이들을 중성이 될 때까지 증류수로 세척한 후, 105℃에서 항량이 될 때까지 건조하여 건조중량을 측정하였다. 당밀 속의 총당 함량은 페놀-황산법 [5]으로 측정하였으며, 표준곡선은 glucose를 사용하여 작성하였다.
이 세포현탁액 5% (v/v)를 기본배지에 접종하여 30℃, 200 rpm에서 7일간 진탕배양하였다. 일부 물리화학적 특성 비교를 위한 대조구로서 30℃에서 7일간 정치배양하여 생성된 BC를 사용하였다.
한편, 정치배양에서 생산된 BC는 진탕배양에서 생산된 BC보다 셀룰로오스 미세섬유가 조밀하게 얽혀있는 상태였다. 진탕배양에서는 강한 전단력이 생기는 반면, 정치배양에서는 전단력이 없이 기-액 계면에 BC가 생산되기 때문에 미세망상구조가 상호 중첩되어 조밀한 형태로 생산된 것으로 판단되었으며, 이로 인해 앞서 조사한 수분 보유력 및 점도에서 정치배양에서 생산된 BO] 진탕배양에서 생산된 BC보다 높은 결과를 나타내었음을 알 화학적 특성을 검토하였다. 당밀을 배지성분으로 사용하기 위해 전처리를 실시한 결과, 1%의 TP가 BC 생산에 가장 효율적이었다.
전배양은 50 ml의 Hestrin & Schramm (HS) 배지가 함유된 250-ml 용량의 conical flask에 평판한천배지에서 보존중인 균주 한 백금이를 접종하여 30℃에서 72시간동안 배양하였다. 형성된 pellicle 속에 존재하는 세포를 유리시키기 위하여 10분간 강하게 진탕한 후, 멸균된 거즈로 여과하여 유리된 세포를 회수하였다[23]. 이 세포현탁액 5% (v/v)를 기본배지에 접종하여 30℃, 200 rpm에서 7일간 진탕배양하였다.
이 용액에 셀룰로오스 대비 20%의 carboxymethyl cellulose (CMC)를 첨가하여 균질화한 후, 60℃로 가온하고 다시 30℃ 로 냉각하여 시료로 사용하였다. 회전점도계 (Brookfield LVDV-II+, Brookfield Eng. Labs Inc., USA)를 사용하여 spindle No. 1 으로 점도계의 회전속도에 따라 셀룰로오스의 점도 변화를 측정하였다. 비교시료로는 a-셀룰로오스를 사용하였다.
대상 데이터
본 실험에 사용된 당밀(cane molasses)은 유원당밀(주)에서 구입하였다. 총당 4% (w/v)로 희석한 당밀 용액을 17, 418x g에서 30분 동안 원심분리하여 상등액을 회수하였으며, 이 상등액을 전처리를 위한 기본용액으로 사용하였다.
W2는 원심분리관과 침전물의 무게(g)이다. 비교 시료로는 a-셀룰로오스를 사용하였다.
W2는 원심분리관과 침전물의 무게(g)이다. 비교 시료로는 a-셀룰로오스를 사용하였다.
이론/모형
BC의 정제는 Embuscado 등[8]의 방법에 따라 실시하였다. 즉 배양액으로부터 생성된 pellicle을 회수하여 물로 충분히 세척한 후, 0.
이들을 중성이 될 때까지 증류수로 세척한 후, 105℃에서 항량이 될 때까지 건조하여 건조중량을 측정하였다. 당밀 속의 총당 함량은 페놀-황산법 [5]으로 측정하였으며, 표준곡선은 glucose를 사용하여 작성하였다.
수분 보유력 (water holding capacity; WHC)은 American Association of Cereal Chemists (AACC) 방법 [1]을 사용하여측정하였다. 동결건조시킨 셀룰로오스 시료 1 g을 미리 무게를 측정한 원심분리관에 첨가한 후, 적량의 증류수를 첨가하여 수분이 완전히 흡수될 수 있도록 일정시간 방치하였다.
유화 안정성 (emulsion stability index)은 Hiroshi 등 [16] 의 방법을 이용하여 측정하였다. 습윤 셀룰로오스 시료 10 g을 100 ml 증류수에 넣어 homogenizer로 균질화하였다.
성능/효과
FT-IR을 통한 조성 분석에서 BC는 식물성 셀룰로오스와 차이가 없었으며, XRD를 통한 결정성 분석에서는 모든 BC가 결정성을 나타내었다. BC의 미세구조를 조사한 결과, 모든 BC가 미세망상구조로 이루어져 있었는데, 이로 인해 BC 는 식물성 셀룰로오스와는 달리 독특한 물성을 가지는 것으로 판단되었다. 또한 정치배양에서 생산된 BC는 진탕 배양에서 생산된 것보다 셀룰로오스 미세섬유가 조밀하게 얽혀 있음을 알 수 있었다.
BC의 점도는 모두 a-cellu- lose보다 높았으며, 점도계 회전속도의 증가에 따라 급격히 감소하였다. FT-IR을 통한 조성 분석에서 BC는 식물성 셀룰로오스와 차이가 없었으며, XRD를 통한 결정성 분석에서는 모든 BC가 결정성을 나타내었다. BC의 미세구조를 조사한 결과, 모든 BC가 미세망상구조로 이루어져 있었는데, 이로 인해 BC 는 식물성 셀룰로오스와는 달리 독특한 물성을 가지는 것으로 판단되었다.
각 배양 조건에서 획득한 모든 BC는 식물성 셀룰로오스에서 나타나는 진동흡수대와 동일하였으므로 조성의 차이가없는 것으로 판단되었다.
각 배양조건별 BC 분산액의 점도는모두 a-cellulose보다 높았으며(50 rpm의 경우/ 정치배양은 22.2 mPa - S, 진탕배 양은 20.2 mPa - S, a-cellulose는 8.9 mPa.S), 점도계 회전속도의 증가에 따라 급격히 감소하였다. 진탕배양보다 정치배양에서 생산된 BC의 점도가 더 높게 나타났으나 그 차이는 미미하였다.
각 배양조건에서 생산된 BC 모두 미세망상구조로 이루어져 있었으며, 그 속에 세포가 포획되어 있는 것을 볼 수 있었다. 따라서 BC는 식물성 셀룰로오스(평형구조)와 구조적으로 다르며, 이러한 미세망상구조로 인하여 BC가 식물성 셀룰로오스에서 볼 수 없는 독특한 물성을 나타내는 것으로 판단되었다.
진탕배양에서는 강한 전단력이 생기는 반면, 정치배양에서는 전단력이 없이 기-액 계면에 BC가 생산되기 때문에 미세망상구조가 상호 중첩되어 조밀한 형태로 생산된 것으로 판단되었으며, 이로 인해 앞서 조사한 수분 보유력 및 점도에서 정치배양에서 생산된 BO] 진탕배양에서 생산된 BC보다 높은 결과를 나타내었음을 알 화학적 특성을 검토하였다. 당밀을 배지성분으로 사용하기 위해 전처리를 실시한 결과, 1%의 TP가 BC 생산에 가장 효율적이었다. 전처리한 당밀배지를 이용하여 정치 및 진탕 배양에서 생산된 BC의 물리화학적 특성을 조사한 결과, 모든 BC는 유화 능이 있었으나 유화 안정능은 낮았다.
있는 것을 볼 수 있었다. 따라서 BC는 식물성 셀룰로오스(평형구조)와 구조적으로 다르며, 이러한 미세망상구조로 인하여 BC가 식물성 셀룰로오스에서 볼 수 없는 독특한 물성을 나타내는 것으로 판단되었다. 한편, 정치배양에서 생산된 BC는 진탕배양에서 생산된 BC보다 셀룰로오스 미세섬유가 조밀하게 얽혀있는 상태였다.
2C)에는 약 50% 정도가 분리되었다. 따라서 정치 및 진탕배양에서 획득한 BC는 모두 유화능이 있으나 유화 안정성은 낮은 것으로 판단되었다.
전처리한 당밀배지를 이용하여 정치 및 진탕 배양에서 생산된 BC의 물리화학적 특성을 조사한 결과, 모든 BC는 유화 능이 있었으나 유화 안정능은 낮았다. 또한 모든 BC에서 높은 수분 보유능이 나타났으며, 특히 정치배양에서 생산된 BC는 ot-cellulose보다 14배 이상 높았다. BC의 점도는 모두 a-cellu- lose보다 높았으며, 점도계 회전속도의 증가에 따라 급격히 감소하였다.
29 g/1의 BC가 생성되었으므로 당밀이 BC 생산에 충분히 이용될 수 있음을 알 수 있었다(data not shown). 또한 전처리를 하지 않은 배지에서 1.51 g/1의 BC가 생성되었으므로 적당한 전처리를 실시할 경우, BC 생산능을 감소시키는 불순물등이 제거될 수 있음을 알 수 있었다. 상기 결과에 의거하여 당밀 전처리법으로 TP 처리를 선정한 후, TP의 농도를 각각 1-4%로 조절하여 30℃에서 7일간 배양한 결과는 Fig.
BC의 미세구조를 조사한 결과, 모든 BC가 미세망상구조로 이루어져 있었는데, 이로 인해 BC 는 식물성 셀룰로오스와는 달리 독특한 물성을 가지는 것으로 판단되었다. 또한 정치배양에서 생산된 BC는 진탕 배양에서 생산된 것보다 셀룰로오스 미세섬유가 조밀하게 얽혀 있음을 알 수 있었다.
V6이 었다[22]. 이 균주는 BC 생산능이 우수하며, 진탕배양에서도 BC를 생산할 수 있음이 이미 확인되었다. 전배양은 50 ml의 Hestrin & Schramm (HS) 배지가 함유된 250-ml 용량의 conical flask에 평판한천배지에서 보존중인 균주 한 백금이를 접종하여 30℃에서 72시간동안 배양하였다.
당밀을 배지성분으로 사용하기 위해 전처리를 실시한 결과, 1%의 TP가 BC 생산에 가장 효율적이었다. 전처리한 당밀배지를 이용하여 정치 및 진탕 배양에서 생산된 BC의 물리화학적 특성을 조사한 결과, 모든 BC는 유화 능이 있었으나 유화 안정능은 낮았다. 또한 모든 BC에서 높은 수분 보유능이 나타났으며, 특히 정치배양에서 생산된 BC는 ot-cellulose보다 14배 이상 높았다.
6°에서 (002)면의 회절 peak가 나타난다[17]. 전처리한 당밀배지에서 획득한 BC의 XRD를 측정한 결과, 전형적 인 cellulose I 임을 보여주었다(Fig. 6).
8 g H2O/g BC)보다 높은 수분보유력을 나타내었다. 특히 정치배양에서 생산된 BC가 수분보유력이 가장 높았는데, ot-cellulose보다 약 14배 이상 높은 결과를 나타내었다. 따라서 본 실험에서 생산된 BC는 식품산업, 화장용 패드 및 의료용 패드 등에 응용이 가능할 것으로 판단되었다.
활성탄, A12O3/ 열처리를 행한 당밀 용액에서도 BC 생산능이 높았으나 EDTA 처리에서는 BC 생산능이 매우 낮았으며, PF 처리에서는 BC를 생산하지 못하였다. 포도당이 첨가된 기본배지에서 1.29 g/1의 BC가 생성되었으므로 당밀이 BC 생산에 충분히 이용될 수 있음을 알 수 있었다(data not shown). 또한 전처리를 하지 않은 배지에서 1.
09 g/1 로 가장 높은 BC 생산능을 나타내었다. 활성탄, A12O3/ 열처리를 행한 당밀 용액에서도 BC 생산능이 높았으나 EDTA 처리에서는 BC 생산능이 매우 낮았으며, PF 처리에서는 BC를 생산하지 못하였다. 포도당이 첨가된 기본배지에서 1.
황산, TP, 열-황산처리를 행한 당밀용액에서 BC 생산능이 높게 나타났으며, 특히 1% TP 처리에서 2.09 g/1 로 가장 높은 BC 생산능을 나타내었다. 활성탄, A12O3/ 열처리를 행한 당밀 용액에서도 BC 생산능이 높았으나 EDTA 처리에서는 BC 생산능이 매우 낮았으며, PF 처리에서는 BC를 생산하지 못하였다.
후속연구
특히 정치배양에서 생산된 BC가 수분보유력이 가장 높았는데, ot-cellulose보다 약 14배 이상 높은 결과를 나타내었다. 따라서 본 실험에서 생산된 BC는 식품산업, 화장용 패드 및 의료용 패드 등에 응용이 가능할 것으로 판단되었다. 한편 정치배양에서 생산된 BC의 수분 보유력은 강 등의 보고보다 약 1.
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