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문제 정의
- 누에 분말의 40% 이상을 차지하는 단백질을 분해 시켜 간기능에 효능이 있는 아미노산 및 펩타이드를 얻기 위한 목적으로 동결 및 열풍건조 누에분말의 발효를 위하여 본 연구실에서 분리, 등록한 단백질 분해능이 우수한 Bacillus subtilis KACC 91157 균주[25, 26]와 와인 제조 시 폴리페놀 물질과 깊은 관련성 이 있는 유산균인 Lactobacillus hilgardii KCTC 3500균주[2]를 선택하였다. 전배양 시킨 이들 각각의 균주를 누에 분말에 1% 및 5% (v/w) 수준으로 접종한 후 37℃에서 48시간 발효시키고 60℃에서 6시간 열풍 건조시켰다.
- 단백질양이 많은 식품에 단백질 분해력이 뛰어난 Bacillus 속 미생물로 발효시킬 경우 균 생육 촉진과 동시에 식품의 세포벽이 파괴되고 미분해성 물질들의 분해가 촉진되어 가용성 추출물의 함량이 증가되는 한편, 분비 효소에 의해 단백질을 유리아미노산, oligopeptide, 저분자 단백질로 변화 시켜 처음과 다른 생리활성을 지니게 됨으로서 기능성을 향상시키려는 연구가 시도되고 있다[12]. 따라서 본 연구에서는 누에 단백질을 미생물발효에 의해 생 리활성물질로 개발하기 위한 기초 연구의 일환으로 단백질 분해능이 높은 Bacillus 및 Lactobacillus 균주로 동결건조 및 열풍건조 누에분말을 발효 시 킨 발효 누에분말과 이들 누에분말의 생 리활성작용을 비교 검토하였다.
- 펩타이드 개발이 진행되고 있다[41]. 이처럼 누에 분말에 60% 정도를 차지하는 단백질을 유용성분으로 활용할 목적으로 간 기능에 효능이 있는 아미노산 또는 펩타이드를 얻기위해 단백질 분해능이 우수한 B. subtilis 균주[26, 2기와 유산균인 L. hilgardi [2]균주로 발효시 켰다. 이들 균주로 발효시 킨 누에분말에 대한 이화학적 특성과 생리활성작용에 대하여 조사한 결과는 다음과 같다.
제안 방법
- B. subtilis 및 L. hilgardii 생육배지 에 누에분말 또는 발효누에 분말 1% (w/w) 첨가에 의해 제조된 배지에서 두 균주의 생육에 미치는 영향을 관찰하였다(Table 5).
- Tyrosinase 활성은 Masamoto 등의 실험 방법 [22]을 약간 변형하여 측정하였다. In vitro mushroom tyrosinase 활성 저해 능력을 측정하기 위하여 1.
- 5%)의 시료용액 1 ml을 혼합하여 실온에서 30분간 반응시 킨 후 528 nm에서 흡광도의 감소를 측정하였다. 대조구인 시판항산화 BHT는 0.05%로 첨가하여 상기와 동일한 방법으로 흡광도 감소를 측정하였다. DPPH를 이용한 전자공여능(electron donating ability; EDA) [4]은 시료 첨가구와 무첨가구의 흡광도차를 백분율 (%)로 표시하였다.
- 동결 및 열풍건조 누에분말을 1% (w/v) 수준으로 추출한 수용성 용액의 색도는 colorimeter (Handy colorimeter NR-3000, Nippon enshoku, Japan)를 이용하여 Hunter's value L*(명도), a* (적색도), b* (황색도) 값을 측정하였다. L* 값은 명도 (lightness)를 나타내는 값으로 "0"에 가까울수록 어두움을 "100"에 가까울수록 밝음을 나타내며, a* 값인 적색도 (redness)는 "+"로 커 질수록 붉은색 을 "-"로 갈수록 초록색 을나타내며, b* 값인 황색도 (yellowness)는 "+"로 커질수록 노란색을 "-"로 갈수록 파란색을 나타낸다.
- 동결 및 열풍건조 누에분말을 1% (w/v) 수준으로 추출한 수용액의 pH는 pH meter (Methrohm 691, Swiss)로 직접 측정하였고, 적정 산도는 시료액 10 ml에 각각 증류수 50 ml를가한 후 잘 흔들어 1% phenolphthalein 용액 4~5 방울 떨어트리고 0.1 N NaOH로 적정한 후 그 소모량을 측정하여 총 산도로 환산하였다. 추출물의 총 산도는 acetic acid 값인 0.
- 2 g에 15 ml performic acid, 6 N HC1 15 ml를 가하여, 110℃ dry oven 에서 24시간 이상동안 산 가수분해 시 켰다. 분해 된 시료를 55℃ Water bath에서 감압농축 한 후 pH 2.20 구연산dilution buffer로 25 ml에 volumetric flask에 정용하여 일정량을 아미노산 자동분석기 Biochrom 30 (Biochrom, UK)를 이용하여 분석하였다.
- 05% TEMED 였다. 시료단백질의 SDS 처리는 최종농도 2% SDS, 14.4 mM P-mercaptoethanol, 60 mM Tris-HCl buffer (pH 6.8), 25% glycerol 및 0.1% BPB 혼합액 에서 100℃로 5분간 열처리 하였다. 전기 영동은 Tris-glycine 완충액(25 mM Tris, 192 mM glycine, pH 8.
- Louis MO USA) 40 unit를 균일하게 섞 이도록 가하면서 균일한 두께의 fibrin clot를 형성시킨 후 실온에서 30분간 방치한 후 사용하였다. 시료를 증류수에 1% 농도루 용출시 킨 후 여과(Whatman No. 2)하여 fibrin plate 상에 50 [11씩 점적하여 37℃에서 3시간 동안 반응시킨 후 생성된투명환 부위의 직경을 측정하였다. 직경은 서로 수직인 두 개의 지름을 측정하였고, 투명대가 타원인 경우에는 가장 긴 지름과 가장 짧은 지름을 측정하여 투명대의 면적을 구하였다.
- 5 mA/gel (cm)의정전류를 통하여 행하고, 저온(4℃)에서 2시간 통전시켰다. 영동이 완료된 gele 7% 초산액에 용해한 1% coomassie brilliant blue R-250으로 염색한 후 7% 초산액으로 충분히 탈색시켜 건조 및 사진촬영을 하였다.
- 3) 하에서 130-150 mA/gel (cm)의 정전류를 통하여 1시간 30분간 하였다. 전기영동 후 gele 고정액(Methanol : Acetic acid : Water = 10:10:80)에 1% coomassie brilliant blue R-250을 첨가하고 10 시간 염색한 후 탈색 액 (Methanol : Acetic acid : Water = 10:10:80)으로 충분히 탈색시켜 건조 및 사진촬영을 하였다.
- 관련성 이 있는 유산균인 Lactobacillus hilgardii KCTC 3500균주[2]를 선택하였다. 전배양 시킨 이들 각각의 균주를 누에 분말에 1% 및 5% (v/w) 수준으로 접종한 후 37℃에서 48시간 발효시키고 60℃에서 6시간 열풍 건조시켰다.
- 5 %를 사용하였다. 즉 분리 gele 30% acrylamide, 0.8% bis-acrylamide, 1.5 M Tris-HCl buffer (pH 8.8), 0.05% TEMED 및 10% 과산화암모늄을 혼합하여 1 mm 두께로 만들어 사용하였다. 분리 gel위에는 5% 농축 gel [30% acrylamide, 0.
- 함량은 AOAC분석 방법[1]에 준하여 측정하였다. 즉, 이들시료 분말 1 g씩을 각 550℃ 회화로에서 3시간 회화 시 킨 후 6 N HC1 에 용해시 켜 완전히 산분해 시 켜 수욕상에서 산을완전히 제거하고, 이 건고물에 3 N HC1 를 가하여 Whatman No. 4 여과지로 1차 여과하고 0.2㎛ 필터로 여과시켜 원소종류에 따라 각각 일정비율로 희석한 후 원자흡광 분광광도계(AAnalyst 300, Perkin Elmer, Norwalk CT, USA)를 이용하여측정하였다.
- 추출된 지질 용액에 methanol : HC1 (5:1, v/v%) 용액을 가하여 65℃에서 3시간 methylation 한 후 hexane으로 지 방산 methylester를 추출하였다. 지방산 분석은 Omega-Wax capillary column (30 m x 0.25㎛, Supelco, USA) 을 사용하여 Gas chromatography (GC-17A, Shimadsu, Koyto, Japan)로 분석하였다. 캐리어 가스는 헬륨을 사용하였고 injection 온도는 250℃, oven 온도는 180℃ 및 detection 온도는 260℃로 하였다.
- 2)하여 fibrin plate 상에 50 [11씩 점적하여 37℃에서 3시간 동안 반응시킨 후 생성된투명환 부위의 직경을 측정하였다. 직경은 서로 수직인 두 개의 지름을 측정하였고, 투명대가 타원인 경우에는 가장 긴 지름과 가장 짧은 지름을 측정하여 투명대의 면적을 구하였다. 이때 대조구는 플라즈민을 시료와 동일한 농도로 용해시켜사용하였다.
- 혈전용해 효소 활성은 fibrin plate 법[이을 변형하여 lysed zone으로 측정하였다. Fibrin plate는 0.
대상 데이터
- 누에분말은 2009년도 4월 동결 및 열풍건조 된 분말을 순천 영농법인(순천, 전남)에서 구입하였다. 외관상 동결건조 누에 분말은 약간의 푸른빛 이 났으며, 열풍건조 누에분말은 약간의 옅은 갈색을 나타내어 두 시료 간에 색상에서 차이가 났고, 기호적인 조사에서도 관능상의 차이가 다소 있었다.
- 05 ml를넣은 후 25℃에서 2분간 반응시키면서 475 nm 흡광도를 측정하여 계산하였다. 대조구는 시료가 들어있지 않는 시료 용해용액을 사용하였고, 양성대조구는 tyrosinase 저해제로 알려진 0.5 M kojic acid를 사용하였다. 이때 tyrosinase 활성 저해율(%)은 다음의 공식에 의하여 산출하였다.
- 분리 gel의 조성은 10% acrylamide, 1.5 M Tris-HCl buffer (pH 8.8), 0.4% SDS (Sodium dodecyl sulfate), 10% 과산화 암모늄 및 0.05% TEMED로 만들어 사용하였다. 농축 gel 의 조성은 5% acrylamide, 0.
- 25㎛, Supelco, USA) 을 사용하여 Gas chromatography (GC-17A, Shimadsu, Koyto, Japan)로 분석하였다. 캐리어 가스는 헬륨을 사용하였고 injection 온도는 250℃, oven 온도는 180℃ 및 detection 온도는 260℃로 하였다. 지방산 분석 결과는 각 지방산 표준물질과 동일한 retention time에 검출된 것으로 하였으며, 이때 검출된 총 지방산의 면적에 대한 각 지방산의 면적 비율(%)로 나타내었다.
데이터처리
- 실험으로부터 얻어진 결과치는 one-way ANOVA 검정에 의한 평균치와 표준오차(mean±SE)로 표시하였으며, 각 실험군 간의 유의성 검증은 Duncan's multiple range test로 하였다.
- 캐리어 가스는 헬륨을 사용하였고 injection 온도는 250℃, oven 온도는 180℃ 및 detection 온도는 260℃로 하였다. 지방산 분석 결과는 각 지방산 표준물질과 동일한 retention time에 검출된 것으로 하였으며, 이때 검출된 총 지방산의 면적에 대한 각 지방산의 면적 비율(%)로 나타내었다.
이론/모형
- Native-PAGE는 Davis 방법 [이에 따라 slab-type polyacrylamide gel을 사용하였다. Gel의 농도는 7.
- SDS-polyacrylamide gele Weber 및 Osborn 방법 [38] 에 준하였다. 분리 gel의 조성은 10% acrylamide, 1.
- 동결 및 열풍건조 누에분말 및 이들 발효 누에분말의 미네랄 함량은 AOAC분석 방법[1]에 준하여 측정하였다. 즉, 이들시료 분말 1 g씩을 각 550℃ 회화로에서 3시간 회화 시 킨 후 6 N HC1 에 용해시 켜 완전히 산분해 시 켜 수욕상에서 산을완전히 제거하고, 이 건고물에 3 N HC1 를 가하여 Whatman No.
- 동결 및 열풍건조누에 분말의 지방산 분석은 Garces 및 Mancha 방법으로 행하였다[11]. 즉, 동결 및 열풍건조누에 분말 1 g에 15 ml chloroform 및 7.
성능/효과
- L. hilgardii 발효에 의한 두 시료간에는 큰 차이가 없었지만 B. subtilis 발효에 의해서는 동결건조 누에분말이 열풍건조 누에분말보다 단백질 함량이 더 높게 나타났다. 또한 B.
- 연관성이 매우 높은。[11斗<법[4, 2이으로 동결 및 열풍 건조 누에분말 수용성 추출물(0.5%)의 항산화 활성을 측정한 결과 동결 및 열풍건조 누에분말 수용성 추출물(0.5%)에 의한 DPPH free-radical scavenging activity를 측정한 결과 대조 구로 사용한 시 판 항산화제 인 BHT 0.05% 처 리구에서 가장 높은 항산화 활성을 나타내었다(Fig. 7).
- 국내에서 미백 화장품 원료로 사용되고 있는 한방생약제에 관한 문헌을 근거로 한 티로시나제 활성 저해효과는 메탄올 추출물인 진피 100%, 갈근 25%, 맥문동 0%, 후박 3%, 에탄올 추출물인 창출 14%, 갈근 10% 및 수용성 추출물인 함초 42%, 상백피 63%, 감초 13-52%, 작약 44%, 당귀 39%, 천궁 28%, 복령 5%4%로 비교적 낮은 저해 활성을 나타내고 있다. [13], 본 실험 에서는 대조구로 사용한 kojic acid 500 [1M에서 60%의 저해효과를 나타낸 반면 동결누에 물 추출물 44% 및 메탄올 추출물 21%와 열풍누에 물 추출물 19% 및 메탄올 추출물 30%로 나타났다(Fig. 8).
- 20135 유래의 terrein이나 효모 배양액 추출물인 melanoston 등이있다[5, 22]. 국내에서 미백 화장품 원료로 사용되고 있는 한방생약제에 관한 문헌을 근거로 한 티로시나제 활성 저해효과는 메탄올 추출물인 진피 100%, 갈근 25%, 맥문동 0%, 후박 3%, 에탄올 추출물인 창출 14%, 갈근 10% 및 수용성 추출물인 함초 42%, 상백피 63%, 감초 13-52%, 작약 44%, 당귀 39%, 천궁 28%, 복령 5%4%로 비교적 낮은 저해 활성을 나타내고 있다. [13], 본 실험 에서는 대조구로 사용한 kojic acid 500 [1M에서 60%의 저해효과를 나타낸 반면 동결누에 물 추출물 44% 및 메탄올 추출물 21%와 열풍누에 물 추출물 19% 및 메탄올 추출물 30%로 나타났다(Fig.
- 그러나 동결건조 발효 누에 및 열풍건조 발효누에의 pH 및 총 산도는 B. subtilis 균주 발효보다는 유산균 L. hilgardii 발효에 의해 산미가 더 높은 것으로 나타났으며, 이는 유산균에 의한 산도 증가에 기 인하는 것으로 보여 진다.
- 그러나냉동건조 누에분말의 70% 메탄올 추출물에서만 12시간 반응후 점적한 용해면적 이 다소 증가한 것으로 나타났으나, 열풍건조 누에분말의 70% 메탄올 추출물에서는 전혀 활성이 없는것으로 나타나 건조방법에 따라 혈전용해 활성에 영향을 미치는 것으로 보여 진다(Fig. 5).
- 누에 단백질을 Native-PAGE로 비교분석한 결과 동결건조 누에분말은 열풍건조 누에분말보다 많은 종류의 밴드가관찰되었다(Fig. 3). Kang 등[16]은 누에 장면과 단명 품종의 유충 체액 단백질(Major hemolymph protein)을 Native-PAGE로 비교한 결과 5령 초기에 많은 종류의 밴드가 관찰되었고, 5령 일수가 증가할수록 새로운 단백질의 출현뿐만 아니라 전체적인 단백질량의 증대가 뚜렷하다고 하였다.
- 동결건조 발효누에 및 열풍건조 발효누에분말 모두 B. subtilis 균주 5% 접종에서 혈전용해 활성이 가장 높았으며, 동결건조 발효누에가 열풍건조 발효누에 보다 혈전용해 활성이더 높게 나타났다(Fig. 6).
- subtilis 발효에 의해서는 동결건조 누에분말이 열풍건조 누에분말보다 단백질 함량이 더 높게 나타났다. 또한 B. subtilis 발효에 의한 두 시료는 L. hilgardii 발효에 의한 두 시료보다 단백질 함량이 더 높게 나타났다. 누에 분말의 단백질은 55~ 65% 정도 함유될 정도로 고단백 식품이며, 누에 번데기에도 단백질 함량이 23% 정도로 함유되어 있어 오늘날 단백질 식품소재로서 활용가치가 높을 것으로 여겨진다[7].
- subtilis 균주가 발효하는 과정 중에 생육에 필요한 영 양원인 아미노산을 만들어 이용하였을 가능성이 높아 보인다. 또한 L. hilgardii 균주는 동결건조 누에분말을 1일간 발효시킨 발효누에 분말시료를 1% 수준으로 기본배지에 첨가 하였을 경우 L. hilgardii 균주가 가장잘 생육하는 것으로 나타났다. 유산균의 생육에 필요한 에너지원으로 아미노산을 이용하기도 하는데, argininee L.
- 4) 열풍 및 동결건조 발효누에의 단백질 패턴상에 큰 차이를 보여 발효되는 과정에서 단백질이 분해되는 것으로 사료되 어진다. 또한 L. hilgardii 발효와 B. subtilis 발효에 의해서도 단백질 패턴상의 차이를 보이고 있는데, 특히 단백질 분해능이 우수한 B. subtilis 발효에 의해 분자량이 작은 단백질패턴이 관찰되어 누에 단백질의 분해가 이루어졌음을 알 수 있었다. 한편, 열풍 및 동결건조 발효누에분말의 단백질 패턴상의 차이는 유산균인 L.
- 59 ppm이 함유되어 있었다. 마그네슘을 제외한 측정된 미네랄 성분들은동결건조 누에 보다는 열풍건조 누에분말에서 더 높게 나타났다(Table 3).
- 열풍 및 동결건조 누에분말 1% 추출 수용액의 pH 및 총 산도는 큰 차이가 없었다(Table 1).
- 열풍 및 동결건조 누에분말 및 두 균주에 의해 발효된 누에 분말의 지방산 조성을 분석한 결과 n-3 계열의 linolenic acid가 가장 많은 비율을 차지하였다(Table 4).
- 열풍 및 동결건조 누에분말의 두 균주에 의해 발효된 발효 누에 분말의 단백질 농도를 측정한 결과 동결건조 누에분말이 열풍건조 누에분말보다 약간 많이 함유되어 있었다(Fig. 1).
- 열풍 및 동결건조 누에분말의 미네랄 조성 비율은 칼륨이 각각 316.3 및 328.3 ppm으로 가장 많았고, 다음으로 많은 칼슘이 각각 68.0 및 73.1 ppm 이였으며, 마그네슘은 각각 58.0 및 44.3 ppm, 아연은 각각 0.76 및 4.50 ppm, 철은 각각 0.83 및 1.65 ppm, 망간은 각각 0.41 및 0.59 ppm이 함유되어 있었다. 마그네슘을 제외한 측정된 미네랄 성분들은동결건조 누에 보다는 열풍건조 누에분말에서 더 높게 나타났다(Table 3).
- 열풍건조 및 동결건조 누에분말 1% 수용액의색도 측정에서는 색도 밝기와 적색도에서 차이를 보여, 열풍건조 누에분말은 옅은 갈색을 동결건조 누에분말은 옅은 녹색을 띄었다.
- 열풍건조, 동결건조 누에분말 및 발효누에 분말의 물 추출및 70% 메탄올 추출물의 혈전용해 활성을 나타낸 결과를 보면, 동결건조 누에분말 및 열풍건조 누에분말 추출물의 경우 모두 혈전용해 활성은 없는 것으로 나타났다(Fig. 5).
- 이들 실험에서 tyrosinase 저해 활성은 동결건조 누에분말과 열풍건조누에분말의 추출 용매에 따라 활성이 다르게 나타나는 결과를 얻을 수 있었다. 이상의 실험결과에서 누에 단백질을 생리활성물질로 개발하기 위한 기초 자료를 얻기 위하여 단백질 분해능이 높은 B.
- 있었다. 이상의 실험결과에서 누에 단백질을 생리활성물질로 개발하기 위한 기초 자료를 얻기 위하여 단백질 분해능이 높은 B.subtilis 균주로 발효시킨 발효 누에에서 단백질 함량 증가, 전기영동 단백질 패턴 변화, 혈전용해 활성 및 항산화 활성증가와 같은 생 리활성작용이 강화됨으로써 건강기능식품 소재 개발 가능성이 확인되었다.
- 또한, 일부 천연물 유래의 단삼 메탄올 추출물[3이 및 팥과 녹두[25] 등 일부 소재 에서도 항혈전 효능이 밝혀져 있다. 이처럼 발효식품의 주요 미생물인 Bacillus 속 균주들은 단백질 분해능뿐만 아니라 혈전용해 효소 활성도 높아 혈관계 질환 관련 건강기능식품 소재로 많이 활용되고 있는 가운데 본 실험에 사용된 B. subtilis 균주도 단백질 분해력과 혈전 용해력이 높아 누에분말을 발효시킨 시료에서 활성이 높게 나온 것으로 사료된다.
- 한편 동결건조 누에분말보다는 열풍건조 누에분말에서 항산화 활성이 높았으며, 동결건조 발효누에 및 열풍건조 발효누에의 경우 L-hilgardii 균주에 의한 발효누에가 B. subtilis 균주에 의한 발효 누에보다 항산화 활성이 약간 더 높은 것으로 관찰되었다. 이러한 결과에서 보듯 항산화 활성은 냉동건조 누에분말 보다는 열풍건조 누에분말에서 더 높게 나올 수 있는 것은 건조과정 중에 열에 의한 성분의 변화에 기인할 가능성이 높아 보인다.
- subtilis 발효에 의해 분자량이 작은 단백질패턴이 관찰되어 누에 단백질의 분해가 이루어졌음을 알 수 있었다. 한편, 열풍 및 동결건조 발효누에분말의 단백질 패턴상의 차이는 유산균인 L. hilgardii 발효에 의해서는 큰 차이를 찾아보기 힘들었지만 B. subtilis 발효에 의해서는 단백질 패턴과 양적인 차이는 뚜렷하게 보였다.
후속연구
- 한편, 숙취해소에 널리 사용되고 있는 콩나물, 북어, 영지버섯을 시료로 한 비교실험에서는 단백질 함량이 높은 콩나물에서 간 보호 효과가 높았으며, 그 구성 아미노산 조성에서도 arginine, aspartic acid, glutamic acid가 많이 함유되어 있었다[21]. 따라서 누에 분말에 간 보호 효과가 있는 glycine, alanine, arginine, serine, aspartic acid와 같은 아미노산을 많이 함유하고 있어 간 기능개선 건강보조식품 소재로 활용가치가 있을 것으로 사료된다.
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