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문제 정의
- 공시 균주는 생육 촉진기능을 가지며 그외 식물 병원균에 대한 방제기능을 확인하기 위하여 항진균성 물질생산 능을 검토하였다. 항균성물질 생산 최적 배지를 조사하기 위해 LB배지를 기본으로 탄 소원 및 질소원에 대한 항진균성 물질의 생산을 비교하였다.
- 유용토착미생물을 수종 분리하였다. 그 중 식물성장촉진 능과 식물병원성 진균의 방제 능을 동시에 가지는 신 균주로 동정된 토양세균의 분리 및 특성을 보고하고자 한다.
- 또한 미생물의 존재 상태가 비 근권미생물의 경우 일반적으로 휴면상태, 활성이 낮은 상태로 존재하나 근권미생물은 활발히 물질대사를 수행하고 있으며 새로운 기능의 토착 유용 미생물의 분리와 이용을 목적으로 한다.
- 본 연구는 우리 농촌의 경작토양에 사용하는 발효퇴비, 화학비료, 화학농약 등의 장기사용으로 인하여 토양 중의 오염, 각종 불용성 염의 축적, 토양미생물의 생태적 변화 등으로 연작장해, 종자 발아율의 저하, 작물 수확량의 저하 등의 문제를 해결하기 위한 일환으로 고온, 건조에 내성을 가진 유용토착미생물을 수종 분리하였다. 그 중 식물성장촉진 능과 식물병원성 진균의 방제 능을 동시에 가지는 신 균주로 동정된 토양세균의 분리 및 특성을 보고하고자 한다.
제안 방법
- 1)plate 위에 Asp. //aims 포자 (1 x 108 spores/mL)를 도말한 후 상등액 20 pL씩을 분주한 paper disc (① 8 mm, Whatman Co.)를 얹고, 25 ℃ 에서 3 일간 배양하면서 생성된 clear zone의 크기로 항진균 활성을 확인하였다.
- YK-5균주의 동정은 형태학적, 배양학적, 생리학적, 화학적 및 분자계통분류 학적 분석을 통하여 수행하였으며, DNA 특정 영역인 16S rDNA 염기서열 결정에 의한 분자계통분류학적 분석으로 동정하고자 했다 16S rDNA의 염기서열 결정은 대장균 유래의 2개의 primer 9F[5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' {Escherichia coli 16S rRNA numbering)]와 1542R[5, - AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3, ; 1542-1523]을 사용하였으며 Yoon 등의 방법(14)으로 16S rDNA를 증폭시켰다. 16S rDNA 염기서열은 PRISM dye dideoxy terminator cycle sequencing kit(Perkin-Elmer, Calif, US A) 를 이용한 Applied Bio System Image (Calif, USA) 모델 377의 자동 DNA sequencer를 사용하여 16S rDNA 염기서열을 분석하였다 16S rDNA 염기서열은 NCBI (National Center for Biotechnology Information) Data library (Multiple Alignment Biochnology Information) Program(15)을 사용하여 이들이 가진 염기서열을 비교 분석하였다.
- 수행하였다. PDA 평판배지에서 충분히 생육시킨 식물 병원균 F. oxysporum KACC 4005 균주의 agar piece (0.5cm x 0.5cm)를 제조하여 PDA 평판 배지 위에 얹고 24시간 배양한 다음, 최적 배지에서 생육한 공시 균주 YK-5의 배양액 20(1L를 paper disc에 첨가한 후 7일간 배양하여 시험 균주에 대한 생육 저해를 조사하였다.
- YK-5는 항진균성 물질을 생산하였으며, 시험 균주 Asp. jlavus를 대상으로 생산조건을 검토한 결과, 공시 균주의 생육배지는 생육 촉진 효과와 식물병원균에 대한 방제를 위해 1% peptone 및 yeast extract, 5% black sugar가 함유된 modified LB 배지를 사용하였다. 식물 병원균에 대한 공시균주의 길항효과는 시 험균주인 식물 병원균 Fusarium oxysporum KACC 40052균에 대해 배양 7일째까지 강한 생육저해를 보였다.
- 이들 중 가장 우수한 기능을 가진 균을 동정하였으며, 공시 균으로 선발하였다. 공시 균주 (Bacillus subtilis YK-5)는 LB 액체배지에 접종하여 37℃, 36~48시간 전 배양한 다음 5% black sugar가 함유된 LB 액체배지에 전 배양균 1%를 접종하여 37℃에서 5일간 본 배양을 수행하였다.
- 공시 균주의 분리는 농가에서 사용하는 특수 토양 시료를 사용하여 증류수 9 mL에 각 토양 1 g을 첨가하여 1此 IO’으로 희석하여 NA (bacto peptone 0.5%, beef extract 0.3%, agar 1.5%, pH 7.2) 배지에 0.1 mL씩 도말한 후 50℃ 에서 배양하여 400여개의 단일 colony를 분리하였다 이들 분리 균주는 LB액체 (peptone 1.0%, yeast extract 0.5%, NaCl 0.5%)에 접종하여 48~72시간 배양 후 육안으로 균 생육이 우수한 균의 배양액을 이용하여 식물성장촉진능을 검토하였으며, 9개 균주가 기능이 우수한 균주로 선별되었다. 이들 중 가장 우수한 기능을 가진 균을 동정하였으며, 공시 균으로 선발하였다.
- 공시 균주의 식물성장촉진 능을 검토하기 위하여 궁중무 및 벼를 대상으로 pot 실험을 실시하였다. 공시작물을 이 식후 대조군으로 물과 시판 중인 제품 그리고 5일 동안 배양한 공시균주의 배양액으로 40일간 시비하여 비교 한 결과, Table 3에서 보는 바와 같이 궁중무의 경우 30포기를 대상으로 경엽수, 줄기의 길이 및 뿌리의 길이를 측정하여 평균한 값으로 나타내었으며 공시 균주의 처리구가 무처리구에 비해 약 60% 이상 우수한 결과를 나타내었고 기존 타사제품에 비해서는 20~30% 정도 우수한 결과를 나타내었다 특히 뿌리의 경우 이식 후 시비 12일째 궁중무 무처리구는 뿌리의 세근이 잘 끊어지고, 고루 형성되지 못한 반면(Fig.
- 공시 균주의 식물성장촉진 능을 검토하기 위한 실험작물은 궁중무 및 벼를 대상으로 pot실험을 수행하였으며, 해당 씨앗을 petri-dish에서 발아시킨 후 모종을 이식하였다. 재배방법으로는 기존의 기비 (밑 비료)는 동일하게 처리하고, 추비 (엽면시비)의 경우 10일 간격으로 3회 각 농도별로 처리하였다.
- 공시 균주의 항진균성 물질의 생산은 시판 중인 M 사 및 S 사의 제품과 비교하기 위해 대량생산 조건을 검토하였으며, LB기본배지에 다양한 탄 소원 및 질소원을 사용하여 항균성 물질의 생산 능을 검토하였다 각각의 배지에 분리 균주를 1 백금이 접종한 후, 이들을 37℃, 160 rpm에서 5일간 배양하였다. 항진균 활성을 검토하기 위하여 공시 균주의 배양액은 4℃ 에서 12,000 rpm, 10분간 원심분리 하여 상등액을 사용하였다.
- 농가에서 사용하는 특수토양 시료로부터 분리한 400여 개의 균주는 1 차적으로 LB 액체에 접종하여 48 ~72시간 배양 후 육안으로 균 생육이 우수한 균의 배양액을 이용하여 식물성장촉진 능을 검토하였으며, 9개 균주가 기능이 우수한 균주로 선발되었다. 이들 9개의 선발 균주 중 식물성장실험을 통해 식물 성장 촉진 능이 가장 우수한 기능을 가진 균 (결과 미게재) 을 본 연구의 공시 균주 (Bacillus sp.
- 질소원의 경우 유기질소 원인 peptone, yeast extract, soybean meal。] 양호하였으나, 무기질 소원은 항균성물질 생산에 영향을 미치지 못하였다(Table 2). 이들 결과로부터 공시 균의 생육배지는 생육 촉진 효과와 식물 병원균에 대한 방제 능을 위해 peptone 및 yeast extract가 각각 1% 함유된 LB배지에 탄소원으로 black sugar가 5% 함유된 modified LB배지 (MLB배지)를 공시 균주의 생육 배지로 사용하였다
- 재배방법으로는 기존의 기비 (밑 비료)는 동일하게 처리하고, 추비 (엽면시비)의 경우 10일 간격으로 3회 각 농도별로 처리하였다. 재배시험에 사용한 시료는 대조군으로 물과 시중 판매 중인 미생물 비료를 사용하였으며, 시험 군은 본 공시 균으로 5일간 배양한 배양액으로 제조한 제품을 비교 실험을 하였다.
- 재배시험에 사용한 시료는 대조군으로 물과 시중 판매 중인 미생물 비료를 사용하였으며, 시험 군은 본 공시 균으로 5일간 배양한 배양액으로 제조한 제품을 비교 실험을 하였다. 재배실험은 무처리구, 기존제품처리 구, 본 공시 균주 처리 구로 구분하여 궁중무의 경우 이식 40일 경과 시에 30개의 작물을 채취하여 경엽의 수 줄기의 길이, 뿌리의 길이 등 생육상태를 측정하여 비교하였으며, 벼의 경우 잎의 길이와 세근의 형성상태 등 뿌리의 발육상태를 비교하였다.
- 항균물질 생산에 미치는 질소원의 영향을 검토하기 위하여 질 소원을 제외한 LB 기본 배지에 유기질소원으로 asparagine, malt extract, meat extract, peptone, soybean meal, tryptone, urea, yeast extract와 무기질소원으로 NaNOj, NH4CI, NH4NO3, (NH4)2SC>4를 각각 1%로 첨가하여 배양하였다. 사용한 질소원에 대한 항진균 활성은 agar diffusion법으로 clear zone의 크기로 확인하였다.
- 항균물질 생산에 미치는 탄소 원의 영향을 알아보기 위하여 LB 기본 배지에 black sugar, dextrin, fructose, glucose, glycerol, maltose, soluble starch, sucrose를 각각 5% 첨가하여 동일조건에서 5일간 배양하였으며, 최적탄소원은 배양 상등액 중에 생산된 항진균성 물질의 생산능으로 결정하였다. 항균활성은 agar diffusion 법을 이용하여 clear zone의 크기로서 확인하였다.
- 항균성물질 생산 최적 배지를 조사하기 위해 LB배지를 기본으로 탄 소원 및 질소원에 대한 항진균성 물질의 생산을 비교하였다. Table 1에서 보는 바와 같이 시험 균으로 Asp.
대상 데이터
- 공시 균주 YK-5의 식물 병원균에 대한 방제효과는 식물 병원균 Fusarium oxysporum KACC 40052균주를 대상으로 수행하였다. PDA 평판배지에서 충분히 생육시킨 식물 병원균 F.
- 공시 균주의 식물 병원균에 대한 길항효과는 시험 균주인 식물 병원균 F. oxysporum KACC 40052 균을 대상으로 수행하였다. Fig.
- 이들 9개의 선발 균주 중 식물성장실험을 통해 식물 성장 촉진 능이 가장 우수한 기능을 가진 균 (결과 미게재) 을 본 연구의 공시 균주 (Bacillus sp. YK-5)로 선정하였다.
- 5%)에 접종하여 48~72시간 배양 후 육안으로 균 생육이 우수한 균의 배양액을 이용하여 식물성장촉진능을 검토하였으며, 9개 균주가 기능이 우수한 균주로 선별되었다. 이들 중 가장 우수한 기능을 가진 균을 동정하였으며, 공시 균으로 선발하였다. 공시 균주 (Bacillus subtilis YK-5)는 LB 액체배지에 접종하여 37℃, 36~48시간 전 배양한 다음 5% black sugar가 함유된 LB 액체배지에 전 배양균 1%를 접종하여 37℃에서 5일간 본 배양을 수행하였다.
- 재배방법으로는 기존의 기비 (밑 비료)는 동일하게 처리하고, 추비 (엽면시비)의 경우 10일 간격으로 3회 각 농도별로 처리하였다. 재배시험에 사용한 시료는 대조군으로 물과 시중 판매 중인 미생물 비료를 사용하였으며, 시험 군은 본 공시 균으로 5일간 배양한 배양액으로 제조한 제품을 비교 실험을 하였다. 재배실험은 무처리구, 기존제품처리 구, 본 공시 균주 처리 구로 구분하여 궁중무의 경우 이식 40일 경과 시에 30개의 작물을 채취하여 경엽의 수 줄기의 길이, 뿌리의 길이 등 생육상태를 측정하여 비교하였으며, 벼의 경우 잎의 길이와 세근의 형성상태 등 뿌리의 발육상태를 비교하였다.
이론/모형
- 토양에서 분리한 Bacillus sp. YK-5균주의 동정은 형태학적, 배양학적, 생리학적, 화학적 및 분자계통분류 학적 분석을 통하여 수행하였으며, DNA 특정 영역인 16S rDNA 염기서열 결정에 의한 분자계통분류학적 분석으로 동정하고자 했다 16S rDNA의 염기서열 결정은 대장균 유래의 2개의 primer 9F[5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' {Escherichia coli 16S rRNA numbering)]와 1542R[5, - AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3, ; 1542-1523]을 사용하였으며 Yoon 등의 방법(14)으로 16S rDNA를 증폭시켰다. 16S rDNA 염기서열은 PRISM dye dideoxy terminator cycle sequencing kit(Perkin-Elmer, Calif, US A) 를 이용한 Applied Bio System Image (Calif, USA) 모델 377의 자동 DNA sequencer를 사용하여 16S rDNA 염기서열을 분석하였다 16S rDNA 염기서열은 NCBI (National Center for Biotechnology Information) Data library (Multiple Alignment Biochnology Information) Program(15)을 사용하여 이들이 가진 염기서열을 비교 분석하였다.
- 배양하였다. 사용한 질소원에 대한 항진균 활성은 agar diffusion법으로 clear zone의 크기로 확인하였다.
- 항균활성은 agar diffusion 법을 이용하여 clear zone의 크기로서 확인하였다.
성능/효과
- oxysporum KACC 40052 균을 대상으로 수행하였다. Fig. 2에서 보인 바와 같이 생육시킨 시험균 plate 에 배양액을 paper disc에 20 吐를 첨가하여 계속 배양한 결과, 식물 병 방제용으로 판매되고 있는 시판제품은 시험 균주의 생육이 활발하여 길항효과가 없는 결과(Fig. 2-A)에 비해 배양 7일째까지 공시 균주는 강한 생육 저해를 보였다(Fig. 2-B).
- Table 1에서 보는 바와 같이 시험 균으로 Asp. jlavus를 대상으로 agar diffiision법을 이용하여 항진균효과를 검토한 결과, 탄소원으로는 dextrin, glucose, sucrose 에서 항균성 물질의 생산이 우수하였으며, 특히 sucrose 대신 black sugar를 사용하였을 경우 항균성 물질의 생산이 매우 우수하였다(Fig. 1, Table 1). 질소원의 경우 유기질소 원인 peptone, yeast extract, soybean meal。] 양호하였으나, 무기질 소원은 항균성물질 생산에 영향을 미치지 못하였다(Table 2).
- 공시 균주 YK-5의 colony의 형태는 주름지고 중앙이 돌출되었으며, 색깔은 엷은 갈색을 나타내었다(결과 미게재). 전자현미경으로 촬영한 결과 Bacillus 속(Fig.
- 공시균의 식물성장촉진능은 궁중무 및 벼를 대상으로 pot 실험한 결과, 궁중무의 경우 경엽수, 줄기의 길이 및 뿌리의 길이가 무처리구에 비해 약 60% 이상 우수한 성장촉진 효과를 나타내었으며, 벼의 경우 이식 후 시비 8일째 시판제품 처리구에 비해 공시 균주 처리 구는 잎의 길이와 흰 세근의 발달이 우수하여 뿌리의 발육에 현저한 생육 촉진 효과를 나타내었다. 공시 균주의 동정은 분자계통분류 학적 분석 (형태, 배양, 생리, 화학적 및 분자생태학적 측면) 에의해 B. subtilis YK-5로 명명하였다.
- 식물 병원균에 대한 공시균주의 길항효과는 시 험균주인 식물 병원균 Fusarium oxysporum KACC 40052균에 대해 배양 7일째까지 강한 생육저해를 보였다. 공시균의 식물성장촉진능은 궁중무 및 벼를 대상으로 pot 실험한 결과, 궁중무의 경우 경엽수, 줄기의 길이 및 뿌리의 길이가 무처리구에 비해 약 60% 이상 우수한 성장촉진 효과를 나타내었으며, 벼의 경우 이식 후 시비 8일째 시판제품 처리구에 비해 공시 균주 처리 구는 잎의 길이와 흰 세근의 발달이 우수하여 뿌리의 발육에 현저한 생육 촉진 효과를 나타내었다. 공시 균주의 동정은 분자계통분류 학적 분석 (형태, 배양, 생리, 화학적 및 분자생태학적 측면) 에의해 B.
- 벼를 대상으로 pot 실험을 실시하였다. 공시작물을 이 식후 대조군으로 물과 시판 중인 제품 그리고 5일 동안 배양한 공시균주의 배양액으로 40일간 시비하여 비교 한 결과, Table 3에서 보는 바와 같이 궁중무의 경우 30포기를 대상으로 경엽수, 줄기의 길이 및 뿌리의 길이를 측정하여 평균한 값으로 나타내었으며 공시 균주의 처리구가 무처리구에 비해 약 60% 이상 우수한 결과를 나타내었고 기존 타사제품에 비해서는 20~30% 정도 우수한 결과를 나타내었다 특히 뿌리의 경우 이식 후 시비 12일째 궁중무 무처리구는 뿌리의 세근이 잘 끊어지고, 고루 형성되지 못한 반면(Fig. 3-A), 공시 균주 처리 구는 뿌리의 생육이 매우 우수하고 세근의 발달이 매우 우수하였다(Fig. 3-B). 또한 벼의 경우 이식 후 시비 8일째 시판제품 처리 구(Fig.
- 7)과 데이터베이스 (DDBJ, EMBL, GenBank)에 등록된 관련 Bacillus sp.균주와의 상동성을 비교한 결과, type strain인 B. subtilis DSM 10과 99.9% 상동성이 유사한 것 (Fig. 7, Fig. 8)으로 보아 토양에서 분리한 공시균주 YK-5 는 분자계통분류학적 분석(형태, 배양 생리, 화학적 및 분자 생태학적 측면)에 의해 B. subtilis YK-5로 명명하였다.
- subtilis 와 동일하게 Ala, Glu, Gly 및 /wesoApm을 가지고 있다(결과 미게재). 또한 분리된 균주의 GC 함량을 HPLC로 분석한 결과, type strain인 B. subtilis와 유사 (52.8 mol%) 하였다(결과 미게재). 원핵생물만이 가지는 유비퀴논을 분석한 결과, YK-5 균주는 2, 3-dimethoxy-5-methyl-l, 4-benzoquinone골격을 가지는 Q8의 isoprene측쇄를 九지고 있었다(결과 미게재).
- jlavus를 대상으로 생산조건을 검토한 결과, 공시 균주의 생육배지는 생육 촉진 효과와 식물병원균에 대한 방제를 위해 1% peptone 및 yeast extract, 5% black sugar가 함유된 modified LB 배지를 사용하였다. 식물 병원균에 대한 공시균주의 길항효과는 시 험균주인 식물 병원균 Fusarium oxysporum KACC 40052균에 대해 배양 7일째까지 강한 생육저해를 보였다. 공시균의 식물성장촉진능은 궁중무 및 벼를 대상으로 pot 실험한 결과, 궁중무의 경우 경엽수, 줄기의 길이 및 뿌리의 길이가 무처리구에 비해 약 60% 이상 우수한 성장촉진 효과를 나타내었으며, 벼의 경우 이식 후 시비 8일째 시판제품 처리구에 비해 공시 균주 처리 구는 잎의 길이와 흰 세근의 발달이 우수하여 뿌리의 발육에 현저한 생육 촉진 효과를 나타내었다.
- 8 mol%) 하였다(결과 미게재). 원핵생물만이 가지는 유비퀴논을 분석한 결과, YK-5 균주는 2, 3-dimethoxy-5-methyl-l, 4-benzoquinone골격을 가지는 Q8의 isoprene측쇄를 九지고 있었다(결과 미게재). 공시 균주가 함유한 지방산 분석은 Table 5와 같이 Ci5:0 Iso, Ci5:o Anteiso, Ci7:o Iso, Ci7:o Anteiso 이 주된 성분으로 구성되어 있었다.
- 4-B). 이들 결과로부터 공시 균주는 무처리 및 시판제품보다 식물성 장촉진기능이매우 우수하다고 평가되었으며(Fig. 5-C), 특히 뿌리의 발육에 현저한 생육 촉진 효과를 나타내었다.
- 공시 균주가 함유한 지방산 분석은 Table 5와 같이 Ci5:0 Iso, Ci5:o Anteiso, Ci7:o Iso, Ci7:o Anteiso 이 주된 성분으로 구성되어 있었다. 이상과 같이 공시균YK-5 균주와 type strain 인 B. subtilise 화학적 분류 특성이 유사하지만 종간의 상관관계를 보다 명확하게 할 필요성이 있어 특정 영역인 16S rDNA 염기서열 결정에 의한 분자계통분류 학적 분석으로 동정하였다. YK-5균주의 16S rDNA 염기서열 (Fig.
- 미게재). 전자현미경으로 촬영한 결과 Bacillus 속(Fig. 6)으로 추정하였으며, 배양 및 생리학적 특징은 Type strain인 Bacillus subtilise 상당히 유사하다고 판단되었다(Table 4).
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