선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 이에 저자는 消瘀血, 續筋骨하는 自然銅이 골절 초기 리모델링에 대해 어떤 효과를 나타내는지 살펴보기 위해 MG-63 세포를 이용하여 自然銅이 뼈 모세포 활성에 미치는 영향에 대해 조사하였고 인위적으로 생쥐 정강이 뼈 골절을 유발한 후 골절부위 뼈 모세포의 형태적인 변화와 전염증 효소(MIF와 IL-6)의 변화를 면역조직학적으로 관찰하였다.
가설 설정
- B : Activation of OPN in fractured tibia (arrow; L. OPN irnmunohistochemistry, x200; R enlargement of Box of L. photo, x1,000).
제안 방법
- 그리고 1차 항체인 mouse anti mouse MIF(1 : 50, Santa Cruz Biotec, USA) 와 mouse anti mouse IL-6(1: 200, Santa Cruz Biotec, USA) 에 4℃ humidified 사lamber에서 72시간 동안 반응시켰으며, 2차 항체인 biotinylated goat anti-mouse IgG(l : 50, Santa Cruz Biotec, USA) 에 4℃ humidified chambei에서 24시간 link 하였다. Avidin biotin complex(Dako, Denmark)에 1시간 동안 실온에서 반응시킨 후 3, 3, _diaminobenzidine(DAB, Sigma) 과 0.01% HC1 이 포함된 0.05M tris-HCl 완충용액 (pH 7.4)에서 발색시킨 후, hematoxylin으로 대조 염색하여 광학현미경으로 관찰하였다.
- 측정하였다. MG~63세포 - 5><伸 cells/ well을 6well에 plating하고 12시간 후에 自然銅 0.5, 1, 0, 1, 5 및 2.0板1也을 농도별로 첨가하여 24시간 동안 배양한 후 수거한 RNA를 trizol reagent(Sigma, USA)를 사용하여 추출한 다음 fluorometer(Introgen, USA)로 RNA를 정량하였다. RT-PCR kit(Premega, USAX 이용하여 cDNA를 합성한 후 OPN primer를 PCR machine으로 반응시켰다.
- RT-PCR kit(Premega, USAX 이용하여 cDNA를 합성한 후 OPN primer를 PCR machine으로 반응시켰다. PCR 산물은 1-2% agarose gel상에서 전기영동하여 relative inte顎sity로측정하였다. 한편 RT-PCR의 정확성을 평가하기 위하여 internal standard인 Q-actin의 증폭을 동시에 실시하였다.
- 0板1也을 농도별로 첨가하여 24시간 동안 배양한 후 수거한 RNA를 trizol reagent(Sigma, USA)를 사용하여 추출한 다음 fluorometer(Introgen, USA)로 RNA를 정량하였다. RT-PCR kit(Premega, USAX 이용하여 cDNA를 합성한 후 OPN primer를 PCR machine으로 반응시켰다. PCR 산물은 1-2% agarose gel상에서 전기영동하여 relative inte顎sity로측정하였다.
- 한편 RT-PCR의 정확성을 평가하기 위하여 internal standard인 Q-actin의 증폭을 동시에 실시하였다. mRNA 발현의 relative intensity는 Optimas 5.2(Optima, USA)를 이용한 영상분석 (image analysis) 을 통해 비교하였다(Table 1).
- 消瘀血, 續筋骨하는 효능이 있는 自然銅(Pyritum) 이 골절 초기 골 remodeling에 대하여 어떤 효과를 나타내는지 연구하기 위해 MG-63 세포를 이용한 OPN mRNA발현 관찰과 인위적으로 생쥐 정강이 뼈 골절을 유발 후 自然銅 투여가 뼈모세포 활성에 미치는 영향에 대해 조사하였고, 골절부위 뼈모세포의 형태적인 변화와 전염증 효소(MIF와 IL-6)의 변화를 면역조직학적으로 관찰한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 골절 부위 내 혈관 신생성 변화를 관찰하기 위해 Wrighfs stain을 실시하였다. 우선 조직을 Wright's stain solution0!] 30분간 반응 후 stop buffere 처리한 다음 관찰하였다.
- 골절 유발 후 14일 후 각 군을 sodium pentobarbital 용액으로 마취하고 vascular rinse와 10% 중성 포르말린 용액 (neutral buffered formalin : NBF)으로심장관류고정을 실시하였다. 적출된 정강이뼈를 탈회 ^(decalcification solution, BBC, UK)에 24시간 처리하고 세척한 후 통상적인 방법으로 파라핀에 포매하여 5㎛ 두께로 연속절편을 만들었다.
- 안쪽 (anterio-medial) 피부를 절개하여 정강이뼈의 앞 모서리를 확인한 다음 bone cutters(FST, Canada)를 사용하여 발목쪽 1/3 지점의 정강이뼈에 골절을 유발하였다. 골절 유발 후 피부를 봉합한 다음 골절 부위를 신축성 밴드(Nippon sigmax, Japan)로 고정하였다. 골절 유발 3일 후 발쪽 부위를 조사하여 괴사 증후가 없는 것을 선별하여 실험에 사용하였다.
- 골절부위의 외부형태적 변화를 영상분석 하기 위해 정강이뼈 주변의 근육을 제거한 후 정강이뼈를 x4 배율로 촬영하였다. Optimas 5.
- 우선 절편을 blocking serum인 10% normal goat serum(l : 20, DAKO, Denmark)에서 2시간 동안 반응시켜 비특이적 면역반응을 억제하였다. 그리고 1차 항체인 mouse anti mouse MIF(1 : 50, Santa Cruz Biotec, USA) 와 mouse anti mouse IL-6(1: 200, Santa Cruz Biotec, USA) 에 4℃ humidified 사lamber에서 72시간 동안 반응시켰으며, 2차 항체인 biotinylated goat anti-mouse IgG(l : 50, Santa Cruz Biotec, USA) 에 4℃ humidified chambei에서 24시간 link 하였다. Avidin biotin complex(Dako, Denmark)에 1시간 동안 실온에서 반응시킨 후 3, 3, _diaminobenzidine(DAB, Sigma) 과 0.
- 적출된 정강이뼈를 탈회 ^(decalcification solution, BBC, UK)에 24시간 처리하고 세척한 후 통상적인 방법으로 파라핀에 포매하여 5㎛ 두께로 연속절편을 만들었다. 만들어진 연속 절편은 Hematoxylin-Eosin법으로 염색하여 표본을 제작하였다.
- 역할을 한다. 본 실험에서는 自然銅 처리 후 골절 초기에 일어나는 염증반응 변화를 전염증효소인 MIF 와 IL-6의 골절부위 내 분포변화를 통해 면역조직학적으로 관찰하였다. MIF는 상처 치유기전에 관여하는 중요한 cytokine으로, In vitro와 in vivo 실험을 통해 염증성 질환 진행에 강력한 역할을 하는 것으로 보고되었으며 3031).
- 2에서 먼저 image 기능의 sharpen low-filter를 사용하여 골절부위를 명확흐')게 한 후 binary morphology에서 invert 기능을 선택하여 골절부위를 intensity 180~200으로 전환 . 부각시킨 다음, Histogram을 통해 동일 영역의 由xel를계수하였다.
- 뼈모세포에서 생성되는 OPN의 골절부위내 분포변화를 조사하기 위해 항 mouse anti OPN(1: 50, Santa Cruz Biotec, USA)항체를 이용한 면역조직화학적 염색을 실시하였다.
- 안쪽 (anterio-medial) 피부를 절개하여 정강이뼈의 앞 모서리를 확인한 다음 bone cutters(FST, Canada)를 사용하여 발목쪽 1/3 지점의 정강이뼈에 골절을 유발하였다. 골절 유발 후 피부를 봉합한 다음 골절 부위를 신축성 밴드(Nippon sigmax, Japan)로 고정하였다.
- 염색을 실시하였다. 우선 절편을 blocking serum인 10% normal goat serum(l : 20, DAKO, Denmark)에서 2시간 동안 반응시켜 비특이적 면역반응을 억제하였다. 그리고 1차 항체인 mouse anti mouse MIF(1 : 50, Santa Cruz Biotec, USA) 와 mouse anti mouse IL-6(1: 200, Santa Cruz Biotec, USA) 에 4℃ humidified 사lamber에서 72시간 동안 반응시켰으며, 2차 항체인 biotinylated goat anti-mouse IgG(l : 50, Santa Cruz Biotec, USA) 에 4℃ humidified chambei에서 24시간 link 하였다.
- 있다. 이에 저자는 消瘀血, 續筋骨하는 自然銅의 골절 초기 리모델링에 대한 효과를 살펴보기 위해 MG-63 세포를 이용하여 自然銅이 뼈 모세포 활성에 미치는 영향에 대해 조사하였고 인위적으로 생쥐 정강이 뼈 골절을 유발한 후 골절부위 뼈 모세포의 형태적인 변화와 전염증 효소(MIF와 IL-6)의 변화를 면역조직학적으로 관찰하였다.
- 실시하였다. 적출된 정강이뼈를 탈회 ^(decalcification solution, BBC, UK)에 24시간 처리하고 세척한 후 통상적인 방법으로 파라핀에 포매하여 5㎛ 두께로 연속절편을 만들었다. 만들어진 연속 절편은 Hematoxylin-Eosin법으로 염색하여 표본을 제작하였다.
- 정강이뼈 골절이 유발된 JT군에 매일 lg/kg/day 량의 자연동을, 자연동 lmg당 생리 식염수 0.1ml의비율로 생리 식염수에 녹여 1일 1회 구강투여 하였다. 한편 In vitrei 사용된 自然銅의 첨가량은 MTT assay 결과 10板1也까지는 세포 생존률의 변화가 일어나지 않아 0.
- 정상군, 정강이뼈 골절을 유발한 대조군, 정강이뼈 골절 유발 후 自然銅을 투여한 실험군(JT군)으로 나누었으며, 각 군에 각 10마리씩 배정하였다.
- PCR 산물은 1-2% agarose gel상에서 전기영동하여 relative inte顎sity로측정하였다. 한편 RT-PCR의 정확성을 평가하기 위하여 internal standard인 Q-actin의 증폭을 동시에 실시하였다. mRNA 발현의 relative intensity는 Optimas 5.
- 한편 골절 초기 염증에 관여하는 전염증효소인 macrophage migration inhibitory factcMMIF) 와 inter-leukin(IL)-6의 골절부위내 분포를 조사하기 위해 면역조직화학적 염색을 실시하였다. 우선 절편을 blocking serum인 10% normal goat serum(l : 20, DAKO, Denmark)에서 2시간 동안 반응시켜 비특이적 면역반응을 억제하였다.
대상 데이터
- 골절 유발 후 피부를 봉합한 다음 골절 부위를 신축성 밴드(Nippon sigmax, Japan)로 고정하였다. 골절 유발 3일 후 발쪽 부위를 조사하여 괴사 증후가 없는 것을 선별하여 실험에 사용하였다.
- 세포는 37笆, 5% Ctfincubator(Sanyo, Japan) 에서 10% Fetal Bovine Serum(Sigma, USA)가 함유된 Dulbeccos modified Eagle, medium(DMEM, Welgin, Korea) 을 사용하여 배양하였다. 오염방지를 위해 항생제로 100 unit/i也 penidllin(Sigina, USA), 100/zg/me strepto-mydn(GibcoZBRL, USA)을 첨가하였다.
- 실험에 사용한 사람 뼈모세포인 MA63세포는 Korean Cell Line Bank(KCLB ; Korea)에서 구입하였다. 세포는 37笆, 5% Ctfincubator(Sanyo, Japan) 에서 10% Fetal Bovine Serum(Sigma, USA)가 함유된 Dulbeccos modified Eagle, medium(DMEM, Welgin, Korea) 을 사용하여 배양하였다.
- 태령 4주된 DBA 암컷 생쥐(오리엔트社, 대한민국) 를 무균사육장치내에서 2주일동안 적응시킨 후 체중 20g된 생쥐를 선별하여 사용하였다.
데이터처리
- 면역조직화학의 결과의 수치화를 위해 Optimas 5.2 (Optima Co., USA)를 이용한 영상분석 (image analysis)을 실시하였다. 영상분석 결과는 Sigmaplot 2000 (SPSS INC, USA)을 통해 유의성을 검증하였다.
- , USA)를 이용한 영상분석 (image analysis)을 실시하였다. 영상분석 결과는 Sigmaplot 2000 (SPSS INC, USA)을 통해 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- 自然銅이 뼈모세포의 Osteopontin(OPN) 생성에 미치는 영향을 조사하기 위해 MG~63세포의 OPN mRNA 발현 변화를 역전사 중합 효소 연쇄 반응법 (reverse transcriptase-polymerase chain reaction, RT-PCR)으로 측정하였다. MG~63세포 - 5><伸 cells/ well을 6well에 plating하고 12시간 후에 自然銅 0.
- 골절부위에 뼈 기질 생성 변화를 조사하기 위해 mallory azan 염색법을 실시하였다. 우선 azocarmine 용액에 1시간 동안 반응시킨 후 aniline blue 용액에 2 시간동안 대조 염색하였다.
성능/효과
- 1. 自然銅을 투여한 실험군이 대조군에 비해 외부형태의 뒤틀림이 적었고 골절 유합속도가 증가하였다.
- 2. 自然銅을 투여한 실험군이 대조군에 비해 뼈 기질 생성이 증가하였다.
- 3. 自然銅을 투여한 실험군이 대조군에 비해 혈관신생 성이 증가하였다.
- 4. 自然銅을 투여한 실험군이 대조군에 비해 전 염증 효소(MIF와 IL-6 양성반응) 활성이 증가하였다.
- 5. 自然銅이 처리된 MG-63 세포에서 OPN mRNA, OPN생성이 증가하였다.
- 이러한 IL-6 양성반응은 정상군에 비해 대조군과 JT 군에서 모두 증가하지만, JT군에서 더 큰 증가를 보였다. IL-6 양성반응의 영상분석 결과 대조군은 정상군에 비해 1, 630% 증가하였고, JT군은 대조군에 비해 39% 증가하여 유의성 QK0.05) 있는 증가를 보였다 (Table 2, Fig. 2-C).
- JT 군도 대조군과 같은 양상을 보였으나, 대조군보다 뼈 기질의 생성과 침적된 뼈모세포의 분포가 더 증가한 것으로 관찰되었다(Fig. 1-B).
- 모세혈관의 분포 증가가 관찰되었다. JT군도 대조군과 같은 양상을 보였으나, 대조군보다 모세혈관의 분포가 더 증가한 것으로 관찰되었다(Fig. 1-B).
- 이러한 MIF 양성반응은 정상군에 비해 대조군과 JT 군에서 모두 증가하지만, JT군에서 더 큰 증가를 보였다. MIF 양성반응의 영상분석 결과 대조군은 정상군에 비해 1, 463% 증가하였고, JT군은 대조군에 비해 98% 증가하여 유의성 QK0.05) 있는 증가를 보였다 (Table 2, Fig. 2-B).
- OPN 양성반응의 영상분석 결과 정상군에 비해 대조군은 4, 334% 증가하였고, 대조군에 비해 JT군은 83% 증가하여 유의성(X0.05) 있는 증가를 보였다(Table 3, Fig. 3-B).
- 自然銅자극에 의한 MG-63세포의 OPN mRNA 발현은 농도 의존적으로 증가하였으며, 세포질 가장자리가 잘 발달된 것으로 관찰되었다. OPN mRNA 발현은 0.
- 대조군 골절 가쪽부위의 염증관여세포 침적 부위에서 모세혈관의 분포 증가가 관찰되었다. JT군도 대조군과 같은 양상을 보였으나, 대조군보다 모세혈관의 분포가 더 증가한 것으로 관찰되었다(Fig.
- 대조군에서는 골절부위가 제대로 유합되지 않아 생긴 뒤틀림을 명확히 확인할 수 있었으나, JT 군에서는 대조군에 비해 이러한 뒤틀림이 감소되어 나타났다. 한편 골절 유합 부위를 영상 분석한 결과, JT 군의 골절 유합 부위(6, 487±416/200, 000 pixel)는 대조군(16, 558±394/200, 000 pixel) 의 골절 유합 부위의 61%에 해당하며 JT군에서 골절 유합 속도가 대조군에 비해 유의성QK0.
- 농도 의존적으로 증가하였다. 또한 自然銅을 투여한 생쥐 정강이뼈 골절부위에서 뼈기질 생성이 증가하였고, 뼈모세포의 OPNt생성 증가가 일어났다. 또한 골절 부위에서 전염증효소(MIF와 IL-6)의 활성 증가가 관찰되었다.
- 또한 自然銅을 투여한 생쥐 정강이뼈 골절부위에서 뼈기질 생성이 증가하였고, 뼈모세포의 OPNt생성 증가가 일어났다. 또한 골절 부위에서 전염증효소(MIF와 IL-6)의 활성 증가가 관찰되었다.
- 3637). 본 실험에서 IL-6는 초기 골절 지역에서 증가하였다. OPNe 뼈모세포에서 생성되어 aVP3 intergrin을 통해 뼈파괴세포의 뼈 부착과 이주에 관여하고幽)골절 초기 다양한 성장인자와 bone resorption factor(l, 25-dihydroxyvitamine D3 and retiniod acid) 에 의해서 생성이 증가되어"41)NF-kB 활성과 그에 따른 anti-apotnsis factor.
- 그 결과 연쇄적 염증반응을 가속화시켜 혈관신생성 증가, 섬유화(hbrosis) 그리고 염증부 위로의 이주세포의 증가를 유도한다34). 본 실험에서 MIF는 초기 골절 지역에서 증가하였다. 한편 MIF 의 활성은 IL-6의 분비 증가를 유도하는데, Janus family tyrosine kinase(Jak) - signal transducers and activators of transcription(STAT) 경로를 통해 ligand 자극에 대한 특정 반응을 정확하고 빠르게 유도한다.
- 의 생성 증가를 유도하여 골절조직 내 염증 활성을 일으키는 것*)으로 보고되었다. 본 실험에서 OPNe 초기 골절 지역에서 증가하였다.
- 뼈모세포에서 생성되는 OPN의 양성반응은 골절 부위 주변의 골성조직에서 관찰되었고, 핵막주변 세포질에서 강한 양성반응을 보였다. 이러한 OPN 양성반응은 정상군에 비해 대조군과 JT군에서 모두 증가하였고, 대조군에 비해 JT군에서 더 큰 증가를 보였다.
- 강한 양성반응을 보였다. 이러한 OPN 양성반응은 정상군에 비해 대조군과 JT군에서 모두 증가하였고, 대조군에 비해 JT군에서 더 큰 증가를 보였다.
- 전염증 효소인 IL-6의 양성반응은 골절 부위에서 관찰되었고, 세포질에서 강한 양성반응을 보였다. 이러한 IL-6 양성반응은 정상군에 비해 대조군과 JT 군에서 모두 증가하지만, JT군에서 더 큰 증가를 보였다.
- 전염증 효소인 MIF의 양성반응은 골절 부위에서 관찰되었고, 세포질에서 강한 양성반응을 보였다. 이러한 MIF 양성반응은 정상군에 비해 대조군과 JT 군에서 모두 증가하지만, JT군에서 더 큰 증가를 보였다.
- 한편 골절 유합 부위를 영상 분석한 결과, JT 군의 골절 유합 부위(6, 487±416/200, 000 pixel)는 대조군(16, 558±394/200, 000 pixel) 의 골절 유합 부위의 61%에 해당하며 JT군에서 골절 유합 속도가 대조군에 비해 유의성QK0.05)있게 증가한 것으로 측정되었다 (Fig. 1-A).
후속연구
- 이상의 결과를 고찰하여보면 自然銅은 골절 초기 전 염증 효소에 의한 염증반응의 조절과 뼈모세포 활성을 통해서 뼈기질 생성을 유도하여 골절부위 remodeling에 기여할 것으로 기대된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.