Avian pathogenic Escherichia coli (APEC) is an important bacterial pathogen of chickens and causes colibacillosis such as airsacculitis, perihepatitis, omphalitis, peritonitis, salpingitis, and pericarditis. As the transfer of antibiotic resistance from animal to humans can be possible, surveillance...
Avian pathogenic Escherichia coli (APEC) is an important bacterial pathogen of chickens and causes colibacillosis such as airsacculitis, perihepatitis, omphalitis, peritonitis, salpingitis, and pericarditis. As the transfer of antibiotic resistance from animal to humans can be possible, surveillance on antibiotic resistance of APEC is very important. A total 34 APEC isolates from diseased chickens during the period from 2007 to 2009 were obtained. The susceptibility of the isolates to 13 antibiotics was determined by disc diffusion assay. Resistance to erythromycin was found in 97.1% of APEC isolated, followed by resistance to tetracycline (85.3%), doxycycline (82.3%), ampicillin (73.5%), sulfisoxazole (67.6%), enrofloxacin (67.6%), ciprofloxacin (64.7%), norfloxacin (61.7%) trimethoprim/sulfamethoxazole (52.9%), gentamycin (26.5%), amoxicillin (8.8%), colistin (5.9%), and amikacin (2.9%). The blaTEM genes were detected in 25 (100%) of the 25 ampicillin-resistant APEC isolates. Among the 29 tetracycline-resistant APEC isolates, tetA and tetB genes were detected in 18 (62.1%) and 9 (31%) isolates, respectively. Twenty six (76.5%) isolates were multiresistant to at least 6 antibiotics and seven (20.1%) isolates were multiresistant to at least 10 antibiotics. This results indicated that multiple antibiotic-resistant APEC is widespread in chicken flocks in Korea.
Avian pathogenic Escherichia coli (APEC) is an important bacterial pathogen of chickens and causes colibacillosis such as airsacculitis, perihepatitis, omphalitis, peritonitis, salpingitis, and pericarditis. As the transfer of antibiotic resistance from animal to humans can be possible, surveillance on antibiotic resistance of APEC is very important. A total 34 APEC isolates from diseased chickens during the period from 2007 to 2009 were obtained. The susceptibility of the isolates to 13 antibiotics was determined by disc diffusion assay. Resistance to erythromycin was found in 97.1% of APEC isolated, followed by resistance to tetracycline (85.3%), doxycycline (82.3%), ampicillin (73.5%), sulfisoxazole (67.6%), enrofloxacin (67.6%), ciprofloxacin (64.7%), norfloxacin (61.7%) trimethoprim/sulfamethoxazole (52.9%), gentamycin (26.5%), amoxicillin (8.8%), colistin (5.9%), and amikacin (2.9%). The blaTEM genes were detected in 25 (100%) of the 25 ampicillin-resistant APEC isolates. Among the 29 tetracycline-resistant APEC isolates, tetA and tetB genes were detected in 18 (62.1%) and 9 (31%) isolates, respectively. Twenty six (76.5%) isolates were multiresistant to at least 6 antibiotics and seven (20.1%) isolates were multiresistant to at least 10 antibiotics. This results indicated that multiple antibiotic-resistant APEC is widespread in chicken flocks in Korea.
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문제 정의
본 연구는 닭에서 병원성을 유발하는 대장균만을 대상으로 항생제 내성양상을 분석하여 닭 대장균증의 효율적인 치료제 선발에 활용하고 또한 항생제 오남용을 예방하여 닭고기의 안전성을 확보하기 위한 자료를 얻고자 연구를 수행하였다.
제안 방법
5로 조정하고, 멸균 면봉을 이용하여 두께가 약 4 mm 인 Meuller-hinton agar(Difco, USA)의 전표면에 균 액을 바르고 60°씩 돌려가며 두번 더 골고루 균액을 발랐다. 그리고 뚜껑을 닫고 3~5분간 실온에 방치한 후 항생제 disc를 디스크분배기로 접종하였으며, 37°(:에서 16~18시간 배양한 후 균 억제대의 크기를 관찰하여 내성 여부를 판정하였다. 분리균의 내성범위는 NCCLS의 기준에 따라 판정하였으며 [10], 내성 양상 분석은 중간내성은 제외시키고 완전한 내성을 나타내는 균주만을 대상으로 하였다.
내성 발현율이 높은 ampicillin과 tetracycline에 대한 내성 결정 유전자 보유는 PCR을 이용하여 조사하였다. 순수 분리된 APEC colony를 94℃의 멸균된 증류수에 10분간 끓인 후 13, 000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상층 액을 따서 PCR 주형으로 사용하였다.
병계로부터 균을 분리하였다. 대장균은 간포막염, 심장주위염 등 병변이 있는 실질장기로부터 분리하여 가능한 APEC 균이 실험에 사용될 수 있도록 하였다.
대장균증으로 폐사한 가검물로부터 대장균분리를 시도하여 총 34개의 농장 가검물로부터 34주의 APEC을 분리하였다. 분리된 균의 대장균 여부를 PCR로 확인한 결과 모두 양성으로 확인되었다<Fig.
시험방법으로 순수 분리된 균주를 Meuller-hinton broth(Difco, USA)에 배양한 후 균 농도를 McFarland No. 0.5로 조정하고, 멸균 면봉을 이용하여 두께가 약 4 mm 인 Meuller-hinton agar(Difco, USA)의 전표면에 균 액을 바르고 60°씩 돌려가며 두번 더 골고루 균액을 발랐다. 그리고 뚜껑을 닫고 3~5분간 실온에 방치한 후 항생제 disc를 디스크분배기로 접종하였으며, 37°(:에서 16~18시간 배양한 후 균 억제대의 크기를 관찰하여 내성 여부를 판정하였다.
대상 데이터
2007년 8월부터 2009년 7월까지 2년간 경기도, 강원도 등 전국 소재 닭 농장으로부터 APEC균 34주를 분리하여 항생제 내성균 분포현황과 내성양상을 조사하였다. 13종의 항생제에 대한 내성시험 결과, erythromycin 에 97.
Becton-Dickinson(USA)에서 판매하는 BBL antibiotic disc 12종 항생제 (ampicillin, amoxicillin, gentamycin, amikacin, norfloxacin, ciprofloxacin, trimetho-prim/sulfiimethoxazole, sulfisoxazole, erythromycin, tetracycline, doxycycline, colistin)와 Basingstoke(UK)에서 판매하는 oxoid antibiotic disk 1 종 항생제 (enrofloxacin) 등총 13종의 항생제를 사용하였다.
닭의 비병원성 대장균을 제외한 병원성 대장균만을 수집하기 위하여 2007년 8월부터 2009년 7월까지 2년간 경기도, 강원도 등 전국 소재 농장에서 연구자의 실험실로 부검 의뢰된 사례 가운데 간포막염, 복막염, 심장주위염 등 대장균증으로 피해가 큰 34개 농장에서 의뢰된 병계로부터 균을 분리하였다. 대장균은 간포막염, 심장주위염 등 병변이 있는 실질장기로부터 분리하여 가능한 APEC 균이 실험에 사용될 수 있도록 하였다.
대장균증 발생 34개 농장으로부터 분리된 APEC 34 주에 대한 항생제 내성검사를 실시하였다(Table 1). Erythromycin에 대하여 APEC 33개주(97.
대장균증을 보이는 닭의 실질장기에서 분리한 균을 MacConkey agar(BBL, USA)에 접종 후 37℃에서 18~24 시간 배양하여 lactose를 분해하여 핑크색으로 발육하는 집락을 채취하였다. 그리고 Sabat 등 [13]이 보고한 프라이머 (ECA75F; 5'-GGAAGAAGCTTGCT TCTTTGCT GAC-3; ECR619R; 5'-AGCC CGGGGATTTCACATCTG ACTTA-3, )를 사용하여 E.
분리균의 내성범위는 NCCLS의 기준에 따라 판정하였으며 [10], 내성 양상 분석은 중간내성은 제외시키고 완전한 내성을 나타내는 균주만을 대상으로 하였다. 모든 시험에서 E. coli ATCC 25922를 표준 균주로 사용하였다.
이론/모형
순수 분리된 APEC colony를 94℃의 멸균된 증류수에 10분간 끓인 후 13, 000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상층 액을 따서 PCR 주형으로 사용하였다. AM 내성 유전자인 blaTEM유전자를 검출하기 위해서 Maynard 등 [9] 이 보고한 프라이머(5'-GAGWTCAACATTTTCGA-3' 와 5, -TCGCCTGTGTATTATCTCCC-3, )를 이용하였다. 그리고 TE 내성 유전자 tetA와 tetB를 증폭하기 위해서는 Lanz 등 [기이 사용한 것과 동일한 프라어머를 이용하였다.
채취하였다. 그리고 Sabat 등 [13]이 보고한 프라이머 (ECA75F; 5'-GGAAGAAGCTTGCT TCTTTGCT GAC-3; ECR619R; 5'-AGCC CGGGGATTTCACATCTG ACTTA-3, )를 사용하여 E. coli를 동정 하는 유전자증폭법 (polymerase chain reaction; PCR)을 실시하여 동정 하였다.
AM 내성 유전자인 blaTEM유전자를 검출하기 위해서 Maynard 등 [9] 이 보고한 프라이머(5'-GAGWTCAACATTTTCGA-3' 와 5, -TCGCCTGTGTATTATCTCCC-3, )를 이용하였다. 그리고 TE 내성 유전자 tetA와 tetB를 증폭하기 위해서는 Lanz 등 [기이 사용한 것과 동일한 프라어머를 이용하였다. 즉, 유전자 teM를 검출하기 위한 프라이 머(5, -GGCGGrCTTCTTCATCATGC-3, 와 5'-CGGCAGGCAG CGCAAGTAGA-3, )를, 유전자 tetB를 증폭하기 위한 프라이 머 (S-CATTAATAGGCGCATCGCTG-3, 와 5'-TGAA GGTCATCGAIAGCAGG-3W 사용하였다.
분리균에 대한 항생제 내성 시험은 디스크 확산법으로 실시하였다. Becton-Dickinson(USA)에서 판매하는 BBL antibiotic disc 12종 항생제 (ampicillin, amoxicillin, gentamycin, amikacin, norfloxacin, ciprofloxacin, trimetho-prim/sulfiimethoxazole, sulfisoxazole, erythromycin, tetracycline, doxycycline, colistin)와 Basingstoke(UK)에서 판매하는 oxoid antibiotic disk 1 종 항생제 (enrofloxacin) 등총 13종의 항생제를 사용하였다.
그리고 뚜껑을 닫고 3~5분간 실온에 방치한 후 항생제 disc를 디스크분배기로 접종하였으며, 37°(:에서 16~18시간 배양한 후 균 억제대의 크기를 관찰하여 내성 여부를 판정하였다. 분리균의 내성범위는 NCCLS의 기준에 따라 판정하였으며 [10], 내성 양상 분석은 중간내성은 제외시키고 완전한 내성을 나타내는 균주만을 대상으로 하였다. 모든 시험에서 E.
성능/효과
9%)는 공시한 항생제 13종 중 11종에 대하여 다제내성을 보이는 것으로 나타났다. 10종의 항생제에 대한 다제내성 균주도 6주(17.6%)이었으며, 9종, 8종, 7종 및 6종의 항생제에 대한 다제내성 균주도 각각 6주 (17.6%), 1주(2.9%), 4주(11.8%) 및 8주(23.5%)로 전체 APEC 34주중 26주(76.5%)가 6종 이상의 항생제에 대한 다제내성을 가지는 것으로 나타났다(Table 2).
13종의 항생제에 대한 내성시험 결과, erythromycin 에 97.1%, tetracycline에 85.3%, doxycline에 82.3%, ampicillin에 73.5%로 높은 내성 순위를 보였으며, sulfonamide계인 sulfisoxazole과 trimsthoprim/sulfametho-xazole에는 각각 67.6%, 52.9%를, quinolone계인 enrofloxacin, ciprofloxacin 및 norfloxacin에 대해서는 67.6%, 64.7% 및 61.7%로 유사한 내성율을 나타내었다. 그러나 amikacin과 colistin에 대한 내성을 나타내는 균주는 거의 확인되지 않았다.
1% 순으로 다른 항생제보다 높은 내성율이 있음을 보고한 바 있다. 2007년 8월부터 2009년 7월까지 2년간 전구의 34개 농장으로부터 분리된 APEC주를 대상으로 13종 항생제에 대한 내성 시험을 실시한 본 시험결과에서도 erythromycin, tetracycline, 및 ampicillin에 대한 내성율이 각각 97.1%, 85.3%, 및 73.5%로 나타나 Lee 등 [8]의 결과와 유사하게 매우 높은 것으로 확인되었다. 본 실험결과에서도 이들 항생제에 대한 대장균의 내성율이 2003년 분리주의 결과와 유사한 것으로 보아 이들 항생제에 대한 내성율은 개선되지 않고 최근까지도 지속적으로 문제되고 있는 것으로 추정되었다.
그러나 amikacin과 colistin에 대한 내성을 나타내는 균주는 거의 확인되지 않았다. APEC 34주에 대한 13종 항생제 내성 양상을 분석한 결과 26주(76.5%)가 6종 이상의 항생제에 대한 다제내성을 가지는 것으로 나타났으며 7주 (20.1 %)는 10종 이상의 항생제에 대한 다제내성을 가지는 것으로 나타나 시급한 대책수립이 필요할 것으로 판단되 었다.
APEC 34주에 대한 13종 항생제 내성양상을 분석한 결과 26주(76.5%)가 6종 이상의 항생제에 대한 다제내성을 가지는 것으로 나타났으며 7주(20.1%)는 10종 이상의 항생제에 대한 다제내성을 가지는 것으로 나타났다. 이는 공중위생학적으로 매우 심각한 위해요소가 될 것으로 평가된다.
APEC 34주에 대한 항생제 내성양상을 분석한 결과 1주(2.9%)는 공시한 항생제 13종 중 11종에 대하여 다제내성을 보이는 것으로 나타났다. 10종의 항생제에 대한 다제내성 균주도 6주(17.
이러한 차이는 blaTEM유전자 검출에 사용된 프라이머 혹은 실험에 공시한 APEC의 분리년도 차이에 기인될 수 있을 것으로 생각된다. Ampicillin 내성주에 대한 blaTEM 유전자의 검출율로 보아 국내분리 APEC의 ampicillin 내성 균주의 출현은 blaTEM 유전자와 관련된 p-lactamase 발현과 관련이 있을 것으로 추정되었다.
1). Erythromycin에 대하여 APEC 33개주(97.1%)가 내성을 보여 가장 높은 내성율을 보였다. Tetracycline에 대해서는 85.
Fluoroquinolone계 항균제인 enrofloxacin, ciprofloxacin, norfloxacine] 내성율은 61.7%~67.6%로 비교적 높게 나타났다. 이는 이들 제제가 경구접종으로도 높은 항균성을 나타내는 특성이 있고, 1990년대에 처음 국내에 도입된 이후 닭질병의 치료 및 예방 목적으로 광범위하게 사용된 사실과 관련이 있을 것으로 추정 된다.
Penicillin계 항생제인 ampicillin과 amoxicillin에 대한분리주의 내성 검사를 실시한 결과 ampicilline 73.5% 로 비교적 높게 나타난 반면 amoxicilline 8.8%로 낮게 나타났다. 하지만 amoxicillin에 대해 중간내성을 나타내는 균주가 32.
1%)가 내성을 보여 가장 높은 내성율을 보였다. Tetracycline에 대해서는 85.3%, doxycycline에 대해서는 82.3%, ampicillin는 73.5%, sulfisoxazole과 enrofloxacine 67.6%의 내성율을보였다. 분리균의 50% 이상이 내성을 나타내는 항생제는 erythromycin, tetracycline, doxycycline, ampicillin, sulfisoxazole, enrofloxacin, trimethoprim/sulfamethoxazole, ciprofloxacin, norfloxacin 등 종 9종으로 97.
9% 사이의 내성율을 보였다. amoxicillin에 대해서는 8.8%만 내성을 보였지만 32.3%의 중간내성을 보여, 가장 높은 중간내성율이 관찰뇌었다. 그러나 amikacin과 colistin에 대한 내성을 나타내는 균주는 각각 2.
내성 발현율이 높은 ampicillin과 tetracycline에 대한 내성 결정 유전자를 조사한 결과 ampicillin 내성 결정유 전자로 알려진 비aTEMe 내성을 보이는 25개 균주중 25주(100%) 모두에서 검출뇌었다. Tetracycline에 내성을 보이는 29개 분리주는 tetracycline 내성 결정 유전자인 TETA에 대해서는 18주(62.
5%로 나타나 Lee 등 [8]의 결과와 유사하게 매우 높은 것으로 확인되었다. 본 실험결과에서도 이들 항생제에 대한 대장균의 내성율이 2003년 분리주의 결과와 유사한 것으로 보아 이들 항생제에 대한 내성율은 개선되지 않고 최근까지도 지속적으로 문제되고 있는 것으로 추정되었다.
국내에서는 2008년 7월부터 fluoroquinolone 항균제 중 인수 공용으로 사용되는 ciprofloxacin, norfloxacin, pefloxacin 및 ofloxacin에 대하여 동물에서의 사용을 금지하고 있지만 enrofloxacin에 대하여는 사용제한을 두지 않고 있다. 본 실험에서 enrofloxacin에 대한 내성율이 67.6%로 매우 높은 점을 고려하면 enrofloxacin에 대한 대책수립도 빠른 시일내에 필요할 것으로 판단되었다.
1%인 것으로 보고하였다. 본 실험에서 분리된 APEC 주중 ampicillin에 내성을 보이는 25주를 대상으로 况aZEM유전자 보유여부를 조사한 결과에서는 25주 모두 blaTEM유전자가 검출되는 것으로 나타나 Kim 등 [6]의 보고보다 다소 높은 것으로 나타났다. 이러한 차이는 blaTEM유전자 검출에 사용된 프라이머 혹은 실험에 공시한 APEC의 분리년도 차이에 기인될 수 있을 것으로 생각된다.
본 연구에서 분리된 APEC 34주 중 amikacin에 대한 내성을 보이는 균은 1주(2.9%)로 아직 내성을 보이는 균주는 거의 없었다. 이는 amikacin 은 균이 분비하는 aminoglycoside계 불활화 효소에 가장 안정 한 계열의 항생제로 쉽게 내성이 발생하지 않는 특징이 있으며 [12], 또한 국내 닭에서는 거의 사용되지 않았던 사실 [4] 과관련이 있을 것으로 추정되었다.
6%의 내성율을보였다. 분리균의 50% 이상이 내성을 나타내는 항생제는 erythromycin, tetracycline, doxycycline, ampicillin, sulfisoxazole, enrofloxacin, trimethoprim/sulfamethoxazole, ciprofloxacin, norfloxacin 등 종 9종으로 97.1%에서 52.9% 사이의 내성율을 보였다. amoxicillin에 대해서는 8.
후속연구
따라서 다제내성을 가지는 APEC균이 닭고기에 오염되어 부적절한 위생관리로 사람에게 감염되었다고 가정하면 효과적인 치료제 선발이 쉽지 않을 것으로 추정된다. 따라서 이에 대한 추가적인 연구와 닭고기에서의 안전성 연구가 시급히 필요할 것으로 사료된다.
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