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문제 정의
- 본 연구는 닭에서 병원성을 유발하는 대장균만을 대상으로 항생제 내성양상을 분석하여 닭 대장균증의 효율적인 치료제 선발에 활용하고 또한 항생제 오남용을 예방하여 닭고기의 안전성을 확보하기 위한 자료를 얻고자 연구를 수행하였다.
제안 방법
- 5로 조정하고, 멸균 면봉을 이용하여 두께가 약 4 mm 인 Meuller-hinton agar(Difco, USA)의 전표면에 균 액을 바르고 60°씩 돌려가며 두번 더 골고루 균액을 발랐다. 그리고 뚜껑을 닫고 3~5분간 실온에 방치한 후 항생제 disc를 디스크분배기로 접종하였으며, 37°(:에서 16~18시간 배양한 후 균 억제대의 크기를 관찰하여 내성 여부를 판정하였다. 분리균의 내성범위는 NCCLS의 기준에 따라 판정하였으며 [10], 내성 양상 분석은 중간내성은 제외시키고 완전한 내성을 나타내는 균주만을 대상으로 하였다.
- 내성 발현율이 높은 ampicillin과 tetracycline에 대한 내성 결정 유전자 보유는 PCR을 이용하여 조사하였다. 순수 분리된 APEC colony를 94℃의 멸균된 증류수에 10분간 끓인 후 13, 000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상층 액을 따서 PCR 주형으로 사용하였다.
- 병계로부터 균을 분리하였다. 대장균은 간포막염, 심장주위염 등 병변이 있는 실질장기로부터 분리하여 가능한 APEC 균이 실험에 사용될 수 있도록 하였다.
- 대장균증으로 폐사한 가검물로부터 대장균분리를 시도하여 총 34개의 농장 가검물로부터 34주의 APEC을 분리하였다. 분리된 균의 대장균 여부를 PCR로 확인한 결과 모두 양성으로 확인되었다<Fig.
- 시험방법으로 순수 분리된 균주를 Meuller-hinton broth(Difco, USA)에 배양한 후 균 농도를 McFarland No. 0.5로 조정하고, 멸균 면봉을 이용하여 두께가 약 4 mm 인 Meuller-hinton agar(Difco, USA)의 전표면에 균 액을 바르고 60°씩 돌려가며 두번 더 골고루 균액을 발랐다. 그리고 뚜껑을 닫고 3~5분간 실온에 방치한 후 항생제 disc를 디스크분배기로 접종하였으며, 37°(:에서 16~18시간 배양한 후 균 억제대의 크기를 관찰하여 내성 여부를 판정하였다.
대상 데이터
- 2007년 8월부터 2009년 7월까지 2년간 경기도, 강원도 등 전국 소재 닭 농장으로부터 APEC균 34주를 분리하여 항생제 내성균 분포현황과 내성양상을 조사하였다. 13종의 항생제에 대한 내성시험 결과, erythromycin 에 97.
- Becton-Dickinson(USA)에서 판매하는 BBL antibiotic disc 12종 항생제 (ampicillin, amoxicillin, gentamycin, amikacin, norfloxacin, ciprofloxacin, trimetho-prim/sulfiimethoxazole, sulfisoxazole, erythromycin, tetracycline, doxycycline, colistin)와 Basingstoke(UK)에서 판매하는 oxoid antibiotic disk 1 종 항생제 (enrofloxacin) 등총 13종의 항생제를 사용하였다.
- 닭의 비병원성 대장균을 제외한 병원성 대장균만을 수집하기 위하여 2007년 8월부터 2009년 7월까지 2년간 경기도, 강원도 등 전국 소재 농장에서 연구자의 실험실로 부검 의뢰된 사례 가운데 간포막염, 복막염, 심장주위염 등 대장균증으로 피해가 큰 34개 농장에서 의뢰된 병계로부터 균을 분리하였다. 대장균은 간포막염, 심장주위염 등 병변이 있는 실질장기로부터 분리하여 가능한 APEC 균이 실험에 사용될 수 있도록 하였다.
- 대장균증 발생 34개 농장으로부터 분리된 APEC 34 주에 대한 항생제 내성검사를 실시하였다(Table 1). Erythromycin에 대하여 APEC 33개주(97.
- 대장균증을 보이는 닭의 실질장기에서 분리한 균을 MacConkey agar(BBL, USA)에 접종 후 37℃에서 18~24 시간 배양하여 lactose를 분해하여 핑크색으로 발육하는 집락을 채취하였다. 그리고 Sabat 등 [13]이 보고한 프라이머 (ECA75F; 5'-GGAAGAAGCTTGCT TCTTTGCT GAC-3; ECR619R; 5'-AGCC CGGGGATTTCACATCTG ACTTA-3, )를 사용하여 E.
- 분리균의 내성범위는 NCCLS의 기준에 따라 판정하였으며 [10], 내성 양상 분석은 중간내성은 제외시키고 완전한 내성을 나타내는 균주만을 대상으로 하였다. 모든 시험에서 E. coli ATCC 25922를 표준 균주로 사용하였다.
이론/모형
- 순수 분리된 APEC colony를 94℃의 멸균된 증류수에 10분간 끓인 후 13, 000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상층 액을 따서 PCR 주형으로 사용하였다. AM 내성 유전자인 blaTEM유전자를 검출하기 위해서 Maynard 등 [9] 이 보고한 프라이머(5'-GAGWTCAACATTTTCGA-3' 와 5, -TCGCCTGTGTATTATCTCCC-3, )를 이용하였다. 그리고 TE 내성 유전자 tetA와 tetB를 증폭하기 위해서는 Lanz 등 [기이 사용한 것과 동일한 프라어머를 이용하였다.
- 채취하였다. 그리고 Sabat 등 [13]이 보고한 프라이머 (ECA75F; 5'-GGAAGAAGCTTGCT TCTTTGCT GAC-3; ECR619R; 5'-AGCC CGGGGATTTCACATCTG ACTTA-3, )를 사용하여 E. coli를 동정 하는 유전자증폭법 (polymerase chain reaction; PCR)을 실시하여 동정 하였다.
- AM 내성 유전자인 blaTEM유전자를 검출하기 위해서 Maynard 등 [9] 이 보고한 프라이머(5'-GAGWTCAACATTTTCGA-3' 와 5, -TCGCCTGTGTATTATCTCCC-3, )를 이용하였다. 그리고 TE 내성 유전자 tetA와 tetB를 증폭하기 위해서는 Lanz 등 [기이 사용한 것과 동일한 프라어머를 이용하였다. 즉, 유전자 teM를 검출하기 위한 프라이 머(5, -GGCGGrCTTCTTCATCATGC-3, 와 5'-CGGCAGGCAG CGCAAGTAGA-3, )를, 유전자 tetB를 증폭하기 위한 프라이 머 (S-CATTAATAGGCGCATCGCTG-3, 와 5'-TGAA GGTCATCGAIAGCAGG-3W 사용하였다.
- 분리균에 대한 항생제 내성 시험은 디스크 확산법으로 실시하였다. Becton-Dickinson(USA)에서 판매하는 BBL antibiotic disc 12종 항생제 (ampicillin, amoxicillin, gentamycin, amikacin, norfloxacin, ciprofloxacin, trimetho-prim/sulfiimethoxazole, sulfisoxazole, erythromycin, tetracycline, doxycycline, colistin)와 Basingstoke(UK)에서 판매하는 oxoid antibiotic disk 1 종 항생제 (enrofloxacin) 등총 13종의 항생제를 사용하였다.
- 그리고 뚜껑을 닫고 3~5분간 실온에 방치한 후 항생제 disc를 디스크분배기로 접종하였으며, 37°(:에서 16~18시간 배양한 후 균 억제대의 크기를 관찰하여 내성 여부를 판정하였다. 분리균의 내성범위는 NCCLS의 기준에 따라 판정하였으며 [10], 내성 양상 분석은 중간내성은 제외시키고 완전한 내성을 나타내는 균주만을 대상으로 하였다. 모든 시험에서 E.
성능/효과
- 9%)는 공시한 항생제 13종 중 11종에 대하여 다제내성을 보이는 것으로 나타났다. 10종의 항생제에 대한 다제내성 균주도 6주(17.6%)이었으며, 9종, 8종, 7종 및 6종의 항생제에 대한 다제내성 균주도 각각 6주 (17.6%), 1주(2.9%), 4주(11.8%) 및 8주(23.5%)로 전체 APEC 34주중 26주(76.5%)가 6종 이상의 항생제에 대한 다제내성을 가지는 것으로 나타났다(Table 2).
- 13종의 항생제에 대한 내성시험 결과, erythromycin 에 97.1%, tetracycline에 85.3%, doxycline에 82.3%, ampicillin에 73.5%로 높은 내성 순위를 보였으며, sulfonamide계인 sulfisoxazole과 trimsthoprim/sulfametho-xazole에는 각각 67.6%, 52.9%를, quinolone계인 enrofloxacin, ciprofloxacin 및 norfloxacin에 대해서는 67.6%, 64.7% 및 61.7%로 유사한 내성율을 나타내었다. 그러나 amikacin과 colistin에 대한 내성을 나타내는 균주는 거의 확인되지 않았다.
- 1% 순으로 다른 항생제보다 높은 내성율이 있음을 보고한 바 있다. 2007년 8월부터 2009년 7월까지 2년간 전구의 34개 농장으로부터 분리된 APEC주를 대상으로 13종 항생제에 대한 내성 시험을 실시한 본 시험결과에서도 erythromycin, tetracycline, 및 ampicillin에 대한 내성율이 각각 97.1%, 85.3%, 및 73.5%로 나타나 Lee 등 [8]의 결과와 유사하게 매우 높은 것으로 확인되었다. 본 실험결과에서도 이들 항생제에 대한 대장균의 내성율이 2003년 분리주의 결과와 유사한 것으로 보아 이들 항생제에 대한 내성율은 개선되지 않고 최근까지도 지속적으로 문제되고 있는 것으로 추정되었다.
- 그러나 amikacin과 colistin에 대한 내성을 나타내는 균주는 거의 확인되지 않았다. APEC 34주에 대한 13종 항생제 내성 양상을 분석한 결과 26주(76.5%)가 6종 이상의 항생제에 대한 다제내성을 가지는 것으로 나타났으며 7주 (20.1 %)는 10종 이상의 항생제에 대한 다제내성을 가지는 것으로 나타나 시급한 대책수립이 필요할 것으로 판단되 었다.
- APEC 34주에 대한 13종 항생제 내성양상을 분석한 결과 26주(76.5%)가 6종 이상의 항생제에 대한 다제내성을 가지는 것으로 나타났으며 7주(20.1%)는 10종 이상의 항생제에 대한 다제내성을 가지는 것으로 나타났다. 이는 공중위생학적으로 매우 심각한 위해요소가 될 것으로 평가된다.
- APEC 34주에 대한 항생제 내성양상을 분석한 결과 1주(2.9%)는 공시한 항생제 13종 중 11종에 대하여 다제내성을 보이는 것으로 나타났다. 10종의 항생제에 대한 다제내성 균주도 6주(17.
- 이러한 차이는 blaTEM유전자 검출에 사용된 프라이머 혹은 실험에 공시한 APEC의 분리년도 차이에 기인될 수 있을 것으로 생각된다. Ampicillin 내성주에 대한 blaTEM 유전자의 검출율로 보아 국내분리 APEC의 ampicillin 내성 균주의 출현은 blaTEM 유전자와 관련된 p-lactamase 발현과 관련이 있을 것으로 추정되었다.
- 1). Erythromycin에 대하여 APEC 33개주(97.1%)가 내성을 보여 가장 높은 내성율을 보였다. Tetracycline에 대해서는 85.
- Fluoroquinolone계 항균제인 enrofloxacin, ciprofloxacin, norfloxacine] 내성율은 61.7%~67.6%로 비교적 높게 나타났다. 이는 이들 제제가 경구접종으로도 높은 항균성을 나타내는 특성이 있고, 1990년대에 처음 국내에 도입된 이후 닭질병의 치료 및 예방 목적으로 광범위하게 사용된 사실과 관련이 있을 것으로 추정 된다.
- Penicillin계 항생제인 ampicillin과 amoxicillin에 대한분리주의 내성 검사를 실시한 결과 ampicilline 73.5% 로 비교적 높게 나타난 반면 amoxicilline 8.8%로 낮게 나타났다. 하지만 amoxicillin에 대해 중간내성을 나타내는 균주가 32.
- 1%)가 내성을 보여 가장 높은 내성율을 보였다. Tetracycline에 대해서는 85.3%, doxycycline에 대해서는 82.3%, ampicillin는 73.5%, sulfisoxazole과 enrofloxacine 67.6%의 내성율을보였다. 분리균의 50% 이상이 내성을 나타내는 항생제는 erythromycin, tetracycline, doxycycline, ampicillin, sulfisoxazole, enrofloxacin, trimethoprim/sulfamethoxazole, ciprofloxacin, norfloxacin 등 종 9종으로 97.
- 9% 사이의 내성율을 보였다. amoxicillin에 대해서는 8.8%만 내성을 보였지만 32.3%의 중간내성을 보여, 가장 높은 중간내성율이 관찰뇌었다. 그러나 amikacin과 colistin에 대한 내성을 나타내는 균주는 각각 2.
- 내성 발현율이 높은 ampicillin과 tetracycline에 대한 내성 결정 유전자를 조사한 결과 ampicillin 내성 결정유 전자로 알려진 비aTEMe 내성을 보이는 25개 균주중 25주(100%) 모두에서 검출뇌었다. Tetracycline에 내성을 보이는 29개 분리주는 tetracycline 내성 결정 유전자인 TETA에 대해서는 18주(62.
- 5%로 나타나 Lee 등 [8]의 결과와 유사하게 매우 높은 것으로 확인되었다. 본 실험결과에서도 이들 항생제에 대한 대장균의 내성율이 2003년 분리주의 결과와 유사한 것으로 보아 이들 항생제에 대한 내성율은 개선되지 않고 최근까지도 지속적으로 문제되고 있는 것으로 추정되었다.
- 국내에서는 2008년 7월부터 fluoroquinolone 항균제 중 인수 공용으로 사용되는 ciprofloxacin, norfloxacin, pefloxacin 및 ofloxacin에 대하여 동물에서의 사용을 금지하고 있지만 enrofloxacin에 대하여는 사용제한을 두지 않고 있다. 본 실험에서 enrofloxacin에 대한 내성율이 67.6%로 매우 높은 점을 고려하면 enrofloxacin에 대한 대책수립도 빠른 시일내에 필요할 것으로 판단되었다.
- 1%인 것으로 보고하였다. 본 실험에서 분리된 APEC 주중 ampicillin에 내성을 보이는 25주를 대상으로 况aZEM유전자 보유여부를 조사한 결과에서는 25주 모두 blaTEM유전자가 검출되는 것으로 나타나 Kim 등 [6]의 보고보다 다소 높은 것으로 나타났다. 이러한 차이는 blaTEM유전자 검출에 사용된 프라이머 혹은 실험에 공시한 APEC의 분리년도 차이에 기인될 수 있을 것으로 생각된다.
- 본 연구에서 분리된 APEC 34주 중 amikacin에 대한 내성을 보이는 균은 1주(2.9%)로 아직 내성을 보이는 균주는 거의 없었다. 이는 amikacin 은 균이 분비하는 aminoglycoside계 불활화 효소에 가장 안정 한 계열의 항생제로 쉽게 내성이 발생하지 않는 특징이 있으며 [12], 또한 국내 닭에서는 거의 사용되지 않았던 사실 [4] 과관련이 있을 것으로 추정되었다.
- 6%의 내성율을보였다. 분리균의 50% 이상이 내성을 나타내는 항생제는 erythromycin, tetracycline, doxycycline, ampicillin, sulfisoxazole, enrofloxacin, trimethoprim/sulfamethoxazole, ciprofloxacin, norfloxacin 등 종 9종으로 97.1%에서 52.9% 사이의 내성율을 보였다. amoxicillin에 대해서는 8.
후속연구
- 따라서 다제내성을 가지는 APEC균이 닭고기에 오염되어 부적절한 위생관리로 사람에게 감염되었다고 가정하면 효과적인 치료제 선발이 쉽지 않을 것으로 추정된다. 따라서 이에 대한 추가적인 연구와 닭고기에서의 안전성 연구가 시급히 필요할 것으로 사료된다.
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