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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 tilapia 종의 어류비늘을 원료로 사용하여 어류콜라겐 펩타이드(SC, collagen peptide from scale)를 제조한 후 현재 식품 및 화장품 원료 등 여러 분야에 다양한 용도로 시판되고 있는 씨엔에이바이오텍(주)의 돈피젤라틴에서 추출한 돈피젤라틴 콜라겐펩타이드(PC, collagen peptide from pig-skin gelatin)를 비교군으로 하여 물리화학적 특성과 생리활성을 비교 검토하였다.
제안 방법
- 7%의 활성탄을 첨가하여 shaking incubator에서 50℃, 200rpm의 조건으로 30분 동안 교반하면서 탈색·탈취시켰다. 1차 정제된 콜라겐 펩타이드 추출액을 이온 교환수지를 이용하여 추출액에 포함되어 있는 유리아미노산이나 그의 염을 제거하는 2차 정제 즉, 탈이온처리를 하였다. 그리고 추출액을 1 ㎛의 membrane filter를 사용하여 감압 여과함으로써 난용성 불순물이 제거된 순수한 수용성 콜라겐 펩타이드를 정제하여 얻었다.
- DPPH(α,α‘-diphenyl-picryl hydrazyl) 라디칼 소거능 측정은 DPPH에 의한 전자공여능 측정으로 1×10⁻⁴M DPPH(Sigma제, USA) 에탄올 용액 0.8 ml에 시료 0.2 ml를 첨가한 후 520 nm에서 60분 후에 흡광도 감소치를 측정하였다[23].
- Linoleic acid model system을 이용한 지질과산화 억제효과 실험은 0.13 % linolelic acid 5 ml, 증류수 2.4 ml, 인산완충액(pH7.0) 5 ml 및 시료 100 ml을 cap tube에 넣고 40°C 항온조에 5일간 보관한 후 지질과산화 정도를 thiocyanate법에 의해서 측정하였다[28].
- 본 논문 2.2의 콜라겐 제조방법에 의하여 효소 가수분해물을 얻어 정제하여 어류 비늘(SC, collagen peptide from scale)에서 4%의 농도로 어류콜라겐펩타이드를 제조하였다.
- 어류콜라겐 펩타이드 추출액에 대한 아미노산 조성 분석은 PITC 라벨링 한 후에 Automated Amino Acid Analyzer에 의해 Waters 510 HPLC을 이용해서 행하였고, 추출 및 전처리 방법은 시료 중 1000 ㎕를 취하여 PICO-tag 방법을 이용하여 가수분해 및 PITC 라베링을 한 후 시료 400 ㎕중에서 20 ㎕를 취하여HPLC에 로딩하여 크로마토그램을 얻었다. 분석조건은 Table 1과 같다.
- 어류콜라겐 펩타이드 추출액에 대한 영양성분 분석은 식품 공전 시험법[20]에 준하여 실시하였고, 조단백 분석은 세미마이크로킬달법으로, 조지방 함량은 에테르 추출법으로 그리고 탄수화물 분석은 벨트란 법으로 분석하였다. 열량 분석은 에크워터계수를 사용하여 계산하였으며 영양성분을 분석한 결과에 의하여 콜라겐 펩타이드 중 어류 비늘에서 추출한 것에는 조단백질 함량에 4.27의 에너지 환산계수, 돈피젤리틴에서 추출한 경우는 조단백질 함량에 3.90의 에너지 환산계수 등을 곱하여 열량계산을 하였고, 그 외 조지방 및 탄수화물 함량에 8.37 및 3.57의 각각의 에너지 환산계수를 곱하여 그 합을 총열량으로 환산하였다.
- 0으로 보정한 다음 반응액의 부피를 10 ml로 하였다. 이 용액을 37℃에서 1시간 반응시키고 각 반응액 1 ml를 취하여 초산용액과 Griess 시약을 가한 다음 혼합하여 실온에서 15분간 방치한 후 520 nm에서 흡광도를 측정하여 아질산염 소거능을 측정하였다[27].
- 정제된 어류콜라겐 펩타이드 추출액에 대한 분자량 측정은 MALDI-TOF Mass Spectrometer(Voyagen- DETMSTR Spectrometer, Perseptive Biosystems, USA)를 사용하여 분석하였다.
- 지질과산화의 연쇄반응에 관여하는 산화성 활성 유리라디칼에 전자를 공여하여 산화를 억제시키는 척도인 DPPH라디칼 소거능을 측정한 결과는 비교군인 BHA(Butylated Hydroxy Anisole)이나 Vitamine E에 비하여 낮았다. 즉, 100 ppm에서 SC는 5.
- 총 폴리페놀 함량 측정은 Folin-Ciocalteu Reagent가 추출물의 폴리페놀성 화합물에 의해 환원되어 몰리부덴 청색으로 발색하는 원리를 이용하여 분석하였다[21]. 총 flavonoid 함량 측정은 250 ㎕에 증류수 1 ml와 5% NaN02 75 ㎕를 가한 다음 5분 후 10% AlCl3․6H2O 150 ㎕를 가하고 6분 방치한 뒤 1N NaOH 500 ㎕를 가하였다. 11분 후 흡광도 값을 410 nm에서 측정하였다[22].
- 총 폴리페놀 함량 측정은 Folin-Ciocalteu Reagent가 추출물의 폴리페놀성 화합물에 의해 환원되어 몰리부덴 청색으로 발색하는 원리를 이용하여 분석하였다[21]. 총 flavonoid 함량 측정은 250 ㎕에 증류수 1 ml와 5% NaN02 75 ㎕를 가한 다음 5분 후 10% AlCl3․6H2O 150 ㎕를 가하고 6분 방치한 뒤 1N NaOH 500 ㎕를 가하였다.
- 추출 정제하여 얻은 어류콜라겐 펩타이드 추출액에 대한 성상, 맛 및 냄새 등에 대한 관능 평가를 실시하였고, pH 및 비중 등, 물리적 특성도 측정하였다.
대상 데이터
- 본 실험에서 사용된 재료로는 어류 비늘인 tilapia 종의 비늘로 PT Solid Joint Baru Indonesia 산을 택하였고 동물성 재료인 돈피젤라틴은 국내 (주)삼미젤라틴사의 돈피젤라틴을 구입하여 사용하였다. 그리고 본 실험에 사용된 단백질 가수분해용 효소는 alcalase(Subtilisin EC 3.4.21.62 from Bacillus licheniformis 2.4 AU/㎎), neutrase(EC 3.4.24.28 from Bacillus amyloliquefaciens, 0.8 AU/㎎)는 덴마크 Novozyme 사의 제품을 구입 사용하였다.
- 본 실험에서 사용된 재료로는 어류 비늘인 tilapia 종의 비늘로 PT Solid Joint Baru Indonesia 산을 택하였고 동물성 재료인 돈피젤라틴은 국내 (주)삼미젤라틴사의 돈피젤라틴을 구입하여 사용하였다. 그리고 본 실험에 사용된 단백질 가수분해용 효소는 alcalase(Subtilisin EC 3.
이론/모형
- 어류 비늘에서 콜라겐 펩타이드를 제조하기 위한 방법은 씨엔에이바이오텍(주)의 제조방법[19]에 따라 Fig.2 와 같은 제조 공정에 의하여 제조하였다. 어류콜라겐 펩타이드의 원재료인 어류비늘의 조직을 팽윤시키기 위하여 정제수를 이용하여 1:10의 비율로 침지시키고 shaking incubator에서 55~60℃, 200 rpm으로 30분간 교반하였다.
- 어류콜라겐 펩타이드 추출액에 대한 영양성분 분석은 식품 공전 시험법[20]에 준하여 실시하였고, 조단백 분석은 세미마이크로킬달법으로, 조지방 함량은 에테르 추출법으로 그리고 탄수화물 분석은 벨트란 법으로 분석하였다. 열량 분석은 에크워터계수를 사용하여 계산하였으며 영양성분을 분석한 결과에 의하여 콜라겐 펩타이드 중 어류 비늘에서 추출한 것에는 조단백질 함량에 4.
- 총 항산화력 측정은 ABTS• +cation decolorization assay 방법에 의하여 측정하였다[24].
성능/효과
- 1. 해양성 재료인 어류비늘인 tilapia 종의 비늘을 사용하여 alcalase 및 neutrase 등 단백질 가수분해 효소를 이용하여 분자량이 1,000 ~ 7,500 Da의 분자량 분포로서 평균분자량이 약 1,800정도를 보이는 어류 콜라겐펩타이드(SC, collagen peptide from scale)의 제조 방법을 확립하였다.
- 2. SC에 대한 물리적 특성은 무색 또는 미황색의 원재료 특유의 냄새를 지니는 것이 PC와 비슷한 경향을 나타내었고, 영양성분 및 열량에 있어서도 모두 단백질로서 탄수화물, 조지방분은 나타나지 않았고, 열량에 있어서는 SC의 경우 145.7 Kcal이고 PC의 경우 146.5 Kcal로 거의 차이가 없는 것으로 나타났다.
- 3. 아미노산 조성으로 볼 때 피부의 보습과 탄력에 영향을 주는 아미노산 성분으로서 Hydroxyproline, Glycine, Serine의 함량은 SC에서 PC 보다는 조금 낮은 함량을 보였지만 SC에서도 PC 못지않게 피부의 탄력과 관계되는 피부 조직의 수복 작용의 역할을 할 수 있는 화장품 소재로서의 기능을 갖추고 있었다.
- 4. 콜라겐 펩타이드의 생리활성 시험으로 총 폴리페놀 함량, 총 flavonoid 함량, DPPH 라디칼 소거능, ABTS에 의한 항산화력, ACE 저해활성, SOD유사활성, 아질산염 소거능 및 지질과산화 억제효과를 비교 검토한 결과 콜라겐 펩타이드의 특징인 hydroxy proline와 glycine의 함량이 높고 가용성 콜라겐으로서 생리활성 효과가 우수한 것으로 나타났다.
- SC에 함유된 아질산염 소거능 시험을 pH별로 측정한 결과 pH 1.2에서 SC는 24.2 %이고, PC는 34.8 %였다. 또한 pH 6.
- 어류콜라겐 펩타이드에 아미노산의 조성은 Table 2와 같다. Table 2에서 보는 바와 같이 피부의 보습역할을 하는 주된 인자 중의 하나 인 hydroxyproline의 함량에 있어서 SC에서는 15.76% PC에서는 9.5%로 나타났으며, Glycine의 함량에 있어서는 SC에서 21.03% PC에서는 32.5%를 보였고, Serine의 함량에서는 SC에서 2.68% PC에서는 4.0% 를 지니고 있는 것으로 나타났다. 즉, SC에서도 PC 못지않게 피부의 탄력과 관계되는 피부 조직의 수복 작용의 역할을 함으로서 화장품 소재로서의 기능을 갖추고 있다.
- linoleic acid 모델 시스템을 이용한 지질과산화 억제효과는 1, 3 및 5일의 경과 시간에 따라 측정한 결과 3일 경과인 경우 SC는 28.9 %이고 PC는 30.6 %이었고, 5일 경과 후인 경우 SC는 63.8 %이고 PC는 57.8 %였다. 이는 비교군인 BHA와 vitamine E보다 지질과산화 억제 효과가 높고 경과시간에 따라 약간 차이는 있었지만 증가되는 경향을 가져왔다.
- 이는 전보에서 밝힌 식물성 당단백질[29]보다 낮았다. 따라서 자연의 항산화 효소 중 하나인 SOD는 세포에 해로운 환원된 산소를 과산화수소로 전환시키는 반응을 촉진시키는 효소로서, superoxide anion의 활성을 억제시킬 수 있는 물질이 SC에도 존재하고 있는 것으로 나타났다.
- 4에 나타내었다. 분자량 분포는 Fig. 3과 Fig. 4에서 보는 바와 같이 돈피젤라틴 콜라겐 펩타이드는 1,000~9,900 Da의 넓은 분포 범위를 보이고 있는 반면에 어류비늘 콜라겐 펩타이드는 1,000~7,500 Da의 분자량 분포로서 평균분자량이 약 1,800정도를 보이고 있다. 일반적으로 피부에 흡수 가능한 분자량을 3,000 Da으로 보고 한 바에 따르면 화장품 소재로 이용할 경우 일부는 피부로 흡수되고 일부는 잔존하겠지만 대부분이 피부의 보습 및 코팅효과가 있을 것으로 본다.
- 일반적으로 콜라겐 펩타이드의 아미노산의 구성은 Gly-X-Y 배열이 반복되어 있으며 Gly-X-Y가 Gly-Pro-Hyp 일 때 hydroxyproline 잔기는 pyrroliding 고리의 히드록시 그룹에 의하여 콜라겐 펩타이드 triple helix의 열 안정성을 높여 준다. 아울러 ACE저해활성을 가지는 펩타이드의 아미노산 분석 결과 proline, tyrosine, alanine 및 leucine을 다량 함유하고 있는 것으로 보아 ACE 저해 활성을 가질 것으로 본다.
- 위에서 효소 가수분해에 의하여 얻어진 어류 콜라겐펩타이드를 본 논문 2.3.2의 방법으로 탄수화물, 조단백, 조지방, 회분 및 수분 등의 영양성분과 열량분석 결과 수분을 제거하고 wet basis로 살펴볼 때 조 단백질인 경우 4.0%이고 탄수화물, 조지방분은 거의 나타나지 않았고, 열량에 있어서는 SC의 경우 145.7 Kcal이고 PC의 경우 146.5 Kcal로 거의 차이가 없는 것으로 나타났다.
- 생체 내 항산화 효소중 하나인 SOD는 세포 내 활성산소를 과산화 수소로 전환시키는 반응을 촉진시키는 효소이며 SOD에 의해 생성된 과산화 수소는 catalase 또는 peroxidase에 의해 물 분자와 산소분자로 전환되는 효소 중의 하나이다. 이러한 SOD와 똑같지는 않지만 유사활성 측정방법이 사용되고 있으며 superoxide anion의 활성을 억제시키는 물질 즉, 널리 이용되고 있는 SOD 유사활성을 측정한 결과 100 ppm에서 SC는 11.4 %이고 PC는 7.6 %인데 반하여 500 ppm에서 SC는 15.8 %이고 PC는 13.8 %였다. 이는 전보에서 밝힌 식물성 당단백질[29]보다 낮았다.
- 제조된 어류콜라겐펩타이드는 비교군인 돈피 젤라틴 콜라겐펩타이드(PC, collagen peptide from pig-skin gelatin)와 동일한 농도로 비교 시 두 가지 모두 가용성 콜라겐펩타이드로 무색 또는 미황색이었고, 원재료의 특유의 독특한 냄새가 있지만 강하진 않았다. pH 범위는 SC는 5.
- 2 %이었다. 콜라겐 펩타이드에 함유된 폴리페놀성 물질들의 아질산염 소거능은 pH 6.0인 경우보다 pH 1.2에서 비교적 높은 수치를 보인 바와 같이 함유된 폴리페놀성 화합물 들이 pH가 낮은 조건에서 보다 안정하고 nitrosoamine의 형성을 효과적으로 억제할 수 있을 것으로 본다.
- 콜라겐 펩타이드의 ACE저해 활성을 비교하기 위하여 저해 활성을 측정한 결과 300ppm에서 SC는 40.3 %이고 PC는 44.5 %였다. ACE 저해 활성에 차이가 나는 것은 효소마다 작용하는 기질의 친화성이 있으며 생성된 펩타이드의 말단기에 위치하는 아미노산이 다르고, 펩타이드의 분자량 및 입체구조에 따라 저해 활성에 영향을 주게 된다.
- 콜라겐 펩타이드의 총 항산화활성을 알아보기 위하여 ABTS에 의한 총 항산화 활성을 측정한 결과 SC는 37.10 mgAAeg이고 PC는 73.45 mgAAeg로 SC보다 PC가 약 2배 가량 항산화 활성이 높은 결과를 가져왔다. 이 항산화 활성도는 효소를 이용한 가수분해물을 구성하는 아미노산의 함량보다는 말단에 위치하는 아미노산의 종류에 의해 영향을 받는다.
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