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문제 정의
- 본 고는 미생물 대사공학, 생물전환, 화학공정 기술을 이용하여 hydroquinone, catechol, adipic acid, shikimic acid, gallic acid, pyrogallol, vanillin, p-hydroxycinnamic acid, p-hydroxystyrene, p-hydroxybenzoic acid, indigo, indole 3-acetic acid와 같은 방향족화합물을 어떻게 개발하고 있는지를 논하였다. 또한, 경쟁력있는 화이트바이오텍기반 방향족화합물 생산기술을 개발하기 위한 문제점 및 해결방안등을 논했다.
- 본 고는 미생물 대사공학, 생물전환, 화학공정 기술을 이용하여 hydroquinone, catechol, adipic acid, shikimic acid, gallic acid, pyrogallol, vanillin, p-hydroxycinnamic acid, p-hydroxystyrene, p-hydroxybenzoic acid, indigo, indole 3-acetic acid와 같은 방향족화합물을 어떻게 개발하고 있는지를 논하였다.
- 본 고는 방향족화합물 생합성 대사산물 중에서 벤젠등으로부터 화학적으로 합성되는 화학원료들 중에서 재생가능한 바이오매스로부터 미생물 및 효소들을 이용한 생물공학적 방법으로 대체할 수 있는 화학원료제품(Fig. 2)들을 중심으로 최근의 방향족화합물 생산 미생물을 어떻게 개발하고 있는지를 소개하고, 그 문제점을 극복하기 위한 방안등을 살펴보고자 한다.
제안 방법
- 그 중에서 catechol 생산 효율이 가장 높은 공법은 PCA 생산 경로를 거치는 방법이다. AAA 생합성 공통경로 중간대사체인 DHS를 축적하기 위해서 대장균 염색체상 aroE 변이(aroE353)에 기인한 shikimate dehydrogenase 효소 활성이 소실된 균주를 제작하고(E. coli AB2834), DHQ 합성을 촉진하고 DAHP로부터 탈인산화된 DAP(3-deoxy-D-arabinoheptulosonate)의 생성을 방지하기 위해 aroB를 추가적으로 1 copy 더 염색체상 serA 중간부위에 삽입된 균주를 제작하였다(E. coli KL3). 한편, DHS로부터 PCA의 합성을 촉매하는 3-dehydroshikimate dehydratase 유전자 aroZ, PEP, E4P 및 DAHP pool을 증가시키키 위한 목적으로 유전자 ppsA, tktA 및 AroFFBR, plasmid의 안정성 부여 및 염색체상 파괴된 serA를 복원하기 위한 목적으로 유전자 serA를 모두한 plasmid에 cloning하여 벡터 pWL2.
- coli를 제작하였다. Tyrosine의 탈아미노반응(deamination)에 관여하며, 기존에 보고된 단백질보다 더 tyrosine에 대한 기질친화력이 높은 Rhodotorula glutinis 유래의 pal/tal 유전자[43] 및 pHCA의 탈탄산화를 촉매하는 Lactobacillus plantarum 유래의 pdc 유전자[5]를 plasmid에 cloning하여 tyrosine을 생산하는 E. coli에 형질전환하여 pHS를 생산하는 재조합 대장균을 개발하였다[39, 43]. 10-L 발효조에서 배양한 결과 약 0.
- 5)[44]. 대장균에서 pHBA를 생산하기 위해서는 먼저 chorismate에서 겯가지로 빠지는 경로를 차단하기 위해 chorismate mutaseprephenate dehydratase를 암호화하는 pheA, chorismate mutase-prephenate dehydrogenase를 암호화하는 tyrA, anthranilate synthase를 암호화하는 trpE~C 유전자들이 결손된 대장균을 제작하고 여기에 방향족 공통경로의 탄소흐름을 증가시키기 위해 serA 유전자 부위에 tac promoter에 연결된 aroA, aroL, aroC, aroB 유전자를 추가적으로 1copy 더 삽입한 재조합 E. coli JB161을 개발하였다[1]. 한편, chorismate로부터 pHBA의 합성을 촉매하는 효소의 유전자 ubiC는 aroFFBR, tktA 및 serA와 함께 plasmid에 cloning하여 벡터 pJB2.
- 따라서, 공정의 효율성·경제성을 고려해서 1단계로 미생물을 이용한 직접발효법으로 tyrosine을 생산하고, 2단계로 PAL/TAL을 함유한 세포를 고정화하여 bioconversion법으로 pHCA를 생산하고, 최종적으로 화학적인 방법으로 pHS를 생산하는 방법이 개발되었다.
- 4)[37]. 먼저 AAA 생합성 대사경로의 공통경로 중간대사체인 3-dehydroquinate(DHQ)를 축적하기 위해서 염색체상 aroD 변이(aroD352)에 기인한 3-dehydroquinate dehydratase 효소 활성이 소실된 균주를 제작하고, DAHP로부터 DHQ 합성을 촉매하는 DHQ synthase 활성을 증가시키기 위해서 aroB를 추가적으로 1 copy 더 염색체상 serA 중간부위에 삽입된 균주를 제작하였다(E. coli QP1.1). 한편, 축적된 DHQ는 Klebsiella pneumoniae 유래의 dehydroquinate dehydrogenase(유전자 qad에 의해 암호화) 촉매에 의해서 QA가 생합성될 수 있다.
- 5). 먼저 aroF, aroG, aroL, tyrA 및 tyrB의 발현억제에 관여하는 조절 유전자인 tyrR을 염색체상에서 결손시킨 후 branch pathway인 phenylalanine으로의 탄소흐름을 차단하기 위해서 pheA 유전자를 결손하고, tyrosine 생합성을 촉매하는 tyrA 유전자를 과발현하여 tyrosine을 생산하는 E. coli를 제작하였다. Tyrosine의 탈아미노반응(deamination)에 관여하며, 기존에 보고된 단백질보다 더 tyrosine에 대한 기질친화력이 높은 Rhodotorula glutinis 유래의 pal/tal 유전자[43] 및 pHCA의 탈탄산화를 촉매하는 Lactobacillus plantarum 유래의 pdc 유전자[5]를 plasmid에 cloning하여 tyrosine을 생산하는 E.
- 또 다른 경로는 대장균 유래의 shikimic acid dehydrogenase가 부반응으로 DHQ를 QA로 환원시키는 활성이 알려져 있는데, Ran과 Frost 등은 aroE 유전자를 plasmid에 cloning하여 QA를 축적시키는 결과를 얻었다[37]. 이 재조합 plasmid에 AAA 생합성경로의 첫단계 생성물인 DAHP로의 탄소흐름을 끌어오기 위해서 tyrosine에 의한 feedback inhibition인 해제된 AroFFBR의 유전자와 serA 유전자를 함께 도입한 벡터 pKD12.138을 제작하고, 이를 E. coli QP1.1에 형질전환하여 QA생산 재조합 대장균을 개발하였다. 탄소원으로 포도당을 사용하여 발효를 통해 48시간에 49 g/L QA, 20% mol/mol 수율을 얻었다.
- putida S12 미생물을 이용하여 pHBA를 생산하는 결과를 보고하였다[44]. 즉,기질로부터 tyrosine을 합성하는 탄소흐름이 증가되어 있으며, 생성되는 pHBA의 분해에 관여하는 pobA(p-hydroxybenzoate hydroxylase 유전자)가 결손된 P. putida S12palB1 미생물에 phenylalanine ammonia lyase를 과발현하여 tyrosine으로부터 p-coumarate(4-hydroxycinnamic acid)로 전환시킨 후 세포내 원래 존재하는 효소들에 의해서 최종적으로 pHBA가 축적되는 재조합 Pseudomonas를 개발하였다. 그 결과 glycerol을 탄소원으로 이용하여 pHBA 1.
- 청색염색에 널리 사용되는 색소인 indigo는 트립토판을 생산하는 대장균에서 세포내 존재하는 tryptophanse에 의해서 indole로 전환이 된 후 P. putida 유래의 naphthalene dioxygenase 유전자를 과발현하여 18 g/L 수준의 인디고를 생산하는 재조합대장균을 개발하였다(Fig. 5)[3].
- 그 결과, 탄소원으로 포도당을 사용하여 발효를 통해 48시간에 41 g/L PCA, 부산물로 DAH 15 g/L을 얻었다. 축적되는 PCA의 독성문제를 해결하기 위해 PCA 추출효율이 높은 AG-1 X8 resin으로 packing된 column을 이용한 resin-based extraction법으로 배양액내 PCA농도를 13 g/L 이하로 유지하면서 발효할 경우 PCA 농도 71 g/L, 발효수율 49%, DAH 16 g/L의 결과를 얻었다. 최종적으로, 수용액상에서 PCA를 290°C 이상으로 가열하면 90%이상의 수율로 catechol이 합성되었다.
- coli KL3). 한편, DHS로부터 PCA의 합성을 촉매하는 3-dehydroshikimate dehydratase 유전자 aroZ, PEP, E4P 및 DAHP pool을 증가시키키 위한 목적으로 유전자 ppsA, tktA 및 AroFFBR, plasmid의 안정성 부여 및 염색체상 파괴된 serA를 복원하기 위한 목적으로 유전자 serA를 모두한 plasmid에 cloning하여 벡터 pWL2.46B를 만들고, 이를 E. coli KL3에 형질전환하여 PCA를 생산하는 재조합 대장균을 개발하였다. 그 결과, 탄소원으로 포도당을 사용하여 발효를 통해 48시간에 41 g/L PCA, 부산물로 DAH 15 g/L을 얻었다.
- 한편, PCA를 catechol로 전환시키는 K. pneumoniae 유래의 protocatechuate decarboxylase 유전자 aroY, catechol로부터 cis,cismuconic acid의 합성을 촉매하는 Acinetobacter calcoaceticus 유래의 catechol 1,2-dioxygenase 유전자 aroZ, 그리고 aroFFBR 및 serA를 모두 한 plasmid에 cloning하여 벡터 pWN2.248을 만들고, 이를 E. coli WN1에 형질전환하여 cis,cis-muconic acid를 생산하는 재조합 대장균을 개발하였다.
- coli JB161을 개발하였다[1]. 한편, chorismate로부터 pHBA의 합성을 촉매하는 효소의 유전자 ubiC는 aroFFBR, tktA 및 serA와 함께 plasmid에 cloning하여 벡터 pJB2.274을 만들고, 이를 E. coli JB161에 형질전환하여 pHBA를 생산하는 재조합 대장균을 개발하였다. 그 결과, 탄소원으로 포도당을 사용하여 발효를 통해 pHBA 12 g/L, 수율 13%, 그리고 부산물로 prephenic acid 6.
- 1pts 균주를 제작하였다. 한편, hydroquinone 생산균주 제작에서 언급된 plasmid pKD12.138에 포도당의 세포내 수송시 facilitated diffusion을 매개하며 PEP를 사용하지 않고 직접 인산화시키는 Zymomonas mobilis 유래의 glfglk(glucose facilitator 및 glucose kinase를 암호화하는 유전자)를 cloning하여 최종적으로 pSC6.090B를 제작하고 E. coli SP1.1pts 균주에 형질전환하여 shikimic acid를 생산하는 재조합대장균을 개발하였다. 그 결과, 10-L 발효조에서 shikimic acid 84 g/L, 수율 33%의 매우 높은 기술수준을 얻었다.
대상 데이터
- AroE 효소활성이 상실된 E. coli AB2834의 염색체내에 유전자 serA 및 lacZ부위 안에 각각 aroBaroZ 및 tktAaroZ 유전자들을 삽입한 E. coli WN1를 제작하였다. 한편, PCA를 catechol로 전환시키는 K.
성능/효과
- 따라서, 공정의 효율성·경제성을 고려해서 1단계로 미생물을 이용한 직접발효법으로 tyrosine을 생산하고, 2단계로 PAL/TAL을 함유한 세포를 고정화하여 bioconversion법으로 pHCA를 생산하고, 최종적으로 화학적인 방법으로 pHS를 생산하는 방법이 개발되었다. TAL 효소활성에 대한 pH와 pHCA의 효과를 조사한 결과에 의하면, pH가 올라가면서 pHCA에 의한 product inhibition이 점점 없어지며 pH 9.5에서 생산성은 최대화, product inhibition은 최소화되었다. 그러나, pH 9.
- 1pts 균주에 형질전환하여 shikimic acid를 생산하는 재조합대장균을 개발하였다. 그 결과, 10-L 발효조에서 shikimic acid 84 g/L, 수율 33%의 매우 높은 기술수준을 얻었다. 그런데, 생산되는 shikimic acid는 DHQ, DHS와의 평형반응 및 AroE의 부반응에 의해 QA로의 전환이 이루어져서 부산물로 DHS 10 g/L, QA 2 g/L가 생성되는 문제점이 나타나는데, 향후 이러한 부산물을 더 감소시킬 수 있는 연구가 필요한 상황이다.
- 그 결과, 고정화 촉매반응을 통해 pH 9.8에서 50 g/L의 tyrosine으로부터 250시간의 연속된 재사용공정으로 약 39±4 g/L의 pHCA를 생산하는 결과를 얻었다.
- coli KL3에 형질전환하여 PCA를 생산하는 재조합 대장균을 개발하였다. 그 결과, 탄소원으로 포도당을 사용하여 발효를 통해 48시간에 41 g/L PCA, 부산물로 DAH 15 g/L을 얻었다. 축적되는 PCA의 독성문제를 해결하기 위해 PCA 추출효율이 높은 AG-1 X8 resin으로 packing된 column을 이용한 resin-based extraction법으로 배양액내 PCA농도를 13 g/L 이하로 유지하면서 발효할 경우 PCA 농도 71 g/L, 발효수율 49%, DAH 16 g/L의 결과를 얻었다.
- coli WN1에 형질전환하여 cis,cis-muconic acid를 생산하는 재조합 대장균을 개발하였다. 그 결과, 탄소원으로 포도당을 사용하여 발효를 통해 cis,cis-muconic acid 36.8 g/L, 수율 22%, 그리고 부산물로 DHS 3 g/L, catechol 1.6 g/L을 얻었다. 발효배양액을 활성탄 및 여과법으로 세포를 제거한 액에 10% 백금촉매(Pt on carbon)를 이용하여 3,400 kPa의 수소가스 압력에서 수소화 반응을 시켜 97% 수율로 adipic acid를 얻었다.
- coli JB161에 형질전환하여 pHBA를 생산하는 재조합 대장균을 개발하였다. 그 결과, 탄소원으로 포도당을 사용하여 발효를 통해 pHBA 12 g/L, 수율 13%, 그리고 부산물로 prephenic acid 6.3 g/L, phenylalanine 4.1 g/L, DHS 1.4 g/L가 축적되었다. 생성되는 pHBA는 세포에 대한 독성이 심하며, 낮은 농도에서도 UbiC 효소의 대한 강한 feedback inhibition을 일으키는 문제점이 나타났다[13, 25].
- 최종적으로, 수용액상에서 PCA를 290°C 이상으로 가열하면 90%이상의 수율로 catechol이 합성되었다.
후속연구
- 그 결과, 10-L 발효조에서 shikimic acid 84 g/L, 수율 33%의 매우 높은 기술수준을 얻었다. 그런데, 생산되는 shikimic acid는 DHQ, DHS와의 평형반응 및 AroE의 부반응에 의해 QA로의 전환이 이루어져서 부산물로 DHS 10 g/L, QA 2 g/L가 생성되는 문제점이 나타나는데, 향후 이러한 부산물을 더 감소시킬 수 있는 연구가 필요한 상황이다.
- 근본적으로는 대사특성, 유전자조작·발효·분리의 용이성, 방향족화합물에 대한 내성 등을 고려하여 방향족화합물 생산에 적합한 모균주를 선정한 다음, 기존에 밝혀진 유효한 유전자정보를 토대로 대사공학을 이용하여 중심대사로부터 AAA 경로 초입단계 및 AAA 공통경로로의 탄소흐름이 매우 강화된 기반균주(platform strain)[41]를 제작하고 여기에 각각의 방향족 화합물 합성에 필요한 유전자를 접목하면 보다 더 효율적으로 각종 방향족화합물을 생산하는 균주를 개발할 수 있을 것으로 기대한다.
- 그러나, 이러한 효소들은 아직 생산균주에서 발현의 최적화가 필요하거나, intrinsic catalytic activity가 낮거나, product에 의한 강한 inhibition을 받는 등의 문제점들이 있다. 따라서, metagenome 등으로부터 보다 더 다양한 기질 특이성을 갖는 효소들을 발굴하고, directed evolution 등을 통해 효소의 특성을 개량하는 연구가 요구된다.
- 따라서, 미생물 대사·생리·유전학, 생화학, 효소학, 대사공학, 발효학, 유전체학, 기능유전체학을 포함한 생물학적 분야와 유기합성, 무기화학, 화학공정등을 포함한 화학적 분야가 융합된 연구를 통해 친환경적이며 상업적으로 적용 가능한 기술개발이 필요하다.
- coli ubiC 유전자를 삽입/발현하여 건체중량으로 13~18%의 glucose-conjugative form의 pHBA를 생산하는 연구결과를 발표하였다[46]. 비록 현재는 그 수율이 낮지만 향후 추가적인 기술개발로 pHBA 수율을 올릴 수 있다면 재조합 식물기반 화학원료물질을 생산하는 좋은 예가 될 수 있을 것으로 사료된다.
- 1%를 얻었다[45]. 이는 방향족 화합물 독성에 대한 내성이 강한 미생물이 화학원료물질의 생산용 숙주로 사용가치가 높음을 나타내는 결과라고 볼 수 있으며, 방향족 화합물에 대한 내성 미생물의 스크리닝, 내성 기작의 규명등에 대한 연구가 경쟁력있는 화이트바이오텍기반 방향족화합물 생산 기술개발에 크게 기여할 것으로 사료된다.
- 향후 보다 더 경쟁력을 지닌 생산균주를 개발하기 위해서는 기능유전체 관련기술을 접목한 시스템생물학을 이용하여 총체적인 분석을 통해 대사공학에 접목하는 전략이 필요하다.
- 화학적 전처리 공정, 가수분해를 통한 당류의 회수, 각종 당류를 자화할 수 있는 미생물의 개발등의 공정을 함께 연구되어야 할 것으로 보인다.
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