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문제 정의
- 이를 위해 각각의 유전자를 지닌 재조합균주들에 대한 효소역가 측정 및 전사체 농도를 조사하였다. 실험결과 pSJE6c는 pSJE 보다 외래유전자 발현에 적합함을 확인하여 그 결과를 보고한다.
- 5 내지 2배 정도 더 높았고 이는 6가지 탄소원 모두에서 확인할수 있었다. 이 결과는 aga 고유 promoter보다는 P6C promoter가 aga 유전자 발현에 더욱 적합함을 보여주는 결과로서 강력한 promoter를 지닌 발현벡터 구축의 필요성을 확인시켜준다.
제안 방법
- 균주들을 6가지 다른 탄소원(glucose, galactose, melibiose, raffinose, fructose, sucrose)이 각각 1%씩 포함된 MRS 배지에서 배양하면서 흡광도(OD600)를 측정하여 생육곡선을 작성하였다. 6, 12, 24, 36, 및 48시간대 시료들의 효소역가를 측정하였다. α-Gal 효소역가는 Church 방법[3]을 사용하였다.
- 형질전환은 electroporation으로 Gene PulserII(Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 장치를 사용하였다. E. coli competent cell 제조는 Dower 방법[4]을 사용하였으며, L. brevis competent cell은 Berthier 방법 [2]을 일부 변경하여 사용하였다. L.
- E. coli와 L. brevis 균주의 plasmid DNA 추출은 Qiagenprep spin miniprep kit(Qiagen, Valencia, CA, USA)를 이용하였고, DNA 농도는 spectrophotometer를 이용하여 측정하였다. 형질전환은 electroporation으로 Gene PulserII(Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 장치를 사용하였다.
- 유전자 발현에 사용한 aga와 lacZ PCR 증폭산물을 probe로 사용하였으며, Amersham Alkphos Direct Labeling and Detection System(Amershamn Bioscience)을 이용하여 labeling과 detection을 실시하였다. Hybridization 과정은 ULTRaHYB(Ambion, Austin, TX, USA)를 이용하여 42℃에서 1시간의 prehybridization과 12시간의 hybridization을 실시하였다.
- L. brevis 2.14 재조합 균주들에서 aga와 lacZ 전사체 생성 정도를 확인하기 위하여 slot blot을 실시하였다. L.
- L. brevis 균주를 각각의 탄소원이 1% 포함된 MRS 배지에서 OD600 0.8~1.0까지 배양한 후 세포를 회수하여 Trizolbead법으로 RNA를 추출하였다[8]. RNA는 260과 280 nm에서 흡광도를 측정하여 농도를 구하였다.
- L. brevis 형질전환을 위한 electroporation 조건은 1.5 kV, 200 WWW, 25 µF이며, 충격후 1 mL의 MRS 배지를 첨가하여 2 시간 회복 배양한 다음 Em(5 µg/mL) 첨가 MRS 한천배지에 도말하였다.
- 본 연구에 사용한 균주 및 plasmid들을 Table 1에 나타내 었다. Lactobacillus brevis 2.14 균주는 MRS 배지 (Difco Lab, Detroit, MI, USA)에서 37℃ 정치배양하였고, 탄소원으로 glucose, galactose, melibiose, raffinose, sucrose, fructose, lactose(Sigma, St. Louis, MO, USA)를 각 1% (w/v) 되게 MRS 배지에 첨가하였다. E.
- Lactococcus lactis LM0230에서 분리한 프로모터 P6C를 pSJE에 도입하였다. P6C 염기서열을 지닌 oligonucleotide 쌍을 따로 제조한 후 annealing을 통해 짧은 DNA 단편을 얻어서 제한효소 처리후 pSJE에 도입하여 pSJE6c를 구축하였다. PSJE6c 효능 검증을 위해서 외래 유전자인 aga와 lacZ를 각각 pSJE6c에 도입하였다.
- 각 oligomer를 2 µmol씩 섞은 후에 MJ Mini PCR 기기(Bio-Rad)를 이용하여 94℃에서 5분 가열후 서서히 냉각하는 방법으로 annealing 시켰다. PstI과 BamHI으로 절단한 후 본 연구실에서 개발한 유산균용 셔틀벡터인 pSJE에 도입하였다. α-galactosidase유전자(aga)와 β-galactosidase 유전자(lacZ)는 각각 Leuconostoc mesenteroides SY1[8]과 Lactococcus lactis ssp.
- RNA 10 µg씩을 slot blot 장치 SE646(Amersham Phamarcia Biotech Inc., Uppsala Sweden)를 이용하여 hybond-XL nylon membrane에 고정화시켰다.
- lacZ 유전자를 지닌 형질전환체들을 lactose를 포함한 5종의 탄소원을 포함한 MRS 배지에서 배양한 후 생육곡선을 얻었고(Fig. 4), β-Gal 효소역가를 배양 6, 12, 24, 36 및 48시간대에 측정하였다(Fig. 5).
- 본 연구실에서 개발한, 김치에서 분리한 Leu. mesenteroides SY2 유래 pFMBL1을 바탕으로 구축한 셔틀벡터인, pSJE[7]를 외래유전자 발현에 적합하게 개량한 발현벡터를 구축하였다. Lactococcus lactis LM0230에서 분리한 프로모터 P6C를 pSJE에 도입하였다.
- pSJE6c의 효율성 평가를 위해 유산균에서 유래한 α-galactosidase 유전자(aga)[8]와 β-galactosidase 유전자(lacZ)[10]를 도입하여 Lactobacillus brevis 2.14에서 발현 효율을 조사하였다.
- 각각의 시간대별(6, 12, 24, 36, 48시간) 배양액 1 mL을 원심분리하여 균체를 회수하여 3차 증류수로 1회 세척한 후, 1 mL Z-buffer(Na2HPO4 7H2O 1.61 g, NaH2PO4 H2O 0.55 g, KCl 0.075 g, MgSO4 7H2O 0.0246 g, β-mercaptoethanol 0.27 mL, pH 7.0, 100 mL 최종부피)에 현탁하였다.
- 구축된 발현벡터인 pSJE6c와 원 벡터인 pSJE의 외래유전자 발현 효율 비교를 위하여 두 종류의 외래 유전자를 이들에 각각 도입하였다. 먼저 α-galactosidase 유전자(aga)를 시험하였다.
- 균주들을 6가지 다른 탄소원(glucose, galactose, melibiose, raffinose, fructose, sucrose)이 각각 1%씩 포함된 MRS 배지에서 배양하면서 흡광도(OD600)를 측정하여 생육곡선을 작성하였다. 6, 12, 24, 36, 및 48시간대 시료들의 효소역가를 측정하였다.
- 14에서 발현 효율을 조사하였다. 비교를 위해 이들 유전자의 고유 프로모터에 의한 발현 정도와 비교하였다. 이를 위해 각각의 유전자를 지닌 재조합균주들에 대한 효소역가 측정 및 전사체 농도를 조사하였다.
- 발현벡터 구축에 사용한 promoter는 Jeong 등(2006)[6]이 Lactococcus lactis LM0230 chromosomal DNA에서 분리한 P6C로서 연구를 통해 강력한 promoter임이 보고되었다. 알려진 염기서열을 바탕으로 상보적인 한 쌍의 oligonucleotides(54-mers, Table 2 참조)를 합성하였다(Embiotech, Seoul, Korea). Oligomer들은 STE 완충용액(10 mM Tris, pH 8.
- , Uppsala Sweden)를 이용하여 hybond-XL nylon membrane에 고정화시켰다. 유전자 발현에 사용한 aga와 lacZ PCR 증폭산물을 probe로 사용하였으며, Amersham Alkphos Direct Labeling and Detection System(Amershamn Bioscience)을 이용하여 labeling과 detection을 실시하였다. Hybridization 과정은 ULTRaHYB(Ambion, Austin, TX, USA)를 이용하여 42℃에서 1시간의 prehybridization과 12시간의 hybridization을 실시하였다.
- P6C는 강력한 promoter임이 reporter gene을 이용한 서울대의 실험결과 확인되었고, 그 실험 결과를 구체적으로 살펴보면, 대조구로서 흔히 유산균주의 외래 유전자 발현에 많이 쓰이는 발현벡터인 pMG36e를 프로모터 세기를 비교하기 위해 사용되어졌고, 이는 유산균주에서 강력하게 작동하는 P32라는 프로모터를 가진 벡터로서 P6C와 P32를 비교하였을 때 약 3배정도 높은 프로모터 세기를 나타내었다[6]. 이러한 P6C 프로모터를 이전에 본 연구실에서 개발된 유산균용 셔틀벡터 pSJE[7]에 도입함으로써 발현벡터인 pSJE6c를 구축하였다. pSJE6c의 효율성 평가를 위해 유산균에서 유래한 α-galactosidase 유전자(aga)[8]와 β-galactosidase 유전자(lacZ)[10]를 도입하여 Lactobacillus brevis 2.
- 비교를 위해 이들 유전자의 고유 프로모터에 의한 발현 정도와 비교하였다. 이를 위해 각각의 유전자를 지닌 재조합균주들에 대한 효소역가 측정 및 전사체 농도를 조사하였다. 실험결과 pSJE6c는 pSJE 보다 외래유전자 발현에 적합함을 확인하여 그 결과를 보고한다.
- 그결과 양 끝에 PstI과 BamHI 제한효소 자리를 지닌 54 bp 크기의 P6C promoter DNA 단편을 얻었다. 이를 유산균용 셔틀벡터인 pSJE의 multiple cloning site중 PstI과 BamHI에 도입하여 유전자 발현에 필요한 promoter를 지닌 발현벡터 pSJE6c를 구축하였다(Fig. 1). pSJE6c에는 선택표지로서 항생제 erythromycin 내성 유전자가 있고, 전체 크기는 6.
- 이미 보고된 P6C promoter sequence를 바탕으로 상보적인 염기서열로 이루어진 한 쌍의 oligonucleotides(Table 2)들을 제조하고 이들을 94℃에서 annealing을 실시하였다. 그결과 양 끝에 PstI과 BamHI 제한효소 자리를 지닌 54 bp 크기의 P6C promoter DNA 단편을 얻었다.
- P6C 프로모터와 비교를 위해 고유 프로모터를 지닌 유전자들도 각각 pSJE에 도입하였다. 재조합 plasmid들을 electroporation 방법으로 Lactobacillus brevis 2.14 균주에 도입하고 재조합균주들의 생육곡선과 효소역가 그리고 slot blot으로 전사체 농도를 측정하였다. 결과를 보면 PSJE6c에 클로닝 된 유전자들이 pSJE상의 유전자보다 효소역가들이 약 1.
- 37℃에서 2일간 배양후 분리된 균락들을 얻어서 MRS 액체배지 5 mL에 접종, 배양한후 plasmid를 추출하였다. 제한효소로 절단한 plasmid DNA들은 agarose gel 전기영동으로 그 크기를 확인하였다.
- 5 kb를 증폭하였다. 증폭물의 양 끝은 각각 BamHI과 NotI 제한효소 자리를 가지며 이들 효소로 처리한 후 PSJE6c의 동일 제한효소 자리들에 도입하였다. 그 결과 9 kb 크기의 pSJE6caga를 얻었다(Fig.
대상 데이터
- E. coli DH5α 균주는 Luria-Bertani (LB) 배지에서 37℃ 진탕 배양하였다.
- mesenteroides SY2 유래 pFMBL1을 바탕으로 구축한 셔틀벡터인, pSJE[7]를 외래유전자 발현에 적합하게 개량한 발현벡터를 구축하였다. Lactococcus lactis LM0230에서 분리한 프로모터 P6C를 pSJE에 도입하였다. P6C 염기서열을 지닌 oligonucleotide 쌍을 따로 제조한 후 annealing을 통해 짧은 DNA 단편을 얻어서 제한효소 처리후 pSJE에 도입하여 pSJE6c를 구축하였다.
- P6C 염기서열을 지닌 oligonucleotide 쌍을 따로 제조한 후 annealing을 통해 짧은 DNA 단편을 얻어서 제한효소 처리후 pSJE에 도입하여 pSJE6c를 구축하였다. PSJE6c 효능 검증을 위해서 외래 유전자인 aga와 lacZ를 각각 pSJE6c에 도입하였다. P6C 프로모터와 비교를 위해 고유 프로모터를 지닌 유전자들도 각각 pSJE에 도입하였다.
- 본 연구에서는 김치유산균인 Lactococcus lactis ssp. cremoris LM0230에서 유래한 프로모터 P6C[6]를 발현벡터 제조에 사용하였다. P6C는 강력한 promoter임이 reporter gene을 이용한 서울대의 실험결과 확인되었고, 그 실험 결과를 구체적으로 살펴보면, 대조구로서 흔히 유산균주의 외래 유전자 발현에 많이 쓰이는 발현벡터인 pMG36e를 프로모터 세기를 비교하기 위해 사용되어졌고, 이는 유산균주에서 강력하게 작동하는 P32라는 프로모터를 가진 벡터로서 P6C와 P32를 비교하였을 때 약 3배정도 높은 프로모터 세기를 나타내었다[6].
- 기질은 p-nitrophenyl-α-galactopyranoside(PNPG)를 사용하였으며, 생성되는 p-nitrophenol(PNP)은 흡광도 OD400에서 측정하였다.
이론/모형
- α-Gal 효소역가는 Church 방법[3]을 사용하였다.
- 균주들을 다른 탄소원(glucose, galactose, lactose, raffinose, sucrose)이 각각 1%씩 포함된 MRS 배지에서 배양한 후 β-Gal 효소역가를 Miller의 방법[12]에 준해 측정하였다.
성능/효과
- α-Gal 효소역가 측정결과를 보면(Fig. 4), α-Gal 효소의 기질인 raffinose와 melibiose에서 생육한 세포들이 높은 효소 역가를 나타내었고, 다음으로 galactose, fructose, glucose, sucrose 순으로 나타났다.
- 그렇기에 더욱 인체에 안전한 방법들의 개발을 통해 바람직한 특성을 지닌 균주와 기능성 물질을 생산하는 균주를 얻어야 할 것이다. GMO라는 측면에 있어서는 우선 본 연구에서 개발되어진 벡터 자체가 원래부터 김치 유산균에서 분리해낸 플라스미드를 바탕으로 개발된 벡터로서, 외래 유전자 또한 기존의 다른 유익한 균주들이 만들어내는 유익한 단백질을 만들 수 있는 유전자를 도입함으로써 근본적으로 인체 내에 사용 가능한 플라스미드와 유전자의 사용을 통한 식품용 발현벡터로서 인체에서는 안전할 것으로 판단되어 진다. 하지만 본 연구에서 개발한 발현벡터에 사용되는 항생제 내성 유전자와 같은 마커의 사용으로 인해 식품에서의 직접적인 사용은 현재 불가능한 것으로 판단된다.
- 다음으로 glucose, galactose, raffinose, 및 sucrose 배지순으로 역가가 나타났다. Glucose 배지에서는 12시간 배양 시 1320.74 units로 가장 높은 역가를 나타내다가, 24시간부터는 149 units로 현저히 떨어짐을 확인할 수 있었다. Galactose 배지의 경우, 12시간 배양 시 1124.
- L. brevis 형질전환 효율은 plasmid DNA 1 µg 당 102 형질전환체 정도로 통상 106¯7 형질전환체인 대장균에 비해 효율은 낮았다.
- cremoris LM0230에서 유래한 프로모터 P6C[6]를 발현벡터 제조에 사용하였다. P6C는 강력한 promoter임이 reporter gene을 이용한 서울대의 실험결과 확인되었고, 그 실험 결과를 구체적으로 살펴보면, 대조구로서 흔히 유산균주의 외래 유전자 발현에 많이 쓰이는 발현벡터인 pMG36e를 프로모터 세기를 비교하기 위해 사용되어졌고, 이는 유산균주에서 강력하게 작동하는 P32라는 프로모터를 가진 벡터로서 P6C와 P32를 비교하였을 때 약 3배정도 높은 프로모터 세기를 나타내었다[6]. 이러한 P6C 프로모터를 이전에 본 연구실에서 개발된 유산균용 셔틀벡터 pSJE[7]에 도입함으로써 발현벡터인 pSJE6c를 구축하였다.
- 한편 전사체 농도는 탄소원에 따라 차이가 나는 것을 확인할 수 있었고 raffinose 배양시 가장 강한 시그널을 나타내어서 전사체 농도가 가장 높음을 알수 있었다. Raffinose 다음으로 melibiose, galactose, fructose 순으로 나타났으며 한편 glucose와 sucrose에서는 시그널이 약해서 전사 정도가 미미함을 알수 있었다.
- 14 균주에 도입하고 재조합균주들의 생육곡선과 효소역가 그리고 slot blot으로 전사체 농도를 측정하였다. 결과를 보면 PSJE6c에 클로닝 된 유전자들이 pSJE상의 유전자보다 효소역가들이 약 1.5배에서 2배 정도로 높았다. 전사체 농도 측정 결과도 pSJE6c 들에서 더 많은 전사체가 생성됨을 보여주었다.
- Raffinose와 sucrose의 경우, 6~24시간 배양 시 150~300 units, 36~48시간 배양 시는 1~50 units로 모든 시간대에서 전체적으로 낮은 역가를 나타내었다. 그리고 역시 lacZ 유전자가 고유 프로모터에 의해 발현되는 pSJEZ 보다는 P6C promoter에 의한 유전자 발현이 일어나는 pSJE6Z를 지닌 균주들의 역가가 휠씬 높게 나타남을 확인할 수 있었다. 이 결과는 P6C promoter도입에 의해 비단 aga 뿐만 아니라 다른 유전자 발현도 증가됨을 보여주는 결과이다.
- 이는 효소역가 측정 결과와도 비슷한 결과이다. 또한 P6C 프로모터를 지닌 균주가 자체 프로모터를 지닌 균주보다 조금 더 강한 시그널을 보임을 확인할 수 있었고 이는 aga에서와 마찬가지였다.
- Lactose 배지에서 가장 고 농도의 전사체가 검출되었고, 다음으로 glucose와 galactose에서 검출되었다. 반면에 raffinose나 sucrose 배지에서는 다른 탄소원들보다 상대적으로 낮은 전사체 농도가 검출되었다. 이는 효소역가 측정 결과와도 비슷한 결과이다.
- 이 결과는 P6C promoter도입에 의해 비단 aga 뿐만 아니라 다른 유전자 발현도 증가됨을 보여주는 결과이다. 이로 미루어 pSJE6c는 Lactobacillus brevis와 다른 유산균주들에서 여러 외래유전자들의 발현에 유용한 발현벡터임을 확인할 수 있었다.
- 이상 결과들로 볼 때 Leuconostoc - E. coli shuttle vector인 pSJE에 Lactococcus lactis 유래의 강력한 promoter인 P6C를 도입한 pSJE6c는 외래유전자 발현에 보다 적합한 발현벡터임이 입증되었다. pSJE6c는 앞으로 김치유산균을 숙주로 한 외래유전자 발현실험에서 매우 유용하게 사용될 것으로 전망된다.
- 전사체 농도 측정 결과도 pSJE6c 들에서 더 많은 전사체가 생성됨을 보여주었다. 이상 결과들은 효율적인 발현벡터들의 사용을 통해서 김치유산균에서 외래유전자 발현 효율을 높일 수 있음을 보여준다.
- 5배에서 2배 정도로 높았다. 전사체 농도 측정 결과도 pSJE6c 들에서 더 많은 전사체가 생성됨을 보여주었다. 이상 결과들은 효율적인 발현벡터들의 사용을 통해서 김치유산균에서 외래유전자 발현 효율을 높일 수 있음을 보여준다.
- 38 U/mg protein) 배양시 역가가 가장 높았다. 한편 Fig 3의 결과를 살펴보았을 때, pSJE6caga를 지닌 균주는 pSJEaga를 지닌 균주와 비교할 때 효소역가가 1.5 내지 2배 정도 더 높았고 이는 6가지 탄소원 모두에서 확인할수 있었다. 이 결과는 aga 고유 promoter보다는 P6C promoter가 aga 유전자 발현에 더욱 적합함을 보여주는 결과로서 강력한 promoter를 지닌 발현벡터 구축의 필요성을 확인시켜준다.
- 6-a). 한편 전사체 농도는 탄소원에 따라 차이가 나는 것을 확인할 수 있었고 raffinose 배양시 가장 강한 시그널을 나타내어서 전사체 농도가 가장 높음을 알수 있었다. Raffinose 다음으로 melibiose, galactose, fructose 순으로 나타났으며 한편 glucose와 sucrose에서는 시그널이 약해서 전사 정도가 미미함을 알수 있었다.
후속연구
- coli shuttle vector인 pSJE에 Lactococcus lactis 유래의 강력한 promoter인 P6C를 도입한 pSJE6c는 외래유전자 발현에 보다 적합한 발현벡터임이 입증되었다. pSJE6c는 앞으로 김치유산균을 숙주로 한 외래유전자 발현실험에서 매우 유용하게 사용될 것으로 전망된다.
- 하지만 개량된 종균의 사용은 발효식품에 있어서 새로운 기능성 부여나 안전성 개선에 있어서 매우 효과적일 것이라고 생각된다. 그렇기에 더욱 인체에 안전한 방법들의 개발을 통해 바람직한 특성을 지닌 균주와 기능성 물질을 생산하는 균주를 얻어야 할 것이다. GMO라는 측면에 있어서는 우선 본 연구에서 개발되어진 벡터 자체가 원래부터 김치 유산균에서 분리해낸 플라스미드를 바탕으로 개발된 벡터로서, 외래 유전자 또한 기존의 다른 유익한 균주들이 만들어내는 유익한 단백질을 만들 수 있는 유전자를 도입함으로써 근본적으로 인체 내에 사용 가능한 플라스미드와 유전자의 사용을 통한 식품용 발현벡터로서 인체에서는 안전할 것으로 판단되어 진다.
- 김치유산균에 관한 많은 연구들이 이루어졌지만, 대부분은 균 분리와 동정, 생육특성 및 생화학적 특성 조사 등이고, 분자생물학적 연구나 종균 개발에 관한 연구는 매우 부족한 실정이다(문헌조사결과, 2009년 6월). 대량 생산되는 김치의 고품질화 및 일정한 품질 유지를 위해서는 종균 사용이 바람직하며 이를 위해서는 김치유산균의 기초연구를 통한 제반 특성들의 이해와 함께 분자생물학적 연구나 유전공학적 방법을 포함하여 다양한 방법으로 종균을 개량하는 연구들이 필요하리라 생각된다.
- 즉, 효율적인 외래 유전자 발현을 통해 유산균에서 경제적 가치가 큰 유용물질들을 생산할 수 있다. 또한 개발될 기술들을 김치 제조에 사용한다면 새로운 개념의 고 기능성, 고품질 김치 제조도 가능해 질 것이다.
- 하지만 유전자 재조합 기술을 통한 균주개량 방법에 있어서 GMO에 대한 법적인 허용문제와 국민들의 인식에 의한 거부감 등으로 인해 유전공학의 적용을 통한 균주 개량은 많이 제한되고 어려운 실정이다. 하지만 개량된 종균의 사용은 발효식품에 있어서 새로운 기능성 부여나 안전성 개선에 있어서 매우 효과적일 것이라고 생각된다. 그렇기에 더욱 인체에 안전한 방법들의 개발을 통해 바람직한 특성을 지닌 균주와 기능성 물질을 생산하는 균주를 얻어야 할 것이다.
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