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문제 정의
- 또한 저온추출물들을 대상으로 Wnt, peroxisome proliferator-activated receptor-γ (PPAR-γ), Substance-P assay를 실시하여 각 추출물들이 두피 개선에 줄 수 있는 효능을 확인하고자 하였다.
- 따라서 본 연구에서는 검은콩, 작약, 녹차 추출물을 저온용출법과 열수법을 이용하여 각각 제조하고, 이들의 항산화력을 비교하여 추출방법에 따른 효능의 변화를 파악하려 하였다. 또한 저온추출물들을 대상으로 Wnt, peroxisome proliferator-activated receptor-γ (PPAR-γ), Substance-P assay를 실시하여 각 추출물들이 두피 개선에 줄 수 있는 효능을 확인하고자 하였다.
- Substance P는 피부세포에서 분비되는 신경전달물질(neurotransmitter)로써, 피부의 신경섬유를 직접 자극하거나 비만세포(mast cell)의 히스타민(histamine) 분비를 촉진해서 피부에서 가려움을 느끼게 한다[12]. 샴푸에 들어 있는 계면 활성제들은 피부에 잔류하였을 경우에 붉은 반점, 가려움 등의 피부 자극을 일으킴이 알려져 있는 바, 본 실험에서는 대표적인 계면활성제인 ALES 와 녹차 냉침 추출물에 의한 피부세포에서 Substance-P의 변화를 살펴보고, 이를 토대로 녹차 냉침 추출물이 피부 가려움증을 억제 할 수 있는지를 평가하였다.
- 이번 연구는 원료에서 유효성분의 추출방법이나 기간에 따라서 추출물의 효능이 달라질 수 있는지를 살펴보고 검은콩, 작약, 녹차 저온용출물의 두피에서의 효능을 도출하는 것을 목적으로 진행되었다.
제안 방법
- 저온용출 추출물은 각 원료(검은콩 100 g, 녹차잎 2.86 g, 작약 10 g)를 200 mL의 정제수에 넣은 후 실온(18 ℃ ∼ 22 ℃)에서 1 ∼ 3주 동안 유지시켜서 원료의 유효성분이 정제수로 우러나오게 하는 방법을 사용하여 제조하였다.
- Trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC) assay를 통해서 각 추출물들의 자유 라디칼(free radical) 소거 능력을 측정하여 항산화 능력을 평가하였다. 7 mM 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABST, Sigma, USA)와 2.
- 최종 반응물은 734 nm에서 흡광도를 측정해서 남아있는 ASBT free radical들의 양을 측정한다. 이때 기준물질인 trolox를 사용하여 동일한 반응을 시켜 봄으로써 실험계의 정상작동 여부를 확인하고, 결과값은 추출물을 처리하지 않은 군을 대조군으로 하여 상대적인 항산화 능력을 평가하였다.
- 배양 배지를 페니실린-스트렙토마이신이 없는 배지로 교환하고, Opti-MEM (Gibco, USA) 50 µL, TOP-Flash plasmid (Invitrogen, USA) 0.7 µg, β-galactosidase plasmid 0.3 µg, Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA) 6 µL를 반응시켜 만든 혼합액을 각 well의 세포 배양배지 위에 뿌려 주는 방식으로 세포에 plasmid들을 transfection시켰다.
- 사람의 각질형성세포인 HaCaT세포를 1 × 105의 농도로 12-well plates에 분주하여 24 h 동안 배양한 후 페놀레드(phenol-red)가 없는 투명한 DMEM (Lonza, USA)에 2 % 우태아혈청과 100 units/mL 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 Substance-P assay용 배지로 교체하였다.
- Transfection 다음날 특정 농도로 추출물들을 처리하고 상기 2.4.2.와 같은 방법으로 luciferase assay를 실시하여 각 추출물의 PPAR-γ 활성능력을 비교하였다.
- Microtube에 DMEM (Lonza, USA) 50 µL, PPRE-tkLuc plasmid 0.1 µg, PPAR-γ expression plasmid 0.01µg, β-galactosidase plasmid 0.4 µg, 물에 1/10,000로 희석한 polyethylenimine (PEI, Sigma, USA) 수용액 1.5µL를 반응시켜 만든 혼합액을 각 well의 세포 배양배지 위에 뿌려주는 방식으로 세포에 plasmid들을 transfection시켰다.
- 각 실험군의 Wnt 활성도를 각각의 β-galactosidase의 활성도로 나누어 실험 군간 transfection 효율 차이를 보정하였으며, 이 보정값을 통계처리하여 추출물의 최종 Wnt 활성능력을 도출하였다.
- 또한 cell lysate에 동량의 2X β-galactosidase enzyme assay buffer (Promega, USA)를 처리하고 37 ℃에서 1 h 동안 반응시킨 후 420 nm 파장에서 흡광도를 측정함으로써 각 실험군의 β-galactosidase 활성도를 측정하였다.
- 각 실험군의 Wnt 활성도는 정제된 cell lysate에 luciferase substrate (Promega, USA)을 4 : 1비율로 혼합하고, Luminometer (TD-20/20, Turner Designs, USA)로 방출되는 빛의 양을 측정함으로써 비교하였다. 또한 cell lysate에 동량의 2X β-galactosidase enzyme assay buffer (Promega, USA)를 처리하고 37 ℃에서 1 h 동안 반응시킨 후 420 nm 파장에서 흡광도를 측정함으로써 각 실험군의 β-galactosidase 활성도를 측정하였다.
- 의 농도로 12-well plates에 분주하여 24 h 동안 배양한 후 페놀레드(phenol-red)가 없는 투명한 DMEM (Lonza, USA)에 2 % 우태아혈청과 100 units/mL 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 Substance-P assay용 배지로 교체하였다. 교체한 assay용 배지에 각 추출물들을 처리하고, 24 h 후에 ammonium laureth sulfate (ALES)를 1.0 ppm 의 농도로 처리하였다. ALES 처리 24 h 후에 배지를 걷어내어 마이크로 튜브로 옮기고, 4 ℃에서 12,000 rpm으로 3 min 동안 원심분리해서 배지 내 잔여물을 제거하여 Substance-P assay에 필요한 배지를 얻었다.
- 검은콩, 작약, 녹차의 항산화 효능은 이미 보고되어 있으므로, 추출 방법에 따른 효능의 차이가 나타날 수 있는 지를 알아보기 위하여 우선 저온용출물과 열수 추출물의 항산화 효능을 비교하였다. 그 결과 저온용출 추출물의 항산화 효능이 열수 추출물 보다 뛰어나며, 용출 기간에 따라 항산화력이 달라짐을 알 수 있었다(Figure 1).
- 상기 3.1.의 실험결과에서 저온용출물 들의 항산화 효능이 용출 기간에 따라 변함을 알 수 있었으므로, 1 ∼ 3주차의 저온용출물들을 대상으로 Wnt 신호전달 활성화를 관찰하였다.
- CV-1 세포와 PPRE-tk-luc vector를 이용해서 작약 저온용출물의 PPAR-γ의 trans-activation 활성화 유도 여부를 관찰하였다.
- 검은콩 저온용출물이 Wnt 신호전달을 활성화 시킬 수있는지를 확인하기 위해서, Wnt 신호전달계가 발달되어 있는 C3H10T1/2 세포와 Wnt 신호전달 활성화를 감시할 수 있는 TOP-Flash 벡터를 이용해서 TOP-Flash assay를 수행하였다. 상기 3.
- C3H cells were transiently transfected with TOP-Flash plasmid vector and treated with 10 % of black bean extract with various extraction periods (1 ~ 3) for 24 h. After the treatment, cells were harvested and luciferase assay was performed to evaluate the Wnt signaling activation. Data represents the means ± S.
- 인간 각질형성세포인 HaCaT에 ALES를 1 ppm 농도로 처리한 후, 가려움 유발 인자인 Substance-P의 발현 변화를 관찰하였다. 실험 결과 ALES는 Substance-P의 발현을 대조군 대비 약 2배 정도 증가시켰지만, ALES 처리 전에 녹차 저온용출물을 처리한 실험군들에서는 발현 증가 정도가 점차 감소하는 추세가 관찰되었다.
대상 데이터
- 인간 각질형성세포인 HaCaT 세포와 아프리카 녹색원숭이 신장 상피세포인 CV-1 세포는 10 % 우태아혈청과 100 unit/mL 페니실린-스트렙토마이신을 첨가한 Dulbecco’s modified Eagle's medium (DMEM, Lonza, USA)에 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 배양하였다.
- 생쥐 배아섬유아세포(mouse embryonic fibroblasts)인 C3H10T1/2 cell은 American type culture collection (ACTT, Rockville, USA)에서 구입하였으며, 10 % 우태아혈청(fetal bovine serum, Lonza, USA), 100 unit/mL 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin, GIBCO, USA), 0.5 % non-essential amino acid (NEAA, GIBCO, USA)이 들어 있는 minimum essential medium-α (MEM-α, GIBCO, USA)에 넣고 37℃, 5 % CO2 조건에서 배양하였다.
데이터처리
- 실험은 3회 이상 반복하여 평균값과 표준 오차를 구하고, 미니탭 통계 소프트웨어(MinitabⓇ, Minitab Inc, USA)의 이표본 t 검정을 이용하여 데이터의 유의수준을 평가하였다.
이론/모형
- Substance-P assay는 준비된 세포 배지를 Substance-P ELISA kit (USCN&LIFE, USA)을 이용하여 수행하였으며, 세부 수행방법은 제조사의 지침을 따랐다.
성능/효과
- 45 µm filter (Milipore, USA)에 통과시켜서 원료와 오염물질들을 제거하였고, 효능 성분의 손실이 없도록 4 ℃에서 냉장보관하며 실험에 사용하였다. 따라서 실험에 사용한 저온용출과 열수 추출물들의 최종 농도는 동일하며, 각 추출물들에서 고형분은 관찰되지 않았다. 또한 본 실험의 목적이 추출물들의 효능 평가에 초점이 맞춰져 있는 관계로 주성분의 정량 및 정성 분석은 수행하지 않았다.
- 검은콩, 작약, 녹차의 항산화 효능은 이미 보고되어 있으므로, 추출 방법에 따른 효능의 차이가 나타날 수 있는 지를 알아보기 위하여 우선 저온용출물과 열수 추출물의 항산화 효능을 비교하였다. 그 결과 저온용출 추출물의 항산화 효능이 열수 추출물 보다 뛰어나며, 용출 기간에 따라 항산화력이 달라짐을 알 수 있었다(Figure 1). 이 현상은 저온용출 추출물이 열수 추출물보다 더 많은 양의 항산화 성분을 포함하며, 장기간의 저온 용출 과정중에도 항산화 성분이 파괴되지 않음을 보여준다.
- 의 실험결과에서 저온용출물 들의 항산화 효능이 용출 기간에 따라 변함을 알 수 있었으므로, 1 ∼ 3주차의 저온용출물들을 대상으로 Wnt 신호전달 활성화를 관찰하였다. 실험 결과 배지부피 10 %의 3주차 검은콩 저온용출물을 첨가한 배양배지를 처리한 실험군에서 대조군 대비 약 5.4배의 TOP-Flash 활성이 관찰되었으며, 이 결과는 검은콩 저온용출물이 Wnt 신호전달을 활성화 시킬 수 있음을 말해준다(Figure 2).
- 또한 검은콩과는 달리 작약은 저온용출 기간이 길어질수록 PPAR-γ 활성 능력이 떨어지는 것도 알 수 있었다(Figure 3).
- 또한 검은콩 저온용출물은 모낭 주기를 조절하는 Wnt 신호전달을 활성화시켜서 모낭(모근)을 강화하고 모발을 건강하게 하는 효능, 작약 저온용출물은 각질 형성세포와 피지세포의 분화를 조절하는 PPAR-γ를 활성화 시켜서 두피 항상성 유지를 통한 내적인 보습 효능, 그리고 녹차 저온용출물은 가려움을 유발하는 염증매개인자인 Substance-P의 발현을 억제해서 두피의 가려움을 완화시키는 효능을 도출할 수 있었다.
- 인간 각질형성세포인 HaCaT에 ALES를 1 ppm 농도로 처리한 후, 가려움 유발 인자인 Substance-P의 발현 변화를 관찰하였다. 실험 결과 ALES는 Substance-P의 발현을 대조군 대비 약 2배 정도 증가시켰지만, ALES 처리 전에 녹차 저온용출물을 처리한 실험군들에서는 발현 증가 정도가 점차 감소하는 추세가 관찰되었다. 이번 실험에서 녹차 저온용출물의 ALES에 의한 SubstanceP 발현 억제 능력은 저온용출 기간에 따라 증가하였다(Figure 4).
- 실험 결과 ALES는 Substance-P의 발현을 대조군 대비 약 2배 정도 증가시켰지만, ALES 처리 전에 녹차 저온용출물을 처리한 실험군들에서는 발현 증가 정도가 점차 감소하는 추세가 관찰되었다. 이번 실험에서 녹차 저온용출물의 ALES에 의한 SubstanceP 발현 억제 능력은 저온용출 기간에 따라 증가하였다(Figure 4).
- 실험 결과, 저온용출법에 의한 추출물이 열수 추출물보다 평균 2배 이상으로 강화된 항산화력을 보유하며, 최고의 효능을 나타낼 수 있는 저온용출 기간은 원재료와 활성화시키려는 대상(target)에 따라서 달라짐을 알 수 있었다. 또한 검은콩 저온용출물은 모낭 주기를 조절하는 Wnt 신호전달을 활성화시켜서 모낭(모근)을 강화하고 모발을 건강하게 하는 효능, 작약 저온용출물은 각질 형성세포와 피지세포의 분화를 조절하는 PPAR-γ를 활성화 시켜서 두피 항상성 유지를 통한 내적인 보습 효능, 그리고 녹차 저온용출물은 가려움을 유발하는 염증매개인자인 Substance-P의 발현을 억제해서 두피의 가려움을 완화시키는 효능을 도출할 수 있었다.
- 결론적으로 검은콩, 작약, 녹차 저온용출물은 모근 강화, 보습, 가려움 완화 효능을 통해서, 두피와 모발을 모두 건강하게 유지할 수 있게 하는 두피 개선 효능을 제공한다.
- 실험 결과 1 %의 1주차 작약 저온용출 물을 첨가한 실험군에서 대조군 대비 약 1.5배의 PPAR-γ에 대한 trans-activation 활성화를 관찰할 수 있었다.
후속연구
- 따라서 실험에 사용한 저온용출과 열수 추출물들의 최종 농도는 동일하며, 각 추출물들에서 고형분은 관찰되지 않았다. 또한 본 실험의 목적이 추출물들의 효능 평가에 초점이 맞춰져 있는 관계로 주성분의 정량 및 정성 분석은 수행하지 않았다.
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