[논문]Real-time PCR을 이용한 돼지써코바이러스 감염증 진단법 연구

김은경; 황보원; 이종민; 손병국; 박호정; 김도경

Real-time PCR을 이용한 돼지써코바이러스 감염증 진단법 연구
Rapid detection and quantification of porcine circovirus type 2 (PCV 2) DNA in Real-time PCR 원문보기

韓國家畜衛生學會誌 = Korean journal of veterinary service, v.32 no.4, 2009년, pp.299 - 306

김은경 (경상남도축산진흥연구소) , 황보원 (경상남도축산진흥연구소) , 이종민 (경상남도축산진흥연구소) , 손병국 (경상남도축산진흥연구소) , 박호정 (경상남도축산진흥연구소) , 김도경 (경상남도축산진흥연구소)

Abstract ▼ AI-Helper

Assay for the detection and quantification of porcine circovirus type 2 (PCV 2) with the real-time PCR were developed. TaqMan probe real-time using a set of primer/probe was developed for detection of PCV 2. In this study we applied real-time PCR assay to 320 samples, collected from pig farms. In 151 of 320 samples, PCV 2 DNA was detected by conventional PCR assay. All samples positive for PCV 2 DNA in conventional PCR assay were also positive in Real-time PCR assay, but 69 of 169 samples that tested negative for PCV 2 DNA in conventional assay were tested positive in TaqMan probe real-time PCR assay. The test of TaqMan probe real-time PCR resulted in detection and quantification limits of 101 copies per sample. TaqMan probe real-time PCR assay increased the number of samples in which PCV 2 was detected by 21%. TaqMan probe real-time PCR assay is very efficient method in contrast to the conventinal PCR, becoming increasingly important method for gene analysis.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

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제안 방법

Conventional PCR을 위하여 DW 6.5µl, Taq master mix 12.5µl(Promega M7122), forward primer 20pmol 0.5µl, reverse primer 20pmol 0.5µl 그리고 DNA template 5µl를 PCR tube에 넣은 후 혼합액을 thermal cycler (Biometra T-gradient)에서 증폭하였으며, 음성대 조군으로 멸균증류수를 이용하였고 양성대조군으로 PCV 2 DNA(100 ~107 copies)를 이용하였다.
Primers와 probe는 GenBank accession number AF027217과 국내외에서 분리 보고된 다수의 porcine circovirus type2 (PCV 2) 유전자 염기서열을 검색하여 가장 적합한 ORF2 부위를 선택하였다. Conventional PCR을 위한 primers는 박 등이 진단용으로 제시한 sequence를 적용하였고, SYBR Green real-time PCR을 위한 Primers는 IDT Scitools (Integrated DNA Technologies)로 선정하여 (주)제노텍에서 각각 제작하여 사용하였다. TaqMan probe real-time PCR을 위한 Primers와 probe는 Beacon Designer Software (PRE-MIER Biosoft International)로 선정하여 (주)바이오니아에 의뢰하여 제작하였으며, Probe의 5′에는 Fluore-scein인 FAM을, 그리고 3′에는 Quencher인 BHQ를 부착하였다(Table 1).
PCR 증폭산물 DNA 확인은 증폭산물 10µl, loading buffer (0.03% bromophenol blue, 30% glycerol, 30mM EDTA, 0.03% xylene cyanol) 2µl과 혼합한 후 0.002% ethidium bromide를 첨가한 1% agarose gel에 loading 하여 90V에서 1시간동안 전기영동을 실시한 다음 UV light로 조사하여 501bp를 확인하였다.
PCR을 위한 Template DNA는 QIAamp DNA mini kit (QIAGEN)를 이용하여 추출하였으며, 추출한 DNA는 분광광도계(Nanodrop ND-1000)를 이용하여 OD 260에서 농도를 측정하였다.
Primers와 probe는 GenBank accession number AF027217과 국내외에서 분리 보고된 다수의 porcine circovirus type2 (PCV 2) 유전자 염기서열을 검색하여 가장 적합한 ORF2 부위를 선택하였다. Conventional PCR을 위한 primers는 박 등이 진단용으로 제시한 sequence를 적용하였고, SYBR Green real-time PCR을 위한 Primers는 IDT Scitools (Integrated DNA Technologies)로 선정하여 (주)제노텍에서 각각 제작하여 사용하였다.
Real-time PCR을 이용하여 돼지써코바이러스 감염증에 대한 진단법을 확립하였다. PCV type 2 감염실태를 파악하기 위하여 경남지역에서 돼지를 사육하고 있는 480농가를 중심으로 기존 PCR 검사법을 이용하여 농장별 양성율을 조사한 결과 총 480농가 가운데 235 농가에서 PCV 2가 확인되어 49.
SYBR Green real-time PCR 반응 조건은 95℃에서 10분간 predenaturation 시킨 후, 95℃에서 30초 denuaturation, 60℃에서 30초 annealing, 72℃에서 30초 동안 extension을 40회 반복 실시한 다음, 마지막으로 95℃에서 30초 denuaturation, 60℃에서 30초 annealing, 95℃에서 30초 동안 denuaturation을 1회 실시하였으며, extension을 실시할 때마다 복제된 target 부위 157bp 내에 끼어들어 간 SYBR Green fluorescence를 탐지하고 처음 탐지된 cycle수(Ct)는 amplification plots로 표현하였다. 이때 탐지된 fluorescence는 primer간의 dimer 형성을 확인하기 위해 melting temperature를 분석한 dissociation curve로 검증하였다.
SYBR Green real-time PCR을 위하여 2×Brilliant II SYBR Green QPCR Master Mix 10µl, dH2O 4µl, sense primer 10pmol 0.5µl, antisense primer 10pmol 0.5µl, DNA template 5µl로 Total 20µl를 PCR tube에 넣은 후 혼합액을 Real-time thermal cycler (STRATAGENE Mx3000P)에서 증폭하였으며 음성대조군으로 멸균증류수를 이용하였고 양성대조군으로 PCV 2 DNA (100 ~107 copies)를 이용하였다.
TaqMan probe real-time PCR 반응 조건은 95℃에서 10분간 predenaturation 시킨 후, 95℃에서 20초 denuaturation, 56℃에서 1분 annealing을 40회 반복 실시하였고, annealing 반응 중에 Quencher로부터 분리된 fluorescein FAM이 활성화 될 때마다 fluorescence를 탐지하고 처음 탐지된 cycle 수(Ct)는 amplification plots로 표현하였다. Taqman probe real-time PCR 검사로 복제된 증폭산물은 크기가 99bp이며 이 중 65bp는이 실험에서 제작되어 적용된 primer와 probe가 차지하게 된다.
TaqMan probe real-time PCR을 위하여 2×Brilliant II QPCR Master Mix 10µl, dH 2 O 5.5µl, sense primer 10pmol 0.5µl, antisense primer 10pmol 0.5µl, probe 10pmol 0.5µl, DNA template 3µl로 Total 20µl를 PCR tube에 넣은 후, 혼합액을 Real-time thermal cycler (STRATAGENE Mx3000P)에서 증폭하였으며 음성대조군으로 멸균증류수를 이용하였고 양성대조군으로 PCV 2 DNA(100 ~107 copies)를 이용하였다.
TaqMan probe real-time PCR을 위한 Primers와 probe는 Beacon Designer Software (PRE-MIER Biosoft International)로 선정하여 (주)바이오니아에 의뢰하여 제작하였으며, Probe의 5′에는 Fluore-scein인 FAM을, 그리고 3′에는 Quencher인 BHQ를 부착하였다(Table 1).
이 연구에서는 먼저 경남지역의 PCV 2 감염실태를 파악하기 위하여 돼지를 사육하고 있는 480농가를 중심으로 기존 PCR을 이용하여 농장별 양성율을 조사하였고, 다음으로 기존 PCR 결과 양성 판정된 35농가와 음성 판정된 35농가에서 한 농가당 4~5두씩 총 320두에 대한 시료를 기존 PCR, SYBR Green real-time PCR 및 TaqMan probe real-time PCR에 적용하여 검사방법에 따른 개체별 양성율과 검출한계를 비교하였다.
SYBR Green real-time PCR 반응 조건은 95℃에서 10분간 predenaturation 시킨 후, 95℃에서 30초 denuaturation, 60℃에서 30초 annealing, 72℃에서 30초 동안 extension을 40회 반복 실시한 다음, 마지막으로 95℃에서 30초 denuaturation, 60℃에서 30초 annealing, 95℃에서 30초 동안 denuaturation을 1회 실시하였으며, extension을 실시할 때마다 복제된 target 부위 157bp 내에 끼어들어 간 SYBR Green fluorescence를 탐지하고 처음 탐지된 cycle수(Ct)는 amplification plots로 표현하였다. 이때 탐지된 fluorescence는 primer간의 dimer 형성을 확인하기 위해 melting temperature를 분석한 dissociation curve로 검증하였다.

대상 데이터

2006년부터 2007년까지 경남도내 480농가에서 돼지 혈액검사를 목적으로 우리 연구소에 의뢰된 1,900여두의 혈액을 시료로 사용하였으며 그 중 검사방법에 따른 개체별 양성율 조사를 위하여 320두의 시료를 사용하였다.

성능/효과

PCV 2는 1982년 돼지신장세포주(PK-15, ATCCCCL 33)에서 분리된 PCV1(porcine circovirus type 1)과는 다르게 분류되는데, PCV1과 PCV 2는 서로 병원성이 다를 뿐 아니라 유전자의 염기서열에서도 큰 차이가 있음을 확인할 수 있다. 두 바이러스는 전체적으로는 유사한 구조를 가지고 있으나 세부 유전자별로 다양한 차이가 있다.
Real-time PCR을 이용하여 돼지써코바이러스 감염증에 대한 진단법을 확립하였다. PCV type 2 감염실태를 파악하기 위하여 경남지역에서 돼지를 사육하고 있는 480농가를 중심으로 기존 PCR 검사법을 이용하여 농장별 양성율을 조사한 결과 총 480농가 가운데 235 농가에서 PCV 2가 확인되어 49.0%의 양성율을 나타내었다. 검사방법에 따른 개체별 양성율을 조사한 결과 기존 PCR은 47.
SYBR Green real-time PCR 반응에서 PCV 2 특이산물을 복제하는 매 cycle마다 SYBR Green fluorescence를 탐지하였으며 40 cycle을 반복한 결과 amplification plots를 확인할 수 있었다. 그리고 탐지된 fluorescence가 특이한 melting temperature로 이루어졌는지 dissociation curve로 검증할 수 있었으며, 음성대조군은 모두 음성으로 판정되었고 양성대조군은 PCV 2 DNA 10² copies 이상의 농도에서 양성으로 판정되었다(Fig.
TaqMan probe real-time PCR 반응에서 PCV 2 특이 산물을 복제하는 매 cycle마다 Quencher로부터 분리된 fluorescein FAM을 탐지하였으며 40 cycle을 반복한 결과 amplification plots를 확인할 수 있었으며 음성대조군은 모두 음성으로 판정되었고 양성대조군은 PCV 2 DNA 10¹ copies 이상의 농도에서 양성으로 판정되었다(Fig. 5).
검사 결과를 방법별로 비교하여 보면 기존 PCR 분석법의 경우 시료 320건 중 151건에서 PCV 2가 검출 되었으며 기존 PCR에서 양성으로 판정된 151건 모두 SYBR Green real-time PCR 및 TaqMan probe real-time PCR에서 양성이었다. 그런데 기존 PCR에서 음성으로 판정된 169건 가운데 SYBR Green real-time PCR에서는 38두, TaqMan probe real-time PCR에서는 69두가 양성으로 판정되었다.
검사방법별 검출한계를 비교하기 위하여 기존 PCR법과 SYBR Green real-time PCR 및 TaqMan probe real-time PCR에 대하여 양성대조군 PCV 2 DNA를 10⁰ ~10⁷ copies로 희석하여 검사한 결과 기존 PCR 분석법의 경우 10³ copies 이상의 농도까지는 양성으로 판정되었으나, 10² copies 이하에서는 501bp의 특이 유전자를 확인할 수 없었다(Fig. 2).
0%의 양성율을 나타내었다. 검사방법에 따른 개체별 양성율을 조사한 결과 기존 PCR은 47.2%, SYBR Green real-time PCR은 59.1%, TaqMan probe real-time PCR은 68.8%이었다. 기존 PCR 분석법의 경우 개체별 시료 320건 중 151건에서 PCV 2가 검출되었으며 기존 PCR에서 양성으로 판정된 151건 모두 SYBR Green Real-time PCR 및 TaqMan probe Real-time PCR에서 양성이었다.
그런데 기존 PCR에서 음성으로 판정된 169건 가운데 SYBR Green real-time PCR에서는 38두, TaqMan probe real-time PCR에서는 69두가 양성으로 판정되었다. 검출한계를 비교하기 위하여 양성대조군 PCV 2 DNA를 10⁰ ~10⁷ copies로 희석하여 검사하였을 때 기존 PCR 분석법의 경우 10³ copies 이상의 농도까지 양성으로 판정되었고 SYBR Green real-time PCR의 경우 10² copies 이상의 농도까지 양성으로 판정되었으며 TaqMan probe real-time PCR에서는 10¹ copies 까지 양성으로 판정되었다. 즉 TaqMan probe real-time PCR 분석법은 기존 PCR 분석법과 비교하여 PCV 2 검출 시료수를 21%까지 증가시킨 것으로 나타났다(Table 2).
검출한계를 비교하기 위하여 양성대조군 PCV 2 DNA를 10¹ ~10⁷ copies로 희석하여 검사하였을 때 기존 PCR 분석법의 경우 10³ copies 이상의 농도까지 양성으로 판정되었고 SYBR Green real-time PCR의 경우 10² copies 이상의 농도까지 양성으로 판정되었으며 TaqMan probe real-time PCR에서는 10¹ copies 까지 양성으로 판정되었다. TaqMan probe real-time PCR은 PCV 2 검출 및 정량에 매우 효과적인 검사법으로 판단된다.
경남지역의 PCV 2 감염실태 파악을 위하여 기존 PCR을 실시하였을 때 양성 판정된 35농가와 음성 판정된 35농가에서 한 농가당 4~5두씩 총 320두에 대한 시료를 기존 PCR, SYBR Green real-time PCR 및 TaqMan probe real-time PCR에 적용하여 검사방법에 따른 개체별 양성율을 조사한 결과 기존 PCR은 47.2%, SYBR Green real-time PCR은 59.1%, TaqMan probe real-time PCR은 68.8%의 양성율을 보였다.
경남지역의 PCV 2 감염실태를 파악하기 위하여 돼지를 사육하고 있는 480농가를 중심으로 기존 PCR을 이용하여 농장별 양성율을 조사한 결과 총 480농가 가운데 235농가에서 써코바이러스가 확인되어 49.0%의 양성율을 나타내었다. 2005년 10월 사단법인 전국양돈 협회에서 조사한 농장감염률 52.
SYBR Green real-time PCR 반응에서 PCV 2 특이산물을 복제하는 매 cycle마다 SYBR Green fluorescence를 탐지하였으며 40 cycle을 반복한 결과 amplification plots를 확인할 수 있었다. 그리고 탐지된 fluorescence가 특이한 melting temperature로 이루어졌는지 dissociation curve로 검증할 수 있었으며, 음성대조군은 모두 음성으로 판정되었고 양성대조군은 PCV 2 DNA 10² copies 이상의 농도에서 양성으로 판정되었다(Fig. 3, 4).
8%이었다. 기존 PCR 분석법의 경우 개체별 시료 320건 중 151건에서 PCV 2가 검출되었으며 기존 PCR에서 양성으로 판정된 151건 모두 SYBR Green Real-time PCR 및 TaqMan probe Real-time PCR에서 양성이었다. 그러나 기존 PCR에서 음성으로 판정된 169건 가운데 SYBR Green real-time PCR에서는 38두, TaqMan probe realtime PCR에서는 69두가 양성으로 판정되었다.
6%보다 조금 낮은 수치로 나타났지만, 우리 도 역시 많은 농가에 PCV 2가 감염되어 있다는 것을 알 수 있었다. 농장별 양성율을 돼지 사육 규모별로 비교하였을 때 500두 이상을 사육하는 양돈농가는 380농가 가운데 179농가(47.1%), 500두 미만을 사육하는 양돈농가는 100농가 가운데 56농가(56.0%)에서 써코바이러스가 확인되었다. 복제된 증폭산물을 전기영동 하여 501bp의 특이 유전자를 증폭할 수 있었으며 음성대조군은 모두 음성으로 판정되었다(Fig.
copies 이상으로 검출되었으며 기존 PCR에서 음성으로 판정되었던 조직 시료가 real-time PCR에서는 양성으로 판정되어 기존 PCR보다 real-time PCR에서 양성율이 15% 증가하였다고 보고하였다. 또한 real-time PCR 검사법은 PCV 2 DNA에 대하여 10³ ~10¹¹ copies 범위에서 뛰어난 검출력을 가지며 기존 PCR 보다 PCV 2를 진단하는 데 있어 더욱 유용한 방법인 것으로 평가하였다.
0%)에서 써코바이러스가 확인되었다. 복제된 증폭산물을 전기영동 하여 501bp의 특이 유전자를 증폭할 수 있었으며 음성대조군은 모두 음성으로 판정되었다(Fig. 1).
즉 TaqMan probe real-time PCR 분석법은 기존 PCR 분석법과 비교하여 PCV 2 검출 시료수를 21%까지 증가시킨 것으로 나타났으며 이러한 결과는 검사방법에 따라 DNA 검출한계가 다르기 때문인 것으로 추정된다. 양성대조군 PCV 2 DNA를 10⁰ ~10⁷ copies로 희석하여 검출한계를 비교하였을 때 기존 PCR 분석법의 경우에는 시료내의 DNA 농도가 10³ copies 이상인 경우에만 target 부위를 증폭할 수 있었으나 TaqMan probe real-time PCR에서는 10¹ copies 농도까지 증폭이 가능하여 PCV 2 DNA 검출능력이 매우 뛰어난 것으로 추정된다.
이 연구에서는 검사방법에 따른 개체별 양성율을 조사하였으며 총 320건의 시료를 동시에 적용하였을 때 기존 PCR은 47.2%, SYBR Green real-time PCR은 59.1%, TaqMan probe real-time PCR은 68.8%의 양성율을 보였으며, 기존 PCR에서 음성으로 판정된 169건 가운데 SYBR Green real-time PCR에서는 38두, TaqMan probe real-time PCR에서는 69두가 양성으로 판정된 것을 알 수 있었다. 즉 TaqMan probe real-time PCR 분석법은 기존 PCR 분석법과 비교하여 PCV 2 검출 시료수를 21%까지 증가시킨 것으로 나타났으며 이러한 결과는 검사방법에 따라 DNA 검출한계가 다르기 때문인 것으로 추정된다.
이 연구에서도 PCV 2 감염실태를 파악하기 위한 conventional PCR의 primers로 박과 김(2004)이 제시한 sequence를 적용하여 농장별 양성율을 조사하였고 총 480농가 가운데 235농가에서 써코바이러스가 확인되어 49.0%의 양성율을 나타내었다.
이 연구에서도 TaqMan probe real-time PCR은 실시간으로 미량의 DNA를 신속하게 검출하였고 시료 내의 DNA 농도까지 파악할 수 있었다. 이러한 결과는 real-time PCR이 단순히 바이러스를 분리하는데 그치는 것이 아니라 감염의 정도까지 추정할 수 있다는 여러 연구자들의 결과와도 유사한 것으로 판단된다.
검출한계를 비교하기 위하여 양성대조군 PCV 2 DNA를 10⁰ ~10⁷ copies로 희석하여 검사하였을 때 기존 PCR 분석법의 경우 10³ copies 이상의 농도까지 양성으로 판정되었고 SYBR Green real-time PCR의 경우 10² copies 이상의 농도까지 양성으로 판정되었으며 TaqMan probe real-time PCR에서는 10¹ copies 까지 양성으로 판정되었다. 즉 TaqMan probe real-time PCR 분석법은 기존 PCR 분석법과 비교하여 PCV 2 검출 시료수를 21%까지 증가시킨 것으로 나타났다(Table 2).
8%의 양성율을 보였으며, 기존 PCR에서 음성으로 판정된 169건 가운데 SYBR Green real-time PCR에서는 38두, TaqMan probe real-time PCR에서는 69두가 양성으로 판정된 것을 알 수 있었다. 즉 TaqMan probe real-time PCR 분석법은 기존 PCR 분석법과 비교하여 PCV 2 검출 시료수를 21%까지 증가시킨 것으로 나타났으며 이러한 결과는 검사방법에 따라 DNA 검출한계가 다르기 때문인 것으로 추정된다. 양성대조군 PCV 2 DNA를 10⁰ ~10⁷ copies로 희석하여 검출한계를 비교하였을 때 기존 PCR 분석법의 경우에는 시료내의 DNA 농도가 10³ copies 이상인 경우에만 target 부위를 증폭할 수 있었으나 TaqMan probe real-time PCR에서는 10¹ copies 농도까지 증폭이 가능하여 PCV 2 DNA 검출능력이 매우 뛰어난 것으로 추정된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	Porcine circovirus type 2란?	Porcine circovirus type 2 (PCV 2)는 Circoviridae에속하며 직경이 17nm 정도로 작은 원형의 singlestranded DNA 바이러스이다. PCV 2는 1990년대 후반에 이유자돈전신소모성증후군(postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS) 증상을 보이는 돼지에서 분리되어 지속적으로 연구되고 있으며 거의 세계적으로 광범위하게 분포되어 있는 것으로 알려져 있다.
	PMWS의 주 감염대상은?	PCV 2는 1990년대 후반에 이유자돈전신소모성증후군(postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS) 증상을 보이는 돼지에서 분리되어 지속적으로 연구되고 있으며 거의 세계적으로 광범위하게 분포되어 있는 것으로 알려져 있다. PMWS는 주로 생후 6~8주령의 젖 뗀 어린돼지들이 불량한 사육환경에서 바이러스나 세균 등 여러 가지 병원체에 복합 감염되어 발생하며, 감염된 돼지는 식욕감퇴, 전신쇠약, 황달, 호흡기 증상 등을 나타내는 것으로 보고되고 있다(Straw 등, 1999).
	Porcine circovirus type 2의 진단법은?	PCV 2의 진단은 중합효소연쇄반응법(PCR)이 주로 사용되고 있으며, 그 밖의 진단법으로는 간접형광항체 검사법, 조직진단법, 면역조직화학염색법, 전자현미경 검사법 등이 있다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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