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문제 정의
- 들잔디의 최적 조직배양 조건을 확립하기 위하여 들잔디 성숙종자로부터 재분화능이 높은 배발생 캘러스 유도효율에 미치는 몇 가지 요 인에 관하여 조사하였다. 성죽종자의 소독은 30% (v/v) NaOCl 농도로 60분간 처리 하였을 때 가장 낮은 오염율과 가장 높은 캘러스 유도 효율을 보였다.
- 그러나 좀 더 효율적인 유전자 형질전환체계 확립을 위해서는 재현성 높은 고효율 재분화 체계의 확립이 필수적인 선결 조건이다. 따라서 본 연구에서는 식물체 재분화율이 높은 캘러스인 배발생 캘러스를 효율적으로 유도 할 수 있는 조건을 확립함으로서 차후 Agro- bacterium을 이용한 고효율 형질전환 체계 확립을 위한 기반을 확립하고자 실시하였다.
제안 방법
- 4 g/L MS (Murashige & Skoog, 1962), 30 g/L sucrose, 3 g/L Gel rite]를 직경 80mm 크기의 petri-dish 한 plate당 약 50 ml씩 분주하였다. 50 ml 고체 배지가 들어있는 한 plate에 소독한 종자를 10개씩 32 plate를 치상하고 오염된 종자와 오염되지 않은 종자의 개수를 헤아려 오염정도를 관찰하였다.
- 처리시간별 살균효과의 비교는 30% NaOCl (v/v) 용액에서 10분, 30분, 60분간 각각 처리한 후 살균한 종자는 멸균수로 3 회 세정한 후 멸균된 filter paper에 옮겨 물기를 제거하였다. 그 후 캘러스 유도를 위한 기본적인 고체 캘러스 유도 배지 [4.4 g/L MS (Murashige & Skoog, 1962), 30 g/L sucrose, 3 g/L Gel rite]를 직경 80mm 크기의 petri-dish 한 plate당 약 50 ml씩 분주하였다. 50 ml 고체 배지가 들어있는 한 plate에 소독한 종자를 10개씩 32 plate를 치상하고 오염된 종자와 오염되지 않은 종자의 개수를 헤아려 오염정도를 관찰하였다.
- 들잔디의 종자로부터 배발생 캘러스 유도 시에 미치는 종자소독 조건에 따른 효율을 조사하기 위하여, NaOCl의 농도와 처리시간에 따른 종자 오염율을 측정하였다. 그 결과 NaOCl의처리농도에 따른 오염율은 5%(v/v) 처리구에서 가장 높게 나타났으며, 30% 처리구에서 가장 낮게 나타났다 (Table 1).
- 들잔디의 종자배양에 있어서 캘러스 유도 배지에 첨가되는 생장조절물질의 종류와 농도에 따른 배발생 캘러스의 유도효율을 규명하기 위하여 각각의 옥신 종류와 농도를 단용 또는 혼용처리하여 첨가한 배지에서 배발생 캘러스의 유도율을 조사하여 본 결과를 Table 3에 나타내었다. 전체적으로 2, 4-D, NAA, Dicamba 등의옥신을 단용처리 했을 때보다 혼용처리 했을 때, 배발생 캘러스 유도에 있어서 효율적인 것으로 나타났다.
- 캘러스 유도시의 식물 생장조절제의 종류에 따른 배발생 캘러스의 유도효율을 조사하기 위하여 상기의 캘러스 유도배지에 식물생장조절물질로는 옥신류로 2, 4-D (2, 4-dichloro- phenoxyacetic acid), dicamba (3, 6-dichloro-o-anisic acid) 및 NAA (a-naphthalene acetic acid)를 단용 또는 혼용 첨가한 배지를 사용하였다. 배지첨가물질의 효과를 조사하기 위하여 caseinhydrolysate, L-proline, AgNOj 및 cysteine을 캘러스 유도배지에 농도별로 첨가한 후 배 발생 캘러스의 유도율을 조사하였다. 배발생 캘러스형성율은 각각의 처리구에 살균된 종자를 치상한 다음, 24±2。(:의 생장실에서 암조건으로 4주간 배양한 후, 종자로부터 형성된 캘러스들 중 노란색을 띠며 치밀한 조직 구조의 캘러스인 배 발생 캘러스만을 조사하여 치상한 종자에 대한 배 발생 캘러스의 수를 백분율로 나타내었다.
- 종자의 살균은 이 등 (2003)의 방법에 준하여 다음과 같이 실시하였다. 즉 종자상으로부터 구입한 종자의 종피를 제거하지 않은 그대로의 종자를 70% 에탄올 (v/v)에서 1분간 살균한 후, NaOCl 농도가 각각 5%, 20%, 30%, 40% (v/v)인 용액에서 30분간 처리하여 비교하였다. 처리시간별 살균효과의 비교는 30% NaOCl (v/v) 용액에서 10분, 30분, 60분간 각각 처리한 후 살균한 종자는 멸균수로 3 회 세정한 후 멸균된 filter paper에 옮겨 물기를 제거하였다.
- 즉 종자상으로부터 구입한 종자의 종피를 제거하지 않은 그대로의 종자를 70% 에탄올 (v/v)에서 1분간 살균한 후, NaOCl 농도가 각각 5%, 20%, 30%, 40% (v/v)인 용액에서 30분간 처리하여 비교하였다. 처리시간별 살균효과의 비교는 30% NaOCl (v/v) 용액에서 10분, 30분, 60분간 각각 처리한 후 살균한 종자는 멸균수로 3 회 세정한 후 멸균된 filter paper에 옮겨 물기를 제거하였다. 그 후 캘러스 유도를 위한 기본적인 고체 캘러스 유도 배지 [4.
대상 데이터
- 들잔디 종자로부터 배발생 캘러스 유도조건을 확립하기 위한 식물재료로서 들잔디 품종 중 Zenith, 를 이용하였다. 종자의 살균은 이 등 (2003)의 방법에 준하여 다음과 같이 실시하였다.
- 기본배지 (Murashige & Skoog, 1962)를 사용하였다. 캘러스 유도시의 식물 생장조절제의 종류에 따른 배발생 캘러스의 유도효율을 조사하기 위하여 상기의 캘러스 유도배지에 식물생장조절물질로는 옥신류로 2, 4-D (2, 4-dichloro- phenoxyacetic acid), dicamba (3, 6-dichloro-o-anisic acid) 및 NAA (a-naphthalene acetic acid)를 단용 또는 혼용 첨가한 배지를 사용하였다. 배지첨가물질의 효과를 조사하기 위하여 caseinhydrolysate, L-proline, AgNOj 및 cysteine을 캘러스 유도배지에 농도별로 첨가한 후 배 발생 캘러스의 유도율을 조사하였다.
성능/효과
- 배발생 캘러스 유도효율에 대한 실험 결과는 Table 4와 같다. Casein hydrolysate가 캘러스유도에 있어서 Img의 농도로 처리 하였을 때 16.3%의 유도효율로서 3 mg/L의 농도로 처리하였을 때보다 높게 나타났고, L-proline을 500 mg/L의 농도로 첨가했을 때 15.0%로 100 mg/L의 농도로 처리한 것보다 약간 높은 배 발생 캘러스 유도효율을 나타냈다. 이 두 첨가물질의 배발생 캘러스 유도효율에 있어 효과적인 농도인 casein hydrolysate lg/L과 L-proline500 mg/L을 혼용처리하여 실험한 결과, 단용처리보다 배발생 캘러스 유도효율에 있어서 큰차이는 보이지 않았다 (Table 4).
- 오염율을 측정하였다. 그 결과 NaOCl의처리농도에 따른 오염율은 5%(v/v) 처리구에서 가장 높게 나타났으며, 30% 처리구에서 가장 낮게 나타났다 (Table 1).
- 배발생 캘러스 유도효율을 조사한 결과는Table 6과 같다. 단용처리구의 경우 30 g/L glucose 첨가구가 15%로서 가장 높은 배 발생 캘러스 유도효율을 보였으며, 15 g/L glucose와 maltose 15 g/L를 혼용처리 했을 때 16%의 가장 높은 배발생 캘러스 유도효율을 보였다 (Table 6). 본 연구에서 얻어진 배발생 캘러스의 유도효율은 지금까지 보고되었던 결과 (이등, 2004)에 비해 배발생 캘러스의 17.
- 2). 따라서 배발생 캘러스 유도를 위한 종자소독 조건은 30% (v/v) NaOCl로 60분간 소독하는 것이 배발생 캘러스 유도에 있어 가장 효율적임을 알 수 있었다. 이러한 결과는 이전 보고되었던 연구결과(이 등,2004)인 30% NaOCl 30분 처리에 비해 NaOCl의 처리농도는 동일하나, 처리시간은 30분 정도 더 길게 하는 것이 낮은 오염율을 나타내었다.
- 이와 같은 낮은 배 발생 캘러스의 유도효율은 종피를 제거하지 않고 캘러스 유도배지에 치상한 것과, 종자 보존 기간이 길었던 재료를 사용함에 따른 종자 활력의 차이에 기인한 것으로 추측된다. 또한 2, 4-D 와 dicamba 또는 NAA를 혼용 처리하였을 때의 다소 높은 배발생 캘러스 유도효율은 2, 4-D 단용 처리시 얻었던 높은 캘러스 유도효율의 결과와 dicamba 또는 NAA 단용 처리시의 효과가 서로 배가됨으로써 배발생 가능성이 높은 세포들의 분열속도를 촉진 했을 것으로 추측된다. 이러한 효과는 2, 4-D와 dicamba를 혼용 처리했을 때 더욱 상승되는 것으로 추측된다.
- 처리보다 효율적인 것을 알 수 있었다.또한 배지첨가물질로는 1 g/L casein hydrolysate 과 500 mg/L L-proline를 첨 가해주고, 항산화제인 5 mg/L AgNCh와 20 mg/L cysteine을 첨가해주는 것이 가장 효율적이었으며, 탄소원으로는15 g/L glucose와 15 g/L sucrose를 동시에 첨가해주는 것이 들잔디 종자배양시 배발생 캘러스 유도에 가장 적합한 조직배양조건임을 나타낸다. 본 연구에서 개발된 이와 같은 효율적인 배 발생 캘러스 유도 체계는 식물체 재분화 및 형질전환 기술을 이용한 들잔디 분자육종기술 개발에 유용하게 이용될 것으로 판단된다.
- 옥신류의 혼용처리에 따른 배 발생 캘러스 유도효율은 2,4-D와 diacamba를 각각 3 mg/L로 혼용처리 하였을 때 가장 높은 배발생 캘러스 유도효율을 나타내었다. 배지첨 가 물질 처리에 따른 캘러스 유도효율은 1 & casein hydrolysate와 500 mg/L L-proline를 동시에 첨가해 주었을 때 높은 효율을 나타내었으 며, 항산화제로는 5 mg/L AgNCh와 20 mg/L cysteine 동시에 첨가해 주었을 때 가장 높은 효율을 나타내었다. 탄소원 종류에 따른 배발생 캘러스 유도효율은 15 g/L glucose와 15 g/L sucrose를 혼용처리 하였을 때 가장 높은 배발생 캘러스 유도효율을 나타내었다.
- 단용처리구의 경우 30 g/L glucose 첨가구가 15%로서 가장 높은 배 발생 캘러스 유도효율을 보였으며, 15 g/L glucose와 maltose 15 g/L를 혼용처리 했을 때 16%의 가장 높은 배발생 캘러스 유도효율을 보였다 (Table 6). 본 연구에서 얻어진 배발생 캘러스의 유도효율은 지금까지 보고되었던 결과 (이등, 2004)에 비해 배발생 캘러스의 17.5%로서 비교적 낮은 수준에 속하는 결과이다. 이러한 결과는 연구자들의 배발생 캘러스의 판정 기준이 약간씩 다른데 따른 차이로 추측된다.
- 이러한 결과는 연구자들의 배발생 캘러스의 판정 기준이 약간씩 다른데 따른 차이로 추측된다. 본 연구에서는 엄밀하게 종자로부터 형성된 캘러스들 중 노란색의 compact한 조직을 가지는 캘러스만을 배발생 캘러스로 판정하였기 때문에 일반적인 캘러스 유도율과 직접비교하면 낮은 효율로 계산되었을 가능성이 큰 것으로 추측된다.
- 들잔디의 최적 조직배양 조건을 확립하기 위하여 들잔디 성숙종자로부터 재분화능이 높은 배발생 캘러스 유도효율에 미치는 몇 가지 요 인에 관하여 조사하였다. 성죽종자의 소독은 30% (v/v) NaOCl 농도로 60분간 처리 하였을 때 가장 낮은 오염율과 가장 높은 캘러스 유도 효율을 보였다. 옥신류의 혼용처리에 따른 배 발생 캘러스 유도효율은 2,4-D와 diacamba를 각각 3 mg/L로 혼용처리 하였을 때 가장 높은 배발생 캘러스 유도효율을 나타내었다.
- 전체적으로 2, 4-D, NAA, Dicamba 등의옥신을 단용처리 했을 때보다 혼용처리 했을 때, 배발생 캘러스 유도에 있어서 효율적인 것으로 나타났다. 옥신 종류별로는 2, 4-D가 NAA 에 비해 다소 높은 효율을 보였으며, Dicamba 의 경우 8.3%로 훨씬 낮은 유도효율을 나타내었다. 이러한 결과는 종자로부터 유도되는 모든 캘러스의 유도율을 조사한 이 등(2004)의 결과와 유사한 경향을 보였다.
- 성죽종자의 소독은 30% (v/v) NaOCl 농도로 60분간 처리 하였을 때 가장 낮은 오염율과 가장 높은 캘러스 유도 효율을 보였다. 옥신류의 혼용처리에 따른 배 발생 캘러스 유도효율은 2,4-D와 diacamba를 각각 3 mg/L로 혼용처리 하였을 때 가장 높은 배발생 캘러스 유도효율을 나타내었다. 배지첨 가 물질 처리에 따른 캘러스 유도효율은 1 & casein hydrolysate와 500 mg/L L-proline를 동시에 첨가해 주었을 때 높은 효율을 나타내었으 며, 항산화제로는 5 mg/L AgNCh와 20 mg/L cysteine 동시에 첨가해 주었을 때 가장 높은 효율을 나타내었다.
- 즉 캘러스 유도율과 배발생 캘러스 유도효율을 직접 비교할 수는 없으나, 전체적으로 2, 4-D가 NAA에 비해 다소 높은 캘러스 유도효율을 나타내었다. 옥신류의 혼용처리에 따른 배발생 캘러스 유도효율은 2, 4-D와 dicamba를 혼용 처리하였을 때, 17.5%로서 가장 높은 배발생 캘러스 유도효율을 나타내었고, dicamba와 NAA의 혼용처리의 경우 12.9%의 가장 낮은 배발생 캘러스 유도효율이 관찰되었다 (Table 3). 이와 같은 낮은 배 발생 캘러스의 유도효율은 종피를 제거하지 않고 캘러스 유도배지에 치상한 것과, 종자 보존 기간이 길었던 재료를 사용함에 따른 종자 활력의 차이에 기인한 것으로 추측된다.
- 0%로 100 mg/L의 농도로 처리한 것보다 약간 높은 배 발생 캘러스 유도효율을 나타냈다. 이 두 첨가물질의 배발생 캘러스 유도효율에 있어 효과적인 농도인 casein hydrolysate lg/L과 L-proline500 mg/L을 혼용처리하여 실험한 결과, 단용처리보다 배발생 캘러스 유도효율에 있어서 큰차이는 보이지 않았다 (Table 4).
- 이상과 같은 실험결과를 종합해보면, 종피를 제거하지 않고 효율적인 배발생 캘러스를 유도하기 위해서는 먼저 30% NaOCl(v/v)의 농도로60분간 소독을 하고, 옥신류인 2, 4-D와 dicamba 을 각 3 mg/L의 농도로 처리하는 것이 옥신의단용 처리보다 효율적인 것을 알 수 있었다.또한 배지첨가물질로는 1 g/L casein hydrolysate 과 500 mg/L L-proline를 첨 가해주고, 항산화제인 5 mg/L AgNCh와 20 mg/L cysteine을 첨가해주는 것이 가장 효율적이었으며, 탄소원으로는15 g/L glucose와 15 g/L sucrose를 동시에 첨가해주는 것이 들잔디 종자배양시 배발생 캘러스 유도에 가장 적합한 조직배양조건임을 나타낸다.
- 전체적으로 2, 4-D, NAA, Dicamba 등의옥신을 단용처리 했을 때보다 혼용처리 했을 때, 배발생 캘러스 유도에 있어서 효율적인 것으로 나타났다. 옥신 종류별로는 2, 4-D가 NAA 에 비해 다소 높은 효율을 보였으며, Dicamba 의 경우 8.
- 이러한 결과는 종자로부터 유도되는 모든 캘러스의 유도율을 조사한 이 등(2004)의 결과와 유사한 경향을 보였다. 즉 캘러스 유도율과 배발생 캘러스 유도효율을 직접 비교할 수는 없으나, 전체적으로 2, 4-D가 NAA에 비해 다소 높은 캘러스 유도효율을 나타내었다. 옥신류의 혼용처리에 따른 배발생 캘러스 유도효율은 2, 4-D와 dicamba를 혼용 처리하였을 때, 17.
- 배지첨 가 물질 처리에 따른 캘러스 유도효율은 1 & casein hydrolysate와 500 mg/L L-proline를 동시에 첨가해 주었을 때 높은 효율을 나타내었으 며, 항산화제로는 5 mg/L AgNCh와 20 mg/L cysteine 동시에 첨가해 주었을 때 가장 높은 효율을 나타내었다. 탄소원 종류에 따른 배발생 캘러스 유도효율은 15 g/L glucose와 15 g/L sucrose를 혼용처리 하였을 때 가장 높은 배발생 캘러스 유도효율을 나타내었다. 이와 같은 조직배양조건에 관한 결과들은 금후 고효율 들 잔디 형질전환체계 확립에 있어서 매우 유용하 게 활용될 수 있을 것이다
- 한편 배지첨가물질로서 항산화제를 단용처리와 각각의 농도에 따른 캘러스 유도효율 실험에서는 AgNOj 5 mg/L 첨가 하였을 때 cysteine 20 mg/L 첨가 하였을 때가 유도 효율이 높았으며 AgNOa 5 mg/L와 cysteine 20 mg/L을 혼용처리 하였을 때 16.9%로 단용 처리시 보다 높은 캘러스 유도효율을 나타내었다 (Table 5).
- 한편, 30% NaOCl (v/v) 농도 처 리구에서 처리시간을 달리하여 오염정도를 조사한 결과, 60분간 소독처리한 것이 가장 낮은 오염율을 나타내었다(Table 2). 따라서 배발생 캘러스 유도를 위한 종자소독 조건은 30% (v/v) NaOCl로 60분간 소독하는 것이 배발생 캘러스 유도에 있어 가장 효율적임을 알 수 있었다.
후속연구
- 또한 배지첨가물질로는 1 g/L casein hydrolysate 과 500 mg/L L-proline를 첨 가해주고, 항산화제인 5 mg/L AgNCh와 20 mg/L cysteine을 첨가해주는 것이 가장 효율적이었으며, 탄소원으로는15 g/L glucose와 15 g/L sucrose를 동시에 첨가해주는 것이 들잔디 종자배양시 배발생 캘러스 유도에 가장 적합한 조직배양조건임을 나타낸다. 본 연구에서 개발된 이와 같은 효율적인 배 발생 캘러스 유도 체계는 식물체 재분화 및 형질전환 기술을 이용한 들잔디 분자육종기술 개발에 유용하게 이용될 것으로 판단된다.
- 탄소원 종류에 따른 배발생 캘러스 유도효율은 15 g/L glucose와 15 g/L sucrose를 혼용처리 하였을 때 가장 높은 배발생 캘러스 유도효율을 나타내었다. 이와 같은 조직배양조건에 관한 결과들은 금후 고효율 들 잔디 형질전환체계 확립에 있어서 매우 유용하 게 활용될 수 있을 것이다
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