곰취 메탄올 추출물의 생리활성 및 암세포 증식억제 효과 Physiological Activity of Methanol Extracts from Ligularia fischeri and Their Hyperplasia Inhibition Activity of Cancer Cell원문보기
곰취(Ligularia fischeri)의 이용성을 높이데 필요한 기초자료를 확보하고자 메탄올을 용매로 하여 추출 온도 및 시간에 따른 생리활성 효과를 조사하였다. 곰취 메탄올추출물 $1,000mg{\cdot}L^{-1}$에 함유된 총 페놀함량, 총플라보노이드 함량은 각각 $75.8-297.7mg{\cdot}L^{-1}$ and $45.6-173.6mg{\cdot}L^{-1}$이었다. 추출온도와 시간은 총 페놀함량, 총 플라보노이드 함량, 전자공여 능 의 경우 $95^{\circ}C$에서 6시간 동안 추출했을 때 가장 좋았다. 그러나 아질산염 소거능은 $75^{\circ}C$에서 12시간 추출한 것에서 97.4%로 가장 높게 나타났다. 곰취 메탄을 추출물 $200mg{\cdot}L^{-1}$ 및 $400mg{\cdot}L^{-1}$ 농도는 각각 폐암과 위암세포 증식을 90% 이상 억제시켰다. 따라서 곰취는 높은 생리활성 기능을 나타내는 채소로 나타났으며, 곰취를 가공품으로 이용하기 위해 메탄올로 추출할 때는 $95^{\circ}C$에서 6시간 정도 하는 것이 좋을 것으로 생각되었다.
곰취(Ligularia fischeri)의 이용성을 높이데 필요한 기초자료를 확보하고자 메탄올을 용매로 하여 추출 온도 및 시간에 따른 생리활성 효과를 조사하였다. 곰취 메탄올추출물 $1,000mg{\cdot}L^{-1}$에 함유된 총 페놀함량, 총플라보노이드 함량은 각각 $75.8-297.7mg{\cdot}L^{-1}$ and $45.6-173.6mg{\cdot}L^{-1}$이었다. 추출온도와 시간은 총 페놀함량, 총 플라보노이드 함량, 전자공여 능 의 경우 $95^{\circ}C$에서 6시간 동안 추출했을 때 가장 좋았다. 그러나 아질산염 소거능은 $75^{\circ}C$에서 12시간 추출한 것에서 97.4%로 가장 높게 나타났다. 곰취 메탄을 추출물 $200mg{\cdot}L^{-1}$ 및 $400mg{\cdot}L^{-1}$ 농도는 각각 폐암과 위암세포 증식을 90% 이상 억제시켰다. 따라서 곰취는 높은 생리활성 기능을 나타내는 채소로 나타났으며, 곰취를 가공품으로 이용하기 위해 메탄올로 추출할 때는 $95^{\circ}C$에서 6시간 정도 하는 것이 좋을 것으로 생각되었다.
This study was conducted to gather the basic data on making good use of a kind of groundsel (Ligularia fischeri). We have made methanol extracts from Ligularia fischeri and have also determined the effects of extracting temperature and time on the physiological activities of methanol extracts from L...
This study was conducted to gather the basic data on making good use of a kind of groundsel (Ligularia fischeri). We have made methanol extracts from Ligularia fischeri and have also determined the effects of extracting temperature and time on the physiological activities of methanol extracts from Ligularia fischeri. Total phenolic compound and flavonoid contents in the methanol extracts from Ligularia fischeri at the extracting concentration of $1,000mg{\cdot}L^{-1}$ were $75.8-297.7mg{\cdot}L^{-1}$ and $45.6-173.6mg{\cdot}L^{-1}$. Total phenolic compound and flavonoid contents, and DPPH radical scavenging activities were most increased when Ligularia fischeri was extracted with methanol at $95^{\circ}C$ for 6 hours, however, nitrite radical scavenging activities were extremely increased at $75^{\circ}C$ for 12 hours by 97.4%. At $200mg{\cdot}L^{-1}$ and $400mg{\cdot}L^{-1}$ methanol extracting concentration, the hyperplasia of lung cancer cells (Calu-6) and stomach cancer cells (SNU601) were effectively inhibited over 90%. Consequently, it was assumed that Ligularia fischeri was a functional vegetable with a higher physiological activities. Making the processed foods, it had better make the extracts from Ligularia fischeri with methanol at $95^{\circ}C$ for 6 hours.
This study was conducted to gather the basic data on making good use of a kind of groundsel (Ligularia fischeri). We have made methanol extracts from Ligularia fischeri and have also determined the effects of extracting temperature and time on the physiological activities of methanol extracts from Ligularia fischeri. Total phenolic compound and flavonoid contents in the methanol extracts from Ligularia fischeri at the extracting concentration of $1,000mg{\cdot}L^{-1}$ were $75.8-297.7mg{\cdot}L^{-1}$ and $45.6-173.6mg{\cdot}L^{-1}$. Total phenolic compound and flavonoid contents, and DPPH radical scavenging activities were most increased when Ligularia fischeri was extracted with methanol at $95^{\circ}C$ for 6 hours, however, nitrite radical scavenging activities were extremely increased at $75^{\circ}C$ for 12 hours by 97.4%. At $200mg{\cdot}L^{-1}$ and $400mg{\cdot}L^{-1}$ methanol extracting concentration, the hyperplasia of lung cancer cells (Calu-6) and stomach cancer cells (SNU601) were effectively inhibited over 90%. Consequently, it was assumed that Ligularia fischeri was a functional vegetable with a higher physiological activities. Making the processed foods, it had better make the extracts from Ligularia fischeri with methanol at $95^{\circ}C$ for 6 hours.
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문제 정의
이와 같은 배경에서 본 연구는 국내 자생식물이며, 최근 재배면적이 확대되고 있는 곰취의 가공상품 등이용성을 높이데 필요한 기초자료를 확보하고자 메탄올 추출 온도 및 시간에 따른 생리활성과 추출물의암세포 증식억제 효과를 조사하기 위해 실시하였다.
제안 방법
이것을 72시간 동안 배양시킨 후, 5mg/mL농도로 조제한 MTT(3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide) 용액을 각 well당 lOptL씩 넣고 세포 배양기에서 4시간동안 더 배양시킨 후, MTT 용액이 있는 배지를 제거하고 DMSO 150μL를 첨가하여 30분간 교반하여 각세포를 용해시켜 microplate reader (Bio-Rad, USA) 를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하여 그 값을 다음과 같이 계산하였다. 즉, "암세포증식 억제효과 (%)= {대조구의 흡광도-시료처리구의 흡광도)/대조구의 흡광도}X100"로 하였는데, 각 세포의 시료 무첨가군을 100%로 하여 상대적인 세포 성장율을 환산하였다.
시료를 hngpi 농도로조제한 후, 이 시료액 1mL에 증류수 3mL와 Folin-Ciocalteau's phenol reagent 1mL를 첨가한 후 27℃ 진탕수조에서 혼합하였다. 5분 후 NaCO3 포화용액 hnL를 넣어 혼합하여 실온에서 1시간 방치한 후 640nml에서 흡수분광광도계(UV-1650PC, Shimadzu, Japan)로 흡광도를 측정하였다. 페놀화합물 함량은 표준물질 ferulic acid의 농도를 이용하여 검량선을 작성한 다음 정량하였다.
곰취 (Ligidaria fischeri)의 이용성을 높이데 필요한기초자료를 확보하고자 메탄올을 용매로 하여 주줄 온도 및 시간에 따른 생리활성 효과를 조사하였다. 곰취메탄올 추출물 I, OJOmgL1에 함유된 총 페놀함량, 총플라보노이드 함량은 각각 75.
lmL를 잘 혼합시켜 37℃의 water bath에서 1시간 동안 반응시킨 후 420nm에서 흡광도를 측정하였다. 공시험은 시료 용액 대신 50% methanol 용액을 동일하게 처리하였으며, 표준곡선은 naringin(Sigma Co., USA)을 이용하여 작성하고 이로부터 총 플라보노이드 함량을 구하였다.
사용하였다. 세포주의 배양은 10% FBS (fetal bovine serum) 와 peniciline G(25unit/mL) 및 streptomycin(25mg・L-1)를 첨가한 RPMI 1640배지를사용하였으며 37℃, 5% CO의 습윤화 된 배양기내에서 적응시켜 배양하였다.
시료의 건조는 구분하여 실시하였는데, 생리활성검정에 사용한 시료는 동결건조(-40P에서 5일간)하였으며 , 암세포 증식억제에 사용한 시료는 항온건조(501 에서 5일간)하였다. 추출은 각 시료 400g를 95% methanol 41에 넣은 후 생리활성 조사에 사용한 추출물의 추출온도는 각각 25, 50, 75 및 95℃로 하였으며, 추출시간은 각각 3, 6, 12, 24 및 48시간으로 하였고, 암세포 증식억제에 사용한 것은 50℃에서 24시간 동안 추출하였다, 추출액은 여과한 후 그 추출액을 50℃에서 감압농축기(IKA-Werke GmbH & Co.
lxlO2 * 4M DPPH와 농도별 추출물을 각각 100μL씩 혼합하고, 30분간 암 상태에서 방치한 후 ELISA ReadeKBio-RAD, USA)를 이용하여 517nm에서 잔존 라디칼 농도를 측정하였다. 시료의 환원력의크기는 라디칼 소거활성 (scavenging activity)로 표시하였고, RCs(은 DPPH 농도가 1/2로 감소하는데 필요한 시료의 양(㎍)으로 나타내었으며 항산화 물질로 잘알려진 BHT(butylated hydroxytoluene)와 비교하였다. 즉, "DPPH 라디칼 소거활성(%)=1-{(시료 첨가구의흡광도/시료 미첨가구의 흡굉도)}X100, 으로 계산하였다.
1989)에 의해 세포생존율로 조사하였다. 즉, 폐암세포를 3xl04cells/mLe 농도가 되도록 조절한 후 96 well microplate에 90)iL/well씩 분주하고, 이것을 37℃, 5% CO2 세포배양기(Forma, Germany)에서 12 시간 배양하여 세포를 부착시킨 다음 추출물을 50, 100, 200, 400, 800mg・L-1농도가 되도록 10|iL씨 첨가하였다. 대조군은 시료와 동일한 양의 증류수를 첨가하여 동일한 조건으로 배양하였다.
총 플라보노이드 함량 측정은 각 시료 0.1g에75% methan아을 가하여 실온에서 하룻밤 동안 추출한 다음이 검액 1.0ml를 시험관에 취하고 UhnL의 diethylen 이ycol을 가하여 잘 혼합하였다. 다시 여기에 1N NaOH O.
시료의 건조는 구분하여 실시하였는데, 생리활성검정에 사용한 시료는 동결건조(-40P에서 5일간)하였으며 , 암세포 증식억제에 사용한 시료는 항온건조(501 에서 5일간)하였다. 추출은 각 시료 400g를 95% methanol 41에 넣은 후 생리활성 조사에 사용한 추출물의 추출온도는 각각 25, 50, 75 및 95℃로 하였으며, 추출시간은 각각 3, 6, 12, 24 및 48시간으로 하였고, 암세포 증식억제에 사용한 것은 50℃에서 24시간 동안 추출하였다, 추출액은 여과한 후 그 추출액을 50℃에서 감압농축기(IKA-Werke GmbH & Co. KG)로 농축하여 동결 건조하였다.
대상 데이터
시료는 2006년 4월 중순경 전남 구례군 황전면에서채취한 곰취 fischerie\ 잎과 줄기를 이용하였다. 시료의 건조는 구분하여 실시하였는데, 생리활성검정에 사용한 시료는 동결건조(-40P에서 5일간)하였으며 , 암세포 증식억제에 사용한 시료는 항온건조(501 에서 5일간)하였다.
실험에 사용된 암 세포주는 모두 인체기원의 암 세포주로 Korean Cell Line Bank(KCLB)에서 구입한 위암세포주인 SNU-601 와 암세포주인 Calus-6(ATCC, HTB-56)을 사용하였다. 세포주의 배양은 10% FBS (fetal bovine serum) 와 peniciline G(25unit/mL) 및 streptomycin(25mg・L-1)를 첨가한 RPMI 1640배지를사용하였으며 37℃, 5% CO의 습윤화 된 배양기내에서 적응시켜 배양하였다.
데이터처리
zMean separation within rows by Duncan's multiple range test at 5% level.
각각의 조사 분석은 3반복 이상으로 하였으며, 통계처리는 SAS 프로그램 중에서 분산분석(ANOVA)을실시하여 Duncan's multiple range test로 5% 유의수준에서 시료간의 유의성을 검정하였다.
이론/모형
세포독성은 MTT assay(Mosmann, 1983; Choi et al. 1989)에 의해 세포생존율로 조사하였다. 즉, 폐암세포를 3xl04cells/mLe 농도가 되도록 조절한 후 96 well microplate에 90)iL/well씩 분주하고, 이것을 37℃, 5% CO2 세포배양기(Forma, Germany)에서 12 시간 배양하여 세포를 부착시킨 다음 추출물을 50, 100, 200, 400, 800mg・L-1농도가 되도록 10|iL씨 첨가하였다.
아질산염소거 효과는 Gray와 Dugan(1975)의 방법에 준하여 다음과 같이 측정하였다. 1mM NaNO2 20pL에 시료의 추출액 40μ!와 0.
종 페놀화합물 함량은 Folin-Denis 방법 (Dewanto 등, 2002)에 따라 분석하였다. 시료를 hngpi 농도로조제한 후, 이 시료액 1mL에 증류수 3mL와 Folin-Ciocalteau's phenol reagent 1mL를 첨가한 후 27℃ 진탕수조에서 혼합하였다.
성능/효과
이상의 결과를 종합해 보면 곰취를 기능성 음료수등 가공품에 활용할 목적으로 추출할 때는 총 페놀함량, 총 플라보노이드 함량, 전자공여능 측면에서는 95℃에서 6시간 동안 추출하는 것이 좋고, 아질산염소거능 측면에서는 "C에서 12시간 동안 추출하는것이 좋을 것으로 생각되었다. 동시에 곰취 메탄올 추출물은 페암의 경우 200mg-L4, 위암은 400mg-L-1 농도에서 90% 정도의 암세포 증식억제 효과를 나타낸만큼 분획물에 따른 효과 등 이에 대한 세밀한 연구가 필요한 것으로 나타났다.
곰취 메탄올 추출 온도 및 시간에 따른 추출물 l, 000mgLi이 DPPH 라디칼 소거활성에 미치는 영향을 조사한 결과 DPPH 농도가 1/2로 감소하는데 필요한 양은 95P에서 6시간 동안 추출한 것에서 83.5mg・L-1로 가장 낮았다(Table 3). 인체에서 활성산소는 산소라디칼에 의하여 산화적 손상을 초래함으로서독성을 나타내며 (Kappus, 1986), 활성산소의 산화적 손상은 glutamate 수용체의 과 활성 및 흥분성 아미노산의 분비를 유도하여 세포독성을 나타내는데 (Mattson 등, 1993), 전자공여능의 작용은 자유라디칼에 전자를 공여하여 식품의 지방산화를 억제하고 인체내에서는 자유라디칼에 의한 노화를 억제시키는 작용으로 주로 이용되어 진다(Lee 등, 2006).
곰취 메탄올 추출 온도와 시간이 추출물(LOOOmgU) 의 아질산염 소거능에 미치는 영향을 조사한 결과 25℃ 에서는 48시간 동안 추출해도 52.8%를 나타낸 빈면에서 75℃에서는 추출 시간에 관계없이 89.3% 이상으로높게 나타났다(Table 4). 즉, 추출물의 아질산염 소거능은 추출 시간 보다는 온도의 영향을 크게 빋아 고온으로 추출시는 추출 시간에 관계없이 높은 활성을 보였다.
곰취 메탄올 추출물 LOOOmgLi에 함유된 총 플라보노이드 함량은 45.6~173.6mgL-1이었다(Table 2). 총 페놀함량의 경우 Table 1에서와 같이 추출 온도와 시간간에 뚜렷하게 관련성이 있었던 것에 비해 총 플라보노이드 함량은 25, 50 및 75℃에서는 모두 24시간 동안추출한 것에서 각각 57.
곰취메탄올 추출물 I, OJOmgL1에 함유된 총 페놀함량, 총플라보노이드 함량은 각각 75.8-297.7mg-L-i, 45.6-173.6mg・L-1이었다. 추출온도와 시간은 총 페놀함량, 총 플라보노이드 함량, 전자공여능 의 경우 95℃에서 6시간 동안 추출했을 때 가장 좋았다.
곰취의 메탄올 추출물이 우]암(SNU-601)과 폐암 (Calu-6) 세포의 증식 억제에 미치는 효과를 조사한결과 폐암은 200mgU 이상의 농도에서, 위암은 400mg-Lu 이상의 농도에서 90%이상의 억제 효과를나타냈다(Fig. 1). 최근 기존의 항암제들이 치료의 한계를 가지고 있기 때문에 일반 채소류를 포함하여 야생 식물자원들에 대한 항암 활성 성분의 검출에 대한연구가 활발하게 이루어지고 있다(Chon 등, 2008)는점에서 폐암과 위암 세포의 증식 억제 효과를 나타낸곰취 추출물에 대해서는 추후 자세한 연구가 필요할것으로 생각되며, 우선적으로 곰취의 섭취는 위암과 폐암 세포의 증식억제에 다소나마 도움이 될 것으로 생각되었다.
7mg・L-1로 가장 많았다. 그러므로 곰취의 기능성 물질을 추출할 때 페놀함량의 수율을 높이려면 95℃에서 6시간 동안 추출하는 것이 좋을 것으로 생각되 었다.
식품에서 nitrite는 독성을 가지고 있으며, nitrate 는 체내, 체외에서 효소작용에 의해 nitrite로 환원되기때문에 일정농도 이상 섭취할 경우, 식품내의 amine류와 반응하여 발암물질인 nitrosamine을 생성하고, 또한혈액 중의 hemoglobin이 산화되어 methemoglobiri을형성하여 methemoglobin 증 등 긱종 중독을 일으키는 것으로 알려져 있다(Na 등, 2004). 그러므로 이러한 아질산염의 소거 및 제거는 그에 동반되는 질병을억제할 수 있다는 점에서 큰 의미가 있는데, 곰취의경우 95*0에서 3시간 동안 추출한 추출물 1, 000 은 92.8%의 아질산염 제거능을 갖는 것으로 나타나났다. 따라서 고온에서 추출한 곰취 추출물이나 이를 이용한 기공제품은 아질산염을 제거하는데 크게 도움이 될 것으로 생각되었다.
8%의 아질산염 제거능을 갖는 것으로 나타나났다. 따라서 고온에서 추출한 곰취 추출물이나 이를 이용한 기공제품은 아질산염을 제거하는데 크게 도움이 될 것으로 생각되었다.
곰취 메탄올 추출물 200mgL1 및 400mgL* 농도는 각각 폐암과 위암세포 증식을 90% 이상 억제시켰다. 따라서 곰취는 높은 생리활성 기능을 나타내는 채소로 나타났으며, 곰취를 가공품으로 이용하기 위해 메탄올로 추출할 때는 95℃에서 6시간 정도 하는 것이 좋을 것으로 생각되었다.
3% 이상으로높게 나타났다(Table 4). 즉, 추출물의 아질산염 소거능은 추출 시간 보다는 온도의 영향을 크게 빋아 고온으로 추출시는 추출 시간에 관계없이 높은 활성을 보였다. 식품에서 nitrite는 독성을 가지고 있으며, nitrate 는 체내, 체외에서 효소작용에 의해 nitrite로 환원되기때문에 일정농도 이상 섭취할 경우, 식품내의 amine류와 반응하여 발암물질인 nitrosamine을 생성하고, 또한혈액 중의 hemoglobin이 산화되어 methemoglobiri을형성하여 methemoglobin 증 등 긱종 중독을 일으키는 것으로 알려져 있다(Na 등, 2004).
6mg・L-1이었다. 추출온도와 시간은 총 페놀함량, 총 플라보노이드 함량, 전자공여능 의 경우 95℃에서 6시간 동안 추출했을 때 가장 좋았다. 그러나 아질산염 소거능은 75℃에서 12시간 추출한 것에서 97.
한편, 암세포 증식 억제 효과에 사용된 추출물은 50-C에서 추출한 것인데, 항암과 다소 관련이 있다고알려진 총 페놀함량, 총 플라보노이드 함량 및 전자공여능은 Table 1, 2, 3에서와 같이 95P에서 6시간동안 추출한 것에서 우수한 결과를 나타냈다. 따라서곰취를 95℃에서 6간 동안 추출한 것은 Fig.
후속연구
좋을 것으로 생각되었다. 동시에 곰취 메탄올 추출물은 페암의 경우 200mg-L4, 위암은 400mg-L-1 농도에서 90% 정도의 암세포 증식억제 효과를 나타낸만큼 분획물에 따른 효과 등 이에 대한 세밀한 연구가 필요한 것으로 나타났다.
1). 최근 기존의 항암제들이 치료의 한계를 가지고 있기 때문에 일반 채소류를 포함하여 야생 식물자원들에 대한 항암 활성 성분의 검출에 대한연구가 활발하게 이루어지고 있다(Chon 등, 2008)는점에서 폐암과 위암 세포의 증식 억제 효과를 나타낸곰취 추출물에 대해서는 추후 자세한 연구가 필요할것으로 생각되며, 우선적으로 곰취의 섭취는 위암과 폐암 세포의 증식억제에 다소나마 도움이 될 것으로 생각되었다.
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