선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 본 연구는 임상에서 나타난 효과에 대해 사향 및 배합 한약제제의 구강 투여가 백서의 기억 및 뇌기능 활성에 미치는 영향을 관찰하고자 하여 사향, 한약 배합제제, 사향을 첨가한 한약 배합 제제를 투여한 후 방사형 미로학습을 통한 행동학적 검사, acetylcholinesterase(AchE) 및 choline acetyltransferase(ChAT)발현을 통한 뇌신경 회복 효과와 간에 대한 안정성 확인을 위해 체중대비 간장 무게, 혈청 AST, ALT 등을 관찰하였다.
제안 방법
- Acquisition curves of the eight-arm radial maze task in rats. The task was started on the 2 days after herbal medication, and performed 3 trials per day for 6 days. Results are shown as mean±SE.
- 5 ㎖, 30mM Copper Sulfate: 1 ㎖, 5 mM Potassium Ferricyanide: 1 ㎖, D · W: 1 ㎖)에 5시간 배양시킨 후 gelatine-coated slide glass에 고정하고 건조 후 cover glass를 덮는다. 광학현미경으로 40 배로 확대하여 hippocampus에서 acetylcholinesterase 신경 세포의 밀도를 Scion image program을 이용하여 측정하였다.
- 군 분리는 saline을 구강 투여한 대조군(Control)으로 하였고, 실험군은 사향을 구강투 여한 군(Herbal Medication group A ; HM-A), 한약 배합제제를 구강 투여한 군(Herbal Medication group B ; HM-B), 사향을 첨가한 한약 배합제제를 구강투여한 군(Herbal Medication group C ; HM-C)으로 나누었으며, 각 군은 군당 흰쥐 6마리씩 배정하였고, eight-arm radial maze task를 구강투여전과 제 3회 구강 투여 직후, 제 6회 구강 투여 직후, 그리고 제 8회 구강투여 직후에 시행하였으며, 마지막 구강투여가 끝난 후 백서를 희생 시켜 조직 검사와 혈청 분석을 하였다.
- 기억과 학습능력에 대한 이와 같은 임상적 연구를 실험적으로 규명하기 위하여 사향, 한약 배합제제, 사향을 첨가한 한약 배합 제제를 투여한 후 방사형 미로학습을 통한 행동학적 검사, acetylcholinesterase(AchE) 및 choline acetyltransferase(ChAT)발현을 통한 뇌신경 회복 효과와 체중대비 간장 무게, 혈청 AST, ALT 등을 관찰한 바 다음과 같은 결과를 얻었다.
- hippocampus 부위에서 ChAT활성도 감소는 acetylcholine 감소를 초래하여 기억력 및 여러 학습능력 저하와 집중력의 이상을 유발하게 된다43-5). 따라서 방사형 미로에 나타난 효과를 조직학적으로 평가하기 위해 AchE, ChAT의 발현정도를 관찰하였다.
- 모든 실험군들의 체중 및 간 무게는 구강투여와 eight-arm radial maze task가 끝난 9일째에 체중과 간 무게를 측정하였으며, 체중대비 상대적 간무게는 체중에 대한 간 무게의 비율로 표시하였다.
- 모든 처리를 거친 뇌 조직을 gelatine-coated slide glass에 고정하고 공기를 제거하면서 cover glass를 덮은 후 광학현미경으로 100배로 확대하여 hippocampus에서 Choline acetyltransferase(ChAT) 신경 세포의 밀도를 Scion image program을 이용하여 측정하였다.
- 실험에 들어가기 전 36시간 동안 사육 상자에서 먹이를 박탈하고 배고픔을 유발시킨 백서를 행동 관찰실로 옮겨와 30분간 환경에 적응시켰다. 백서를 미로의 출발 상자에 넣고 1분간 두어 상황에 적응시킨 후 1분이 지나면 각 주로로 통하는 통로를 개방하여 백서가 자유롭게 미로 속을 돌아다니게 하였으며, 쥐가 주로를 방문하여 끝까지 달리면 보상 용기에서 먹이를 먹게 하였다. 그러나 동일한 주로를 반복해서 방문하면 두 번째 방문부터는 먹이를 제공하지 않고 반응은 오류로 기록하였다.
- 사향 및 배합 한약제제의 구강 투여가 백서의 기억 및 뇌기능 활성에 미치는 영향을 관찰하고자 하여 사향, 한약 배합제제, 사향을 첨가한 한약 배합 제제를 투여한 후 방사형 미로학습을 통한 행동학적 검사, cresyl violet을 이용한 신경세포 손상 방어효과, acetylcholinesterase(AchE) 및 choline acetyltransferase(ChAT)발현을 통한 뇌신경 회복 효과와 체중대비 간장 무게, 간 기능 관련 혈청 AST, ALT 등을 관찰한 바 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 주로의 끝에는 보상으로 제공하는 먹이나 물을 담을 수 있는 7×5×3 cm 크기의 용기(음식 접시)가 설치하였다. 실험동물이 주로를 출입하는 행동을 비디오카메라로 녹화하여 백서가 각 주로를 방문한 횟수와 오류 여부를 계산하였다. 실험에 들어가기 전 36시간 동안 사육 상자에서 먹이를 박탈하고 배고픔을 유발시킨 백서를 행동 관찰실로 옮겨와 30분간 환경에 적응시켰다.
- 실험동물이 주로를 출입하는 행동을 비디오카메라로 녹화하여 백서가 각 주로를 방문한 횟수와 오류 여부를 계산하였다. 실험에 들어가기 전 36시간 동안 사육 상자에서 먹이를 박탈하고 배고픔을 유발시킨 백서를 행동 관찰실로 옮겨와 30분간 환경에 적응시켰다. 백서를 미로의 출발 상자에 넣고 1분간 두어 상황에 적응시킨 후 1분이 지나면 각 주로로 통하는 통로를 개방하여 백서가 자유롭게 미로 속을 돌아다니게 하였으며, 쥐가 주로를 방문하여 끝까지 달리면 보상 용기에서 먹이를 먹게 하였다.
- 약물은 zondae로 1회/1일로 총 8회 구강투여를 시행하였으며, 투여량은 control군(saline 0.4 ㎖), HM-A(moschus 0.473 ㎎/㎏), HM-B군(herbal composition 153.9 ㎎/㎏), HM-C군(herbal composition with moschus 165.95 ㎎/㎏) 모두 0.4 ㎖씩 구강 투여하였다.
- 우리제약에서 구입한 한국의약품 시험 연구소에서 검증한 사향(Moschus) (Table 1)과 사향이 배합된 한약제제(Table 2), 그리고 비배합된 한약제제(Table 3)를 극세말하여 호환 탄자대 크기의 환으로 조제한 후 saline에 녹여서 구강 투여하였다.
- 특히 간세포 손상의 경우에는 손상 받은 간세포로부터 Disse강을 통해 직접 혈류로 유출되므로 이들 효소 활성치의 증가는 간세포 장애 정도와 비교적 상관성이 높다29). 임상에서 한약의 간에 대한 안정성을 많이 의심받는 사례가 많은데, 사향배합 한약제제의 간 손상에 대하여 혈청성분의 변화와 간장 무게를 위주로 살펴보았다.
- 채혈에 의하여 얻어진 혈액 중 약 100 μl를 EDTA-bottle에 넣은 후 곧바로 Multispecies Hematology Analyser에 주입하여 WBC, RBC, HGB, HCT를 측정하였다.
대상 데이터
- Eight-arm radial maze(Fig. 1)는 아크릴로 제작된 8개의 통로가 중앙의 출발영역(central platform)을 중심으로 매 45도 각도(방사형)로 뻗어 나온 형태의 장치를 이용하였다. 중앙 출발 영역은 직경 50 cm인 원에 내접하는 정팔각형 상자로 높이는 25 cm이며, 주로는 출발 상자의 각 면에 뚫린 10×25 cm 크기의 통로와 연결되어 있고, 길이는 70 cm이고 동물이 바깥으로 나가지 못하게 하였다.
- 이를 high speed centrifuge에서 3,500 rpm으로 20분간 원심분리를 시행하여 측정에 사용할 혈청을 분리하였으며, 측정하기 전까지는 4 ℃에 보관하였다. GOT는 GOT/AST -PⅢ Slide로, GPT는 GPT/ALT -PⅢ Slide로 Fuji Dri-Chem Clinical Chemistry Analyzer를 이용하여 측정하였다.
- 본 실험에서 사용한 기기는 Crytome(Shandon, UK), Optical microscope(Nikon Eclipse 80i, Japan), Scion image program(Scion Corp. MD, USA), Multispecies Hematology Analyser(950, Hemavet, USA), High speed centrifuge(Centricon T-42K, Italy), Fuji Dri-Chem Clinical Chemistry Analyzer(DRI-Chem 4000ie, Fujifilm Corporation, Japan)등 이었다.
- 본 실험에서 사용한 시약은 formalin solution(Sigma, St. Louis, MO, USA), Acetylcholine Iodide(Sigma, St. Louis, MO, USA), Sodium Phosphate(Sigma, St. Louis, MO, USA), Sodium Citrate(Sigma, St. Louis, MO, USA), Copper Sulfate(Sigma, St. Louis, MO, USA), Potassium Ferricyanide(Sigma, St. Louis, MO, USA), mouse anti-choline ChAT monoclonal antibody(Chemicon, CA, USA), sodium azid(Sigma, St. Louis, MO, USA), biotinylated universal Secondary Antibody(Quick Kit : Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA), streptavidin peroxidase preformed complex(Quick Kit : Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA), diaminobenzidine(Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA), GOT/AST-PⅢ Slide(Fujifilm Corporation, Japan), GPT/ALT-PⅢ Slide(Fujifilm Corporation, Japan) 등 이었다.
- 체중이 약 230～250 g의 Sprague Dawley계의 白鼠(대한 바이오링사, 한국)를 실내온도가 24～26 ℃, 습도가 25～30 %로 유지되는 항온 항습 환경의 사육장내에서 고형사료(pellet, 삼양주식회사, 한국)와 물을 공급하면서, 1주일 이상 사육실과 실험실 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였으며, 실험기간 동안에도 물과 고형사료를 자유롭게 섭취하도록 하였다.
데이터처리
- 모든 측정값은 평균값 표준오차(mean±SE)로 표시하였고, 각 실험군간의 통계학적 분석은 Window용 SPSS를 이용하였다. 각 집단 간 행동 측정치의 비교는 repeated ANOVA test를 시행하였고, 면역조직화학분석법의 측정값은 oneway ANOVA를 시행하였으며, 사후검정은 Tukey test를 적용하였다. 전체 실험의 통계적인 유의성은 신뢰구간 P<0.
- 모든 측정값은 평균값 표준오차(mean±SE)로 표시하였고, 각 실험군간의 통계학적 분석은 Window용 SPSS를 이용하였다.
성능/효과
- 1. 방사형 미로 학습에서 오선택 수를 측정하는 획득시행 실험을 시행한 결과, 대조군과 실험군간에는 유의한 차이가 없었으나 HM-B 군과 HM-C군은 2일째에 비해 4일째에 감소의 경향을 나타내었다.
- 2. 방사형 미로 학습에서 정선택율을 측정하는 검사를 시행한 결과, 대조군에 비하여 HM-A군에서 약간 증가의 경향을 보였으나 HM-B군, HM-C군에서는 대조군과 비슷한 수준의 정선택율을 나타내었다.
- 3. Hippocampal CA1 부위의 AchE 발현정도를 관찰한 결과, 대조군에 비하여 HM-A군, HM-C 군이 유의한 증가를 나타내었다.
- 4. Hippocampal CA1 부위의 ChAT 발현정도를 관찰한 결과, 대조군에 비하여 HM-B군, HM-C군이 유의한 증가를 나타내었다.
- 5. 체중대비 상대적 간의 무게에 미치는 영향을 관찰한 결과, 대조군에 비하여 각 실험군들은 유의한 변화를 나타내지 않았다.
- 6. 간 기능 지표인 AST, ALT에 미치는 영향을 관찰한 결과, AST의 경우 대조군에 비하여 HM-A군의 유의한 증가 외에 다른 실험군에서는 유의한 차이를 나타내지 않았다.
- 기억과 학습능력을 향상시키는 의도로 六味 地黃湯과 水昇火降으로 心腎을 補益하는 拱 辰丹을 합방하고 大補元氣 · 寧神益智의 효능이 있는 紅蔘, 補脾益氣 · 安胎의 효능이 있는 白朮, 寧神安神의 효능이 있는 白茯神, 補肝腎 · 壯筋骨의 효능이 있는 杜冲, 補肝腎 · 强腰膝의 효능이 있는 牛膝, 健脾消食의 효능이 있는 木香, 調中行氣 · 溫脾止瀉의 효능이 있는 砂仁, 溫中化濕의 효능이 있는 白荳蔲, 補腎固精 · 溫脾止瀉의 효능이 있는 益智仁25), 腎病에 먹는다는 穭豆(鼠目太)26)를 가미하여 임상에서 사용해 본 결과 기억력과 학습능력이 향상되는 효과를 볼 수 있었다.
- 대조군에 비하여 HM-A군이 유의하게 증가(P<0.05)된 밀도를 보였으며, HM-C군이 유의하게 증가(P<0.05)된 밀도를 나타내었다(Fig. 4, 5).
- 본 저자가 한의원에서 補腎滋陰의 가장 대표적인 방제인 六味地黃湯과 水昇火降으로 心腎을 補益하는 拱辰丹을 합방하고 大補元氣 · 寧神益智의 효능이 있는 紅蔘, 補脾益氣 · 安胎의 효능이 있는 白朮, 寧神安神의 효능이 있는 白茯神, 補肝腎 · 壯筋骨의 효능이 있는 杜冲, 補肝腎 · 强腰膝의 효능이 있는 牛膝, 健脾消食의효능이 있는 木香, 調中行氣 · 溫脾止瀉의 효능이 있는 砂仁, 溫中化濕의 효능이 있는 白荳蔲, 補腎固精 · 溫脾止瀉의 효능이 있는 益智仁26), 腎病에 먹는다는 穭豆27)를 가미하여 어지럼증 및 기억력과 체력 감퇴, 성장촉진용으로 처방하여 유의한 효과를 나타냈었다.
- 사향과 한약재 배합제재를 투여한 후 hippocampal CA1 부위의 AchE 발현정도를 관찰한 결과, 대조군에 비하여 HM-A군이 가장 유의하게 증가(P<0.05)된 밀도를 보였으며, HM-C 군이 유의하게 증가(P<0.05)된 밀도를 나타내었다(Fig. 4, 5).
- 사향과 한약재 배합제재를 투여한 후 hippocampal CA1 부위의 AchE 발현정도를 관찰한 결과, 대조군이 13.4±1.44(OD value), HM-A군이 24.6±4.96(OD value), HM-B군이 21.8±2.27(OD value), HM-C군이 18.2±0.96(OD value)를 보였다.
- 사향과 한약재 배합제재를 투여한 후 hippocampal CA1 부위의 ChAT 발현정도를 관찰한 결과, 대조군에 비하여 모든 군이 유의한 증가(P<0.05)를 나타내었다(Fig. 6, 7).
- 사향과 한약재 배합제재를 투여한 후 hippocampal CA1 부위의 ChAT 발현정도를 관찰한 결과, 대조군이 11.8±1.24(OD value), HM-A군이 15.6±2.36(OD value), HM-B군이 14.8±0.65(OD value), HM-C군이 16.0±0.94(OD value)를 나타내었다.
- 사향과 한약재 배합제재를 투여한 후 방사형 미로 학습에서 오선택 수를 측정하는 획득 시행 실험을 시행한 결과, 일자별로 대조군과 실험군 간에는 유의한 차이가 없었으며, 각 군의 경향성에 있어서는 대조군은 2일, 4일 및 6일째에 동일한 수준을 보였고, 이에 비하여 HM-A군은 2일째에 비해 4일째에 증가한 후 6일째에 감소하는 경향을 보였으며, HM-B군과 HM-C군은 2일째에 비해 4일째에 감소하였고 6일째에는 4일째와 비슷한 수준의 경향을 나타내었다(Fig. 2). 사향과 한약재 배합제재를 투여한 후 방사형 미로 학습에서 정선택율을 측정하는 검사를 시행한 결과, 대조군에 비하여 HM-A군에서 약간 증가의 경향을 보였으나 HM-B군, HM-C군에서는 대조군과 비슷한 수준의 정선택율을 나타내었다(Fig.
- 2). 사향과 한약재 배합제재를 투여한 후 방사형 미로 학습에서 정선택율을 측정하는 검사를 시행한 결과, 대조군에 비하여 HM-A군에서 약간 증가의 경향을 보였으나 HM-B군, HM-C군에서는 대조군과 비슷한 수준의 정선택율을 나타내었다(Fig. 3).
- 사향과 한약재 배합제재를 투여한 후 방사형 미로 학습에서 정선택율을 측정하는 검사를 시행한 결과, 대조군이 56.7±9.50 %, HM-A 군이 63.3±12.36 %, HM-B군이 50.0±11.79 %, HM-C군이 53.3±18.07 %를 나타내었다.
- 사향과 한약재 배합제재를 투여한 후 체중에 대비한 상대적 간 무게변화에 미치는 영향을 비교 관찰한 결과, 대조군이 27.8±0.60 mg/g, HM-A군이 27.5±0.89 mg/g, HM-B군이 28.8±0.39 mg/g, HM-C군이 28.0±0.12 mg/g을 나타내었다.
- 사향과 한약재 배합제재를 투여한 후 혈청 ALT에 미치는 영향을 비교 관찰한 결과, 대조군에 비하여 각 군들에서는 유의한 변화를 보이지 않았다(Fig. 10).
- 사향과 한약재 배합제재를 투여한 후 혈청 AST에 미치는 영향을 비교 관찰한 결과, 간조 직의 AST 활성도치는 혈청치의 약 7000배나 높아서 경도의 간장해에도 혈청치가 상승되므로 혈청 AST 활성도치 측정은 혈청 ALT 검사와 함께 간장해의 예민한 검사법으로 되어있다. 그러나 심근, 골격근, 혈구 등의 장해에도 AST치가 상승되므로 ALT처럼 간에 특이적이지 못하다46).
- 사향과 한약재 배합제재를 투여한 후 혈청 AST에 미치는 영향을 비교 관찰한 결과, 대조군이 171.8±18.0 U/L, HM-A군이 240.2±27.3 U/L, HM-B군이 151.4±18.4 U/L, HM-C군이 150.4±16.8 U/L를 나타내었다.
- 사향과 한약재 배합제재를 투여한 후 혈청 AST에 미치는 영향을 비교 관찰한 결과, 대조군이 63.8±16.1 U/L, HM-A군이 59.0±3.0 U/L, HM-B군이 64.2±10.5 U/L, HM-C군이 55.0±6.7 U/L를 나타내었다.
- 사향만 단독 투여된 HM-A 군은 아세틸콜린 및 chAT의 발현에서 가장 큰 유의성을 보였지만 간 기능 관련 혈청 AST, ALT 등을 관찰한바 단독으로 장기적인 복용이 힘들 것으로 보이며, 사향이 미배합된 한약제제가 투여된 HM-B군은 신장의 장기기억과 관련된 기존 연구 결과들17,21)과 같이 뇌세포 활성에 유의성을 보였고 간 기능에도 별다른 영향을 주지 않았다. 사향이 배합된 한약제제가 투여된 HB-C군은 아세틸콜린 및 chAT의 발현 증가 및 간 기능 관련 혈청 AST, ALT등을 관찰한바 각종 지표에서 뇌신경 활성에 도움이 되었으며 간 기능에도 별다른 영향을 주지 않았다. 하지만 사향함량이 적고, 군 개체수가 적으며, 실험기간이 짧아 더 좋은 효과를 위해서는 사향의 함량을 증량할 필요가 있을 듯 싶다.
- 실험결과 사향과 한약재 배합제재를 투여한 후 체중에 대비한 상대적 간 무게변화에 미치는 영향을 비교 관찰한 결과, 대조군에 비하여각 실험 군들은 유의한 변화를 나타내지 않았다(Fig. 8).
- 82 회를 나타내었다. 일자별로 대조군과 실험군 간에는 유의한 차이가 없었으며, 각 군의 경향성에 있어서는 대조군은 2일, 4일 및 6일째에 동일한 수준을 보였으며, 이에 비하여 HM-A군은 2일째에 비해 4일째에 증가한 후 6일째에 감소하는 경향을 보였으며, HM-B군과 HM-C군은 2일째에 비해 4일째에 감소하였고 6일째에는 4일째와 비슷한 수준의 경향을 나타내었다(Fig. 2).
- 종합해 보면 방사형 미로학습을 통한 행동학적 검사를 통해 대조군과 비교한 오선택 횟수가 비슷한 것과 정선택율의 유의성 부족에 대해서는 이에 대해 임상에서 1일 1환 한 달을 복용시켰는데, 복용기간이 8일로 짧아 뇌의 변화가 행동적 변화까지 이루어지지 못한 것이 아닐까 사료된다. 사향만 단독 투여된 HM-A 군은 아세틸콜린 및 chAT의 발현에서 가장 큰 유의성을 보였지만 간 기능 관련 혈청 AST, ALT 등을 관찰한바 단독으로 장기적인 복용이 힘들 것으로 보이며, 사향이 미배합된 한약제제가 투여된 HM-B군은 신장의 장기기억과 관련된 기존 연구 결과들17,21)과 같이 뇌세포 활성에 유의성을 보였고 간 기능에도 별다른 영향을 주지 않았다.
후속연구
- 하지만 사향함량이 적고, 군 개체수가 적으며, 실험기간이 짧아 더 좋은 효과를 위해서는 사향의 함량을 증량할 필요가 있을 듯 싶다. 본 사향배합 한약제제의 장기적인 복용이 기억력 증가와 뇌활성도 증가 효과를 나타낼 수 있을 것으로 기대할 수 있으나, 여기에 대해서 향후 더욱더 많은 연구가 필요할 것 같다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.