선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 이에 우수한 생균제를 개발하기 위하여 안전성이 알려진 유산균을 대상으로 인체의 분변으로부터 300여 균주를 분리하고 항균력을 보인 균주들을 선발하여, 생균제로서 갖춰야 할 기본적인 생균제 특성을 나타내는지 알아보고자 하였다.
제안 방법
- MRS broth에서 3회 계대 배양한 신선한 배양액을 1% (v/v) 접종하여 각 온도별(37℃~80℃), 시간별(15분, 30분)로 각각 열처리한 다음, 생균수를 측정하여 생존율[(실험구의 Log지수값/대조구의 Log지수값)×100]을 계산하였다.
- MRS 배지에서 48시간 배양후 나타난 유백색 colony를 취하고 그람양성 간균인 300개의 균주를 선별하여 형태적인 1차 분류를 하였다. 이들은 GAM semi-agar에 배양하여 -80℃에 보존하며 실험에 사용하였다.
- MTS assay를 위하여 microplate 96 well에 배양된 cell을 180 µl씩(2×104 cells/ml), 준비된 균주 배양 상등액을 20 µl씩 첨가하여 3일간 배양하였다.
- Monolayer 세포의 세포변성효과(cytopathic effects, CPE)가 약 70% 정도 관찰되었을 때, MEM 배지를 포함한 감염세포를 냉동(-70℃)과 해동을 2회 반복하고 원심분리(10,000 rpm, 5분)하여, 세포성분을 제거한 상등액을 수거·보관(-70℃)하였다.
- PCR primer는 27F (5’-GAG TTT GAT CCT GGC TCA G-3’)와 1492R (5’-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’)을 이용 증폭하였으며, 염기서열결정 및 계통분류학적 분석을 하였다(6).
- TGEV에 대한 항바이러스 효과 실험은 준비된 배양 상등액을 첨가하여 세포변성효과(CPE)를 관찰하였다. 인체유래 유산균의 항바이러스 실험을 위하여 필요한 인체 병원성 바이러스를 확보하기가 쉽지 않아, 국내에서 실험이 가능한 구비된 TGEV를 대상으로 비교실험을 수행하였다.
- gas를, 검출기는 FID detector, 초기온도 170℃, 최종 270℃, 검출기 300℃ 그리고 injector 250℃ 등의 조건에서 수행하였다(6). 검출된 각 지방산 성분의 동정은 장착된 미생물 지방산 데이터베이스 MIS Software (Microbial ID.)를 이용하여, calibration 표준 지방산 성분의 retention time, peak의 면적 그리고 조성 비율과 자동 비교 매치되는 방식으로 동정하고 지방성분의 조성비에 따라 균주를 분류하였다.
- 더불어 48시간 동안 액체 배양하고 6시간 간격으로 흡광도(OD 650)를 측정하여, 생존율[(실험구의 OD값/대조구의 OD값)×100]을 산출하였다. 내담즙성 실험은 Bacto oxgall (Difco)의 농도를 0.3, 0.5, 1% (w/v)가 되도록 각각 첨가하여 시험균을 접종 배양하고 상기와 같은 방법으로 측정하였다.
- 22 µl pore size, Sartorius, France)로 균체를 제거하여 준비하였다. 대조구는 균을 접종하지 않은 MRS broth를 동량 사용하여 항균력을 비교하였다.
- 더불어 48시간 동안 액체 배양하고 6시간 간격으로 흡광도(OD 650)를 측정하여, 생존율[(실험구의 OD값/대조구의 OD값)×100]을 산출하였다.
- typhimurium 등의 병원성세균을 억제하는 바람직한 특성을 보인다. 또한 항생제 내성균이 문제되는 최근의 상황에서 MRSA 8종 모두를 억제하는 항균력을 나타냄으로써 심층적인 추가실험의 동기를 제공하였다. 일반적으로 개발된 유산균들은 좁은 항균스펙트럼을 띠며 다양한 유해세균에 대하여 억제력을 보이는 것으로 보고되며(3, 5), S.
- 78%)로 구성되어 있는 Lactobacillus 속으로 분류되었다. 미생물이 지니는 phenotypic 특성에 의한 생화학적 분류보다 정밀한 genotypic 특성을 이용한 동정을 위하여 16S rRNA gene sequence 분석을 통하여 확인하였다. 그 결과 Miny-148 균주는 유산균에 속하는 L.
- 분리 균주의 내산성을 측정하기 위하여 pH 2.0~7.0으로 각각 조절된 MRS broth에 접종 배양하고 시간별로 생균수와 성장도를 측정하였다. 먼저, 각각의 pH 조건에서 2시간 반응 후 생균수를 측정하고 대조구(pH 7.
-
균체 지방산 분석
분리된 균주의 균체 세포벽 지방산(fatty acid methyl esters) 분석은 Microbial Identification System (MIDI, Microbial ID, USA)이 장착된 HP 6890 Gas Chromatography를 이용, 분석 carrier gas로 H2 gas를, 검출기는 FID detector, 초기온도 170℃, 최종 270℃, 검출기 300℃ 그리고 injector 250℃ 등의 조건에서 수행하였다(6). 검출된 각 지방산 성분의 동정은 장착된 미생물 지방산 데이터베이스 MIS Software (Microbial ID.
- 이들을 2시간 동안 반응시킨 후의 생균수(CFU/ml)를 측정하여, 생존율[(실험구의 Log지수값/대조구의 Log지수값)×100]을 측정하였다.
- ST cell이 분주된 96 well microplate에 바이러스 희석액 90 µl를 접종하고, 준비된 균주 배양액 10 µl를 각 well에 첨가 배양하였다. 이를 배양하는 동안 각각 24, 48, 72시간 마다 CPE를 관찰하여 CPE가 나타나지 않을 경우 TGEV에 대한 항바이러스 효과가 있는 것으로 판정하였다.
- 인체 장내에서 분리한 L. pentosus Miny-148 균주의 항암효과를 간접적으로 유추하기 위하여, 인체결장암 세포 HT-29 cell line을 이용한 MTS assay를 실시하였다. Microplate 96 well에 분리 균주들의 배양 상등액을 10% (20 µl/ 180 µl)씩 첨가하여 3일간 배양한 결과, HT-29 cell의 증식은 대조구에 비하여 Miny-148 첨가구에서 62% (1.
- 항바이러스 역가 측정을 위하여 3% bovine serum이 첨가된 MEM 배지를 사용하여 바이러스 역가가 100 TCID50/0.1 ml이 되도록 TGE virus 배양액을 희석하였다. ST cell이 분주된 96 well microplate에 바이러스 희석액 90 µl를 접종하고, 준비된 균주 배양액 10 µl를 각 well에 첨가 배양하였다.
대상 데이터
- 병원성세균은 KCTC (한국생명공학연구원 생물자원센터)에서 분양받은 E. coli KCTC 2441 등 8종과 병원에서 분양받은 methicillin-resistant S. aureus (MRSA) 균주 8종 등 총 16종을 지시 균주로 사용하였다. 사용된 지시균주 B.
- aureus (MRSA) 균주 8종 등 총 16종을 지시 균주로 사용하였다. 사용된 지시균주 B. anthracis KCTC 3561는 Tryptic Soy agar (Difco)에서, S. aureus KCTC 1621, E. coli O157, E. coli KCTC 2441, S. typhimurium KCTC 1925, Shigella flexneri KCTC 2008, MRSA 균주는 Nutrient agar (Difco)에서, V. cholerae KCTC 2715, V. vulnificus KCTC 2962는 Marine agar (Difco)에서 각각 배양하였다.
- 세포 배양은 인체결장암 HT-29 (human colon adenocarcinoma cell)를 10% fetal bovine serum (Gibco BRL, USA)이 함유된 RPMI 1640 (Gibco)에 배양하면서 세포 증식시켰다. 지수 증식기의 세포를 2×104 cells/ml 되도록 희석한 후 37℃, 5% CO2 incubator에서 monolayer 형성 때까지 계대 배양하면서 실험에 사용하였다(1).
- 실험에 사용된 시료는 유아(2명), 성인(17명) 등 총 19명의 남녀로부터 분변을 혐기적으로 채취하였다. 적당량의 시료를 취하여 glass homogenizer (Pyrex)에서 균질화 한 후, 멸균 혐기 희석액으로 십진 희석하였다.
- TGEV에 대한 항바이러스 효과 실험은 준비된 배양 상등액을 첨가하여 세포변성효과(CPE)를 관찰하였다. 인체유래 유산균의 항바이러스 실험을 위하여 필요한 인체 병원성 바이러스를 확보하기가 쉽지 않아, 국내에서 실험이 가능한 구비된 TGEV를 대상으로 비교실험을 수행하였다. 얻어진 실험결과를 직접적으로 대입하기엔 무리가 있으나, 비교 자료로서 유추가 가능한 점을 염두에 두었다.
이론/모형
- Infectivity titer는 십진 희석한 TGE virus를 ST cell이 분주된 96 well microplate에 접종하여 세포배양기에서 72시간 배양하면서, Reed와 Muench의 방법(19)에 따라 CPE를 관찰하여 바이러스의 감염 역가를 산출 하였다.
- 내산성 실험은 Chang 등(6)의 방법에 따라 pH 2.0~7.0으로 각각 조절한 MRS broth에 초기 균수가 108 CFU/ml이 되도록 시험균을 접종하였다. 이들을 2시간 동안 반응시킨 후의 생균수(CFU/ml)를 측정하여, 생존율[(실험구의 Log지수값/대조구의 Log지수값)×100]을 측정하였다.
- 실험은 Chang 등(7)의 방법에 따라 수행하였으며, paper disc (6 mm, Yoyo Roshi Kaisha, Japan)를 이용하여 억제환의 직경(mm, diameter)을 측정하였다. 약 18시간 배양한 지시 균주의 농도를 106~7 CFU/ml로 조정하여 Mueller-Hinton agar 배지에 도말 건조한 후, 분리균주의 배양 상등액 60 µl를 멸균된 disc에 접종하여 48시간 배양하였다.
성능/효과
- 기존에 Ha 등(12)에 보고된 인체유래 Lactobacillus sp. CK102 균주는 pH 2에서 68.2%, pH 4에서는 94% 이상의 생존율을 보이며, 1.0% bile salt가 함유된 MRS broth에서 92.2%의 생존율을 나타냈다. Shin 등(27)은 인체유래 L.
- Microplate 96 well에 분리 균주들의 배양 상등액을 10% (20 µl/ 180 µl)씩 첨가하여 3일간 배양한 결과, HT-29 cell의 증식은 대조구에 비하여 Miny-148 첨가구에서 62% (1.6 OD 저하)의 억제효과를 나타냈다(Fig. 7).
- aureus (MRSA) 8종 등 총 16종을 대상으로 실시한 실험에서 분리균주는 Sh. flexneri에 가장 강한 항균력을 보이며, B. anthracis, S. aureus, E. coli, V. cholerae, V. vulnificus, S. typhimurium, MRSA 등의 세균이 모두 억제되었다(Table 1). 이 균주는 병원성 세균에 대하여 세포벽의 차이에 상관없이 그람양성과 음성균에 대한 광범위한 항균스펙트럼을 보인다.
- 미생물이 지니는 phenotypic 특성에 의한 생화학적 분류보다 정밀한 genotypic 특성을 이용한 동정을 위하여 16S rRNA gene sequence 분석을 통하여 확인하였다. 그 결과 Miny-148 균주는 유산균에 속하는 L. pentosus와 99.9%의 상동성을 보이는 균주로 동정되었다(Fig. 1). 생균제 유산균으로 L.
- 5 이상 조건에서는 90% 이상의 생존율을 보여 상당한 내산성을 보이고 있다. 또한 48시간 동안 액체 배양하면서 6시간 간격으로 성장도를 측정한 결과, pH 3.0 이하에서 거의 성장에 변화가 없으나, pH 4.0 이상에서는 흡광도 2.0 이상을 보였다(Fig. 3). 이는 분리 균주가 pH 3.
- 분리균주는 담즙에 의한 부분적인 생육저해를 받지만, 1% 첨가에서도 90% 이상의 생존율을 보여 상당한 내담즙성을 지닌 것으로 해석된다. 또한 48시간 동안 액체 배양한 결과, 18시간까지는 각각의 성장곡선은 유사한 형태를 나타내지만, 24시간 이후는 상당한 생균수의 하락이 나타났다(Fig. 5). 대조구의 성장도는 30시간에서 정점을 보이다 하강하지만, 첨가구의 경우 18시간까지 정점을 이루다 하락하는 경향을 보여, 대수기를 지난 정체기에서 많은 생육저해(~1 Log)를 보이고 있다.
- 0으로 각각 조절된 MRS broth에 접종 배양하고 시간별로 생균수와 성장도를 측정하였다. 먼저, 각각의 pH 조건에서 2시간 반응 후 생균수를 측정하고 대조구(pH 7.0)와 비교한 결과, pH 2.0에서 53%, pH 2.5 90.4%, pH 3 92.3%, pH 4 95.6%, pH 5 98.1% 등의 생존율을 각각 나타냈다(Fig. 2). 분리균주는 pH 2.
- 얻어진 실험결과를 직접적으로 대입하기엔 무리가 있으나, 비교 자료로서 유추가 가능한 점을 염두에 두었다. 분리한 인체유래 유산균을 대상으로 한 TGEV 실험에서, Miny-148 균주가 72시간 동안 세포변성효과가 나타나지 않은 기대이상의 결과를 얻을 수 있었다(Fig. 8). 우수균주의 선발을 위한 초기 스크리닝 과정에서 항균활성을 나타낸 보인 isolate 215, 항균 및 항암억제 활성이 우수한 isolate 47 등은 세포변성 억제효과를 보이지 않았으나, Miny-148 균주는 24, 48, 72시간 모두 억제효과를 나타냈다.
- 이들은 GAM semi-agar에 배양하여 -80℃에 보존하며 실험에 사용하였다. 선발된 Miny-148 균주는 유산간균의 전형적인 특성인 지방산 C16:0 (35.02%)와 C18:1 w7c (29.78%)로 구성되어 있는 Lactobacillus 속으로 분류되었다. 미생물이 지니는 phenotypic 특성에 의한 생화학적 분류보다 정밀한 genotypic 특성을 이용한 동정을 위하여 16S rRNA gene sequence 분석을 통하여 확인하였다.
- 선발된 Miny-148를 각각 37, 45, 50, 60, 70, 80℃에서 15, 30분씩 열처리하여 대조구(37℃)와 생균수를 비교하면, 45℃에서 15분 99.4% 30분 99.1%, 50℃에서 15분 99.4% 30분 98.6%, 60℃에서 15분 97.7% 30분 90.2%, 70℃에서 15분 91.4% 30분 76.6%, 80℃에서 15분 49.5% 30분 20.9% 등의 생존율을 나타냈다(Fig. 6). 선발된 균주는 15분간의 열처리 시 70℃까지는 91% 생존율을, 30분간의 열처리 시 60℃까지는 약 90% 생존율을 보여 상당한 내열성을 나타냈다.
- 6). 선발된 균주는 15분간의 열처리 시 70℃까지는 91% 생존율을, 30분간의 열처리 시 60℃까지는 약 90% 생존율을 보여 상당한 내열성을 나타냈다.
- 7). 양성대조구로써 시험균주의 배양에 사용된 MRS broth를 첨가한 대조구와 비교할 경우 약간 낮은 수준(58%, 1.4 Log 저하)으로 억제되었다. 유산균 배양에 일반적으로 사용되는 MRS broth는 HT-29 cell의 증식에 약간의 저해효과를 보이는 것은 배지성분 자체가 항균력을 나타내는 것과 같은 작용인 것으로 추측된다(2, 16).
- 8). 우수균주의 선발을 위한 초기 스크리닝 과정에서 항균활성을 나타낸 보인 isolate 215, 항균 및 항암억제 활성이 우수한 isolate 47 등은 세포변성 억제효과를 보이지 않았으나, Miny-148 균주는 24, 48, 72시간 모두 억제효과를 나타냈다. 이는 우수균주의 선발을 위한 최종 스크리닝 시험에서 L.
- 우수균주의 선발을 위한 초기 스크리닝 과정에서 항균활성을 나타낸 보인 isolate 215, 항균 및 항암억제 활성이 우수한 isolate 47 등은 세포변성 억제효과를 보이지 않았으나, Miny-148 균주는 24, 48, 72시간 모두 억제효과를 나타냈다. 이는 우수균주의 선발을 위한 최종 스크리닝 시험에서 L. pentosus Miny-148 균주는 각각 항균, 항암 및 항바이러스 활성이 가장 우수한 균주임을 확인하였다.
- 한편, 각각의 담즙 첨가조건에서 2시간 배양한 후 생균수를 측정한 결과, 0.3% 첨가구에서는 95.3%, 0.5%구 93.2%, 1.0%구 91.7% 등의 생존율을 나타냈다(Fig. 4). 분리균주는 담즙에 의한 부분적인 생육저해를 받지만, 1% 첨가에서도 90% 이상의 생존율을 보여 상당한 내담즙성을 지닌 것으로 해석된다.
후속연구
- 이러한 전염성과 치사율이 높은 TGEV 억제활성을 갖는 유산균에 대한 국내 연구가 미미한 상황에서 항바이러스 활성 유산균을 분리 개발한 시도로서 그 의미를 가진다고 사료된다. 여기서 보고된 유산균 L. pentosus Miny-148 균주에 대한 추가연구를 통한 생균제의 개발이 이뤄진다면 향후 여러 분야에서 활용이 가능할 것으로 기대된다.
- 이들 병원성세균이 억제되는 기작은 생성되는 젖산과 pH 저하 그리고 bacteriocin으로 잘 알려진 항균 펩타이드 등 항균물질의 생성 등 여러 요인이 관련된 것으로 추측되나(2, 9, 11, 16, 22) 정확한 항균기전 규명에 대한 추가적인 실험이 요구된다. 이와 같은 특성을 가진 균주를 생균제로써 뿐만 아니라 생산되는 대사물질에 대한 분리 추출 연구도 필요할 것으로 사료된다.
- 이들 병원성세균이 억제되는 기작은 생성되는 젖산과 pH 저하 그리고 bacteriocin으로 잘 알려진 항균 펩타이드 등 항균물질의 생성 등 여러 요인이 관련된 것으로 추측되나(2, 9, 11, 16, 22) 정확한 항균기전 규명에 대한 추가적인 실험이 요구된다. 이와 같은 특성을 가진 균주를 생균제로써 뿐만 아니라 생산되는 대사물질에 대한 분리 추출 연구도 필요할 것으로 사료된다. Casey 등(5)은 돼지 장내에서 분리한 L.
- 최근 미생물의 활력 보존을 향상시키기 위한 기술로 캡슐화 제조기술이 사용되고 있는데(13), 이 과정 역시 열안정성을 비롯한 외부환경에 대한 균주의 보호를 도모하기 위한 방법으로서 생균제로써 지녀야 균주 자체의 안정성이 우수해야 함은 기본적인 조건이라 할 수 있다. 향후 생균제 균주는 내열성과 안정성을 갖는 미생물의 발굴 필요성이 제기되는 측면이라 할 수 있다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.