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문제 정의
- 본 연구는 급성적인 산화적스트레스가 cysteine으로부터 taurine과 GSH의 생합성과정에 주는 변화를 측정하기 위해 수행되었다. 랫트의 문맥 내로 tert-butylhydroperoxide(t-BHP)를 직접 투여하여 간세포에 산화적스트레스를 유발하고 24시간 경과시까지 taurine과 GSH 합성에 관련된 지표의 변화를 모니터하였다.
제안 방법
- 12) 혈청과 NADH 용액을 혼합한 반응액에 fructose 용액을 가하고 흡광도 변화를 측정하였다. 효소 활성은 366 nm에서 1분간의 흡광도 변화를 측정하여 SDH unit/ml serum으로 나타내었다.
- 14) GSH dissulfide(GSSG)는 시료에 2-vinyl pyridine을 가해 GSH를 제거한 후 동일한 방법으로 측정하였다. 혈장과 간의 cysteine 함량은 Gaitonde의 방법을 이용하여 측정하였다.
- 혈액은 원심분리하여 혈장을 얻고 methanol을 가하여 단백질을 제거한 다음 상등액을 시료로 사용하였다. O-Phthaldialdehyde로 유도체화하고 형광검출기(FP-920, Applied Biosystem, Foster, CA, U.S.A.) 를 장착한 HPLC로 정량하였다. 0.
- )에서 구입하였다. PBS-T로 세척 후 2차 항체인 horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG(Pierce Biotechnology, Rockford, IL, U.S.A.)로 2시간 동안 처리하였다. 실험결과는 microcomputer imaging device(Model M1, Imaging Reasearch, St.
- 1 M sodium acetic acid(Solvent A)와 methanol(97)+ tetrahydrofuran(3)(v/v)(Solvent B)을 이동상으로 사용하였다. Solvent A를 0분에 90%, 0~4분에 82%로, 16~24분에 72%로, 27.5~35분에 55%로, 42.5~48분에 46%로, 48~50분에 30%로, 50~51분에 90%로 변화시키는 구배를 사용하였으며 유속은 1.2 ml/min 이었다.
- 에테르 마취시킨 랫트의 복강을 절개하고 간문맥을 통해 생리식염수에 희석시킨 t-BHP(1 mmol/ml/kg)를 투여하였다. 대조군은 같은 부피의 생리식염수를 투여하였다. 절개한 부분을 봉합하고 회복시켰으며 정해진 싯점에 복대동맥으로부터 혈액을 채취하고 간을 적출하였다.
- 9-11) 이 결과들은 유황전달경로 상에서 taurine과 GSH으로의 대사조절이 전적으로 cysteine 유용성에 의존하고 있지는 않음을 암시하고 있다. 따라서 본 연구에서는 직접적으로 간문맥 내로 강력한 산화성물질을 투여하고 cysteine으로부터 GSH와 taurine으로의 대사전환에 관여하는 인자들의 시간 경과에 따른 변화를 측정하였다. t-BHP는 산화적스트레스에 의한 세포손상기전 연구를 위해 널리 사용되는 강력한 thiol oxidizing agent로 세포내의 GSH을 산화시켜 t-butyl alcohol과 GSSG를 생성하고, GSSG는 glutathione reductase에 의해 GSH로 환원되는 과정에서 NADPH를 소모한다.
- 랫트를 55±5%의 습도, 22±2℃의 온도가 유지되는 사육실에서 일주일 이상 적응시켰으며 오전 7시를 기준으로 12시간 주기로 명암을 바꾸어 주었다.
- 본 연구는 급성적인 산화적스트레스가 cysteine으로부터 taurine과 GSH의 생합성과정에 주는 변화를 측정하기 위해 수행되었다. 랫트의 문맥 내로 tert-butylhydroperoxide(t-BHP)를 직접 투여하여 간세포에 산화적스트레스를 유발하고 24시간 경과시까지 taurine과 GSH 합성에 관련된 지표의 변화를 모니터하였다.
- 본 연구실험에서는 급성적인 산화적스트레스에 의해 간의 유황전달경로 상에서 일어나는 cysteine의 GSH와 taurine으로의 대사변화를 측정하였다. 간문맥으로 투여된 t-BHP는 신속하게 혈청 내 간독성지표를 상승시켜 3시간대에 최고값에 도달하였으며 이후 점차 감소되었다.
- 생성물인 cysteine sulfinate를 O-phthaldialdehyde/2-mercapto-ethanol으로 유도체화하고 형광검출기와 3.5 µm Kromasil C18 column(4.6×100 mm, Eka Chemicals, Bohus, Sweden)이 장착된 HPLC 로 정량하였다.
- )로 2시간 동안 처리하였다. 실험결과는 microcomputer imaging device(Model M1, Imaging Reasearch, St. Catharines, Canada)로 scanning densitometry하였다.
- 사료와 식수는 자유롭게 공급하였다. 에테르 마취시킨 랫트의 복강을 절개하고 간문맥을 통해 생리식염수에 희석시킨 t-BHP(1 mmol/ml/kg)를 투여하였다. 대조군은 같은 부피의 생리식염수를 투여하였다.
- 대조군은 같은 부피의 생리식염수를 투여하였다. 절개한 부분을 봉합하고 회복시켰으며 정해진 싯점에 복대동맥으로부터 혈액을 채취하고 간을 적출하였다.
대상 데이터
- ) 를 장착한 HPLC로 정량하였다. 0.1 M sodium acetic acid(Solvent A)와 methanol(97)+ tetrahydrofuran(3)(v/v)(Solvent B)을 이동상으로 사용하였다. Solvent A를 0분에 90%, 0~4분에 82%로, 16~24분에 72%로, 27.
- Nitrocellulose membrane을 5% bovine serum albumin으로 희석한 1차 항체와 반응시켰다. 1차 항체로는 polyclonal anti-rat CDO serum과 anti-rat GCS heavy catalytic subunit(GCS-HS) serum을 사용하였다. Anti-CDO는 Yu Hosokawa 교수(Jissen Women's University, Tokyo, Japan)로부터 기증받았으며, Anti-GCS-HS는 Detroit R&D(Detroit, MI, U.
- Anti-CDO는 Yu Hosokawa 교수(Jissen Women's University, Tokyo, Japan)로부터 기증받았으며, Anti-GCS-HS는 Detroit R&D(Detroit, MI, U.S.A.)에서 구입하였다.
- 체중 250~300 g의 웅성 Sprague-Dawley 랫트를 대한바이오링크(음성군, 충청북도)에서 구입하였다. 랫트를 55±5%의 습도, 22±2℃의 온도가 유지되는 사육실에서 일주일 이상 적응시켰으며 오전 7시를 기준으로 12시간 주기로 명암을 바꾸어 주었다.
데이터처리
- 모든 실험결과는 평균±표준오차로 표시하였으며 two-tailed Student's t-test로 비교하였다.
이론/모형
- 생성된 γ-glutamylcysteine을 O-phthaldialdehyde으로 유도체화하고 Yan과 Huxtable의 HPLC 방법을 사용하여 정량하였다.18) CDO의 활성은 Bagley 등의 방법에 따라 측정하였다.19) 반응액을 37℃에서 17분간 배양하고 methanol로 반응을 종결시켰다.
- 효소 활성은 366 nm에서 1분간의 흡광도 변화를 측정하여 SDH unit/ml serum으로 나타내었다. Alanine aminotransferase(ALT) 및 aspartate aminotransferase(AST) 활성은 Reitman 과 Frankel 의 방법으로 측정하였다.13)
- GCS 활성은 Sekura와 Meister의 방법으로 측정하였다.17) 반응액에 cysteine을 가하고 37℃에서 15분 동안 배양하였다.
- Hypotaurine과 taurine은 HPLC 방법으로 측정하였다.16) 적출한 간을 cold methanol 내에서 분쇄하고 원심분리하여 상등액을 취했다.
- Sorbitol dehydrogenase(SDH) 활성은 Gerlach의 방법으로 측정하였다.12) 혈청과 NADH 용액을 혼합한 반응액에 fructose 용액을 가하고 흡광도 변화를 측정하였다.
- 간과 혈장의 GSH는 enzymatic recycling method를 이용하여 측정하였다.14) GSH dissulfide(GSSG)는 시료에 2-vinyl pyridine을 가해 GSH를 제거한 후 동일한 방법으로 측정하였다.
- 생성된 γ-glutamylcysteine을 O-phthaldialdehyde으로 유도체화하고 Yan과 Huxtable의 HPLC 방법을 사용하여 정량하였다.
- 14) GSH dissulfide(GSSG)는 시료에 2-vinyl pyridine을 가해 GSH를 제거한 후 동일한 방법으로 측정하였다. 혈장과 간의 cysteine 함량은 Gaitonde의 방법을 이용하여 측정하였다.15)
성능/효과
- 2) 반면, GSH는 활성산소종을 직접 제거하고 친전자성 물질을 무독화시켜 세포의 critical sites를 보호할 뿐만 아니라, 이 이외에도 γ-glutamyl cycle을 통한 아미노산의 대사, bile acid 비의존성 담즙분비의 유지, 여러 효소의 활성조절, prostaglandin A와 같은 내인성물질의 합성, 그리고 DNA 합성과 면역활성과 같은 critical cellular process의 조절 등, 다양하고 중요한 생리기능을 갖고 있다.
- t-BHP는 산화적스트레스에 의한 세포손상기전 연구를 위해 널리 사용되는 강력한 thiol oxidizing agent로 세포내의 GSH을 산화시켜 t-butyl alcohol과 GSSG를 생성하고, GSSG는 glutathione reductase에 의해 GSH로 환원되는 과정에서 NADPH를 소모한다.22) GSH 고갈과 NADPH의 산화는 Ca2+ homeostasis를 파괴하여 세포독성을 유발한다.23) 또 t-BHP는 간세포의 cytochrome P450 효소나 적혈구의 hemoglobin에 의해 free radical로 전환되어 지질과산화를 유발하고 세포 및 DNA 손상을 일으킨다.
- 25) 또한 t-BHP는 랫트의 간에서 신속하게 산화적 손상을 유발하여 혈청 지표를 상승시킨다.26) 본 실험에서 간문맥 내로 투여한 t-BHP에 의해 혈청 SDH 활성은 급격하게 상승하였으며 24시간 경과하였을 때에 최고값의 약 1/10 정도로 저하되었으나 여전히 정상값에 비해 현저하게 높았다(Table I). ALT 및 AST 활성도 SDH 활성과 비슷한 양상의 변화를 보였다.
- 32) GCS는 heavy subunit(GCS-HS; ~73 kDa)과 light subunit(GCS-LS; ~30 kDa) 으로 이루어져 있다.33) GCS-HS는 GCS 활성 및 GSH에 의한 feedback inhibition과 관련이 있으며 GCS-LS는 효소활성과 직접적인 관계는 없으나 GCS의 glutamate나 GSH와의 affinity 조절기능을 갖는다.34) 많은 연구자들은 산화적스트레스 상태에서 GCS subunits의 regulation에 대해서 연구를 수행해왔다.
- 4) Cysteine은 cysteine dioxygenase(CDO)에 의해 cysteine sulfinate로 산화되고 다시 cysteine sulfinate decarboxylase(CDC)에 의해 hypotaurine으로 대사된 후 taurine으로 전환된다. GSH의 생합성은 속도조절단계에 관여하는 γ-glutamylcysteine synthetase(GCS)의 활성과 기질인 cysteine의 유용성에 의해 결정된다.
- GSH의 생합성은 속도조절단계에 관여하는 γ-glutamylcysteine synthetase(GCS)의 활성과 기질인 cysteine의 유용성에 의해 결정된다.5) 설치류에게 고단백식이나 유황함유아미노산이 강화된 사료를 공급하면 CDO 활성이 증가하며,6) 랫트 간세포 배지의 cysteine 농도증가에 따라 taurine의 생성량은 상승한다.7) 일반적으로 methionine이나 cysteine, 단백질의 공급이 증가하면 급격하게 CDO의 활성이 증가하고, GCS의 활성은 감소한다.
- 5) 설치류에게 고단백식이나 유황함유아미노산이 강화된 사료를 공급하면 CDO 활성이 증가하며,6) 랫트 간세포 배지의 cysteine 농도증가에 따라 taurine의 생성량은 상승한다.7) 일반적으로 methionine이나 cysteine, 단백질의 공급이 증가하면 급격하게 CDO의 활성이 증가하고, GCS의 활성은 감소한다. 반대로 식이를 통한 cysteine 공급량이 감소되면 CDO 활성은 저하되고 GCS 활성은 상승하여 보다 많은 양의 cysteine이 GSH 합성에 소모된다.
- 40) 결국 GSH와 taurine 합성은 cysteine 농도에 따라 서로 상반되게 변화하므로 이 유황함유아미노산은 CDO와 GCS 활성 조절의 initial signal로 제안되었다.8,41) 본 연구실험에서 간의 hypotaurine과 taurine의 농도는 CDO의 활성이 거의 일정 범위로 유지되는 것에 비해 상당히 큰 폭의 변화를 보였으며(Table II, IV), 이 변화는 간내 cysteine 농도와도 높은 상관성을 보이지 않았다. 한편 CDO의 활성과 효소단백질 발현은 t-BHP 투여 후 9시간과 24시간대에 측정하였을 때 대조군에 비해 차이를 보이지 않았다(Fig.
- 간의 cysteine 함량은 t-BHP 투여에 의해 일시적으로 감소하였으나 t-BHP 투여 9시간 후에 정상값으로 회복되었으며 24시간 후에는 정상값의 약 2배까지 증가하였다(Table Ⅱ). Cysteine으로부터 합성되는 GSH는 t-BHP 투여 9시간 후에 유의적으로 상승하였으며 24시간대에서는 정상값보다 약 50% 증가하였다. Cysteine의 또다른 주요 대사생성물인 taurine과 그 전구체인 hypotaurine은 대조동물군에서도 간조직 내에서 24시간 동안 상당히 큰 폭의 변동을 보였다.
- GSH는 간과 혈액 모두에서 t-BHP 투여 9시간 후에 증가하였으나 cysteine의 또다른 주요 대사생성물인 hypotaurine과 taurine의 농도는 t-BHP 투여에 의해 변화하지 않았다. GSH 합성과정에서 속도제한단계를 조절하는 GCS 활성 또한 9시간대부터 증가하였으나 GCS-HS 단백질 발현에는 차이가 없었다. CDO의 활성과 단백질 발현은 급성적인 산화적스트레스에 의해 변화하지 않았다.
- 간의 cysteine 함량은 t-BHP 투여에 의해 일시적으로 감소하였으나 t-BHP 투여 9시간 후에 정상값으로 회복되었으며 24시간 후에는 정상값의 약 2배까지 증가하였다(Table Ⅱ). Cysteine으로부터 합성되는 GSH는 t-BHP 투여 9시간 후에 유의적으로 상승하였으며 24시간대에서는 정상값보다 약 50% 증가하였다.
- CDO의 활성과 단백질 발현은 급성적인 산화적스트레스에 의해 변화하지 않았다. 결론적으로 본 실험결과는 산화성물질에 의해 급성적으로 손상된 간에서는 cysteine 유용성과 GCS 활성의 증가에 의해 GSH 합성이 촉진되나 이때 cysteine의 증가는 cysteine sulfinate pathway를 통한 taurine 합성에는 영향을 주지 않음을 보여주고 있다. 따라서 급성적으로 유도한 산화적스트레스 상태의 간에서 cysteine으로부터 GSH와 taurine으로의 대사조절에는 단순히 cysteine 유용성 이외에 복합적인 인자들이 관여하고 있음을 본 실험결과는 시사하고 있다.
- 9,10) 이 결과는 세포내 산화적스트레스 상태에서 cysteine의 GSH나 taurine으로의 대사전환이 cysteine 농도에 의존하지 않음을 암시한다. 또 고지방식으로 유도된 비알콜성지방간에서도 GSH는 감소되고 taurine 및 hypotaurine의 간내 농도는 현저하게 상승되었다.11) 이 결과들은 GSH의 생체내 항산화물질로서의 중추적인 역할을 고려할 때 다소 역설적으로 보인다.
- 급, 만성적인 간손상에서 유황함유아미노산의 대사는 현저하게 교란된다. 본 실험실에서는 선행연구를 통해 산화적스트레스가 주요 작용기전인 간독성물질에 의해 cysteine으로부터 GSH와 taurine으로의 대사는 현격하게 변화됨을 관찰하였다. 즉, 급성적인 ethanol 투여나 만성적인 고지방식 공급은 cysteine과 GSH의 간내 농도를 저하시키나 이 유황아미노산의 taurine으로의 전환은 역설적으로 증가하였다.
- 1, Table IV). 이 결과는 본 실험에서 사용된 조건에서 CDO 단백질 발현이나 효소활성의 regulation은 cysteine 유용성에 의존하지 않음을 보여준다.
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