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문제 정의
- 따라서, 본 연구는 국내에서도 빈번하게 발생하고 있는 어린 송아지에서의 BRV 및 BCV 감염증에 대한 방어책 강구의 일환으로, BRC와 BCV에 대한 특이 난황항체를 생산하고 이들의 면역특이성을 분석하여 그 이용 가능성을 알아보고자 실시하였다.
- 본 연구는 송아지 설사병의 주요원인체 중 소로타바이러스 (bovine rotavirus; BRV)와 소코로나바이러스 (bovine coronavirus; BCV)에 대한 난황항체를 생산하고 이의 면역 특이성을 확인하고자 실험을 실시하였으며, BRV 및 BCV를 2주 간격으로 5회 산란계에 근육주사를 실시하여 혈청과 난황내의 특이 항체 형성 유무를 확인하였다. 실험 6주차에 면역한 산란계로부터 획득한 혈청을 이용하여 교차반응 시험을 실시한 결과, BRV 및 BCV를 면역하여 얻은 혈청은 각각 BRV 및 BCV 항원과만 특이적인 결합반응을 보였다.
제안 방법
- 8) 용액에 용해시킨 기질을 plate에 가하여 37℃에서 20분간 발색반응을 시켰다. 5 M NaOH를 첨가하여 반응을 정지시킨 후, Microplate reader (Molecular Devices; E Max)를 사용하여 405 nm에서 흡광도 (optical density)를 측정하였다. 이 결과를 이용하여 항체가를 산출하였으며 모든 실험은 3반복 실시하였다.
- BRV 및 BCV를 면역한 산란계로부터 획득한 난황항체가 각 바이러스 항원을 중화할 수 있는 능력 유무를 확인 하기 위하여 혈구응집억제반응시험 (HI test)을 실시하였다. 그 결과, BRV 항원을 면역한 산란계로부터 얻어진 난황 항체의 HI unit는 5,120로 비면역 대조군의 난황항체 역가 160에 비해 월등히 높은 것으로 나타났으며 (Table 2), BCV 항원을 면역한 산란계의 난황항체도 역시 HI unit가 1,280으로 대조군에 비하여 높은 중화력을 나타내는 것으로 조사되었다 (Table 3).
- BRV 및 BCV에 대한 혈청 및 난황내 항체가 측정은 실험 0, 2, 4, 6, 8, 12 주차에 ELISA법으로 실시하였으며, 앞서 서술한 교차반응 시험과 동일한 수순으로 진행하였다 (김 등, 2000). 항원으로 각각 1 × 108 PFU/ml의 BRV 및 BCV 배양액을 사용하였으며, 면역한 산란계의 혈청 및 난황항체를 각각 3배수씩 단계 희석하여 실험에 사용하였으며 모든 실험은 3반복 실시하였다.
- BRV와 BCV antigen을 산란계에 2주 간격으로 5번 면역을 실시하는 동안, 실험 6주째에 혈청 중 항체형성 유무를 확인하고 이들 항체의 각 항원에 대한 면역 특이성 검사를 실시하였다. 송아지에서 설사병을 유발한다고 알려져 있는 일부 대장균종 (F4, F5, F6, F41)과 살모넬라균종(S.
- BRV와 BCV antigen을 산란계에 2주 간격으로 5번의 면역을 실시하는 동안, 실험 6주째에 혈청 중 항체형성 유무를 확인하고 이들 항체의 각 항원에 대한 면역 특이성을 조사하기 위하여 일부 대장균종 (F4, F5, F6, F41)과 살모넬라균종 (S. typhimurium, S. dublin), 그리고 각각 BRV 및 BCV 항원과의 교차반응 시험을 실시하였다. 그 결과, BRV 및 BCV를 면역한 혈청은 각각 BRV 항원과 BCV 항원과 특이적인 결합반응 보였으며, 시험에 사용한 대장균 종과 살모넬라균 종과는 전혀 반응하지 않는 것으로 나타났다 (Table 1).
- BRV와 BCV antigen을 산란계에 2주 간격으로 5회 면역한 다음, 실험 0, 2, 4, 6, 8, 12주에 각각의 항원에 대한 혈청 및 난황내 항체 역가를 측정하였다. 그 결과, BRV 및 BCV에 대한 혈청 및 난황내 항체역가는 면역한 후 2주 경부터 증가되기 시작하여 8~12주경에는 최고의 수준에 도달하였다 (Fig.
- BRV와 BCV 배양을 위하여 각각 MA104 세포주 (Rhesus monkey kidney cell line)와 MadinDarby bovine kidney (MDBK) 세포주를 사용하여 Eagle’s minimum essential medium (EMEM)에 10% Fetal bovine serum (FBS)을 첨가하여 배양하였다.
- 혈구응집반응 (Hemagglutination; HA) 및 혈구응집억제반응 (Hemagglutination inhibition; HI) 시험은 Park 등 (2007)의 방법을 변형하여 실시하였다. HA 시험은 BRV 및 BCV 각각의 배양액을 96-well V bottom plate (Falcon)에서 PBS 로 2배수씩 단계 희석을 한 다음, VAD buffer (0.15M NaCl, 0.3M Na2HPO4, 0.15M NaH2PO4, pH 6.0)에 0.5%로 희석한 돼지 적혈구 용액을 동일부피로 첨가하여 혼합하고 4℃에서 정치하여 혈구응집반응을 유도하였다. HI 시험을 위하여, 우선 실험 12주차에 획득한 난황항체 수용액을 2배수씩 단계 희석하여 50 ㎕씩 분주한 다음, 동일 부피의 바이러스 배양액 (4 HA units/50 ㎕)을 첨가하여 혼합하고 상온에서 1시간 동안 정치하였다.
- 5%로 희석한 돼지 적혈구 용액을 동일부피로 첨가하여 혼합하고 4℃에서 정치하여 혈구응집반응을 유도하였다. HI 시험을 위하여, 우선 실험 12주차에 획득한 난황항체 수용액을 2배수씩 단계 희석하여 50 ㎕씩 분주한 다음, 동일 부피의 바이러스 배양액 (4 HA units/50 ㎕)을 첨가하여 혼합하고 상온에서 1시간 동안 정치하였다. 이후, 동일 부피의 0.
- 각각 1 × 108 PFU/ml의 BRV 및 BCV를 0.15M PBS에 유화시킨 0.5 ml 을 동량의 Freund’s adjuvant와 혼합하여 충분히 교반한 다음 면역원으로 사용하였으며, 이를 산란계의 흉근 4군데에 각각 0.25 ml씩 근육주사를 실시하였다.
- 0로 적정한 후 －20℃에서 24시간 동결하였다. 동결된 난황희석액을 해동시킨 다음, 15℃, 10,000g로 30분간 원심분리를 실시하여 상청액을 수거하였고, 다시 수거액을 8℃에서 Whatman No. 1으로 여과하여 수용성 난황항체를 분리하여 항체가 측정 및 혈구응집억제반응 시험에 사용하였다.
- 5% 돼지 적혈구 희석액을 가한 다음, 4℃에서 12시간 응집억제반응을 유도하였다. 모든 시험은 독립실험으로 2반복 실시하였다.
- BRV와 BCV 배양을 위하여 각각 MA104 세포주 (Rhesus monkey kidney cell line)와 MadinDarby bovine kidney (MDBK) 세포주를 사용하여 Eagle’s minimum essential medium (EMEM)에 10% Fetal bovine serum (FBS)을 첨가하여 배양하였다. 바이러스를 감염시킨 후 2~3 일경에 세포변성이 확인되면 얼리고 녹이는 과정을 3회 반복하여 바이러스를 유리시키고 원심분리를 통하여 얻어진 상청액을 모아 바이러스 역가를 측정하여 면역에 이용하였다 (Khattar and Pandey, 1990; 안과 강, 1998).
- 외관상 건강한 개체를 1차 선별하였고 2차적으로 BRV 및 BCV에 대한 혈청 항체가를 측정하여 항체 형성이 되지 않은 30수를 시험동물로 공시하였다. 시험구의 배치는 완전 임의로 15 마리씩 2개 군으로 나누어 BRV와 BCV 면역을 실시하였다. 시험동물은 개별 케이지에 한 수씩 사육하였으며, 시험 전 기간 동안 일일 16시간 점등하였고, 온도는 22 ± 2℃로 유지하였고, 사료와 물은 자유섭식토록 하였다.
- 시험동물은 개별 케이지에 한 수씩 사육하였으며, 시험 전 기간 동안 일일 16시간 점등하였고, 온도는 22 ± 2℃로 유지하였고, 사료와 물은 자유섭식토록 하였다.
- 5 M NaOH를 첨가하여 반응을 정지시킨 후, Microplate reader (Molecular Devices; E Max)를 사용하여 405 nm에서 흡광도 (optical density)를 측정하였다. 이 결과를 이용하여 항체가를 산출하였으며 모든 실험은 3반복 실시하였다.
- 25 ml씩 근육주사를 실시하였다. 이러한 면역을 2주 간격으로 5회 수행하였다 (김 등, 2000).
- 항원으로 각각 1 × 108 PFU/ml의 BRV 및 BCV 배양액을 사용하였으며, 면역한 산란계의 혈청 및 난황항체를 각각 3배수씩 단계 희석하여 실험에 사용하였으며 모든 실험은 3반복 실시하였다.
- 혈구응집반응 (Hemagglutination; HA) 및 혈구응집억제반응 (Hemagglutination inhibition; HI) 시험은 Park 등 (2007)의 방법을 변형하여 실시하였다. HA 시험은 BRV 및 BCV 각각의 배양액을 96-well V bottom plate (Falcon)에서 PBS 로 2배수씩 단계 희석을 한 다음, VAD buffer (0.
대상 데이터
- BRV 및 BCV는 국립수의과학검역원으로 분양을 받아 실험에 이용하였다. BRV와 BCV 배양을 위하여 각각 MA104 세포주 (Rhesus monkey kidney cell line)와 MadinDarby bovine kidney (MDBK) 세포주를 사용하여 Eagle’s minimum essential medium (EMEM)에 10% Fetal bovine serum (FBS)을 첨가하여 배양하였다.
- 본 연구를 위하여 36주령 Hyline Brown 품종의 산란계를 이용하였다. 외관상 건강한 개체를 1차 선별하였고 2차적으로 BRV 및 BCV에 대한 혈청 항체가를 측정하여 항체 형성이 되지 않은 30수를 시험동물로 공시하였다.
- 본 연구를 위하여 36주령 Hyline Brown 품종의 산란계를 이용하였다. 외관상 건강한 개체를 1차 선별하였고 2차적으로 BRV 및 BCV에 대한 혈청 항체가를 측정하여 항체 형성이 되지 않은 30수를 시험동물로 공시하였다. 시험구의 배치는 완전 임의로 15 마리씩 2개 군으로 나누어 BRV와 BCV 면역을 실시하였다.
이론/모형
- 분리된 혈청은 －70℃에 보관하였다가 교차반응 시험 및 항체가 측정을 위한 실험에 사용하였다. 매일 수거된 계란으로부터 난황항체의 분리는 김 등 (2000)의 방법에 따라 실시하였다. 채집한 난으로부터 난황만을 분리한 후 증류수 (pH 5.
- BRV와 BCV antigen을 산란계에 2주 간격으로 5번 면역을 실시하는 동안, 실험 6주째에 혈청 중 항체형성 유무를 확인하고 이들 항체의 각 항원에 대한 면역 특이성 검사를 실시하였다. 송아지에서 설사병을 유발한다고 알려져 있는 일부 대장균종 (F4, F5, F6, F41)과 살모넬라균종(S. typhimurium, S. dublin), 그리고 각각 BRV 및 BCV 항원과의 교차반응 유무를 확인하기 위하여 indirect enzymelinked immunosorbent assay (ELISA)법으로 시험을 실시하였는데, 그 측정방법은 다음과 같다 (김 등, 2000). Carbonatebicarbonate buffer (pH 9.
성능/효과
- 면역에 따른 혈청항체 및 난황항체의 수준은 실험 8~12주차에 최고도에 달했고, BRV에 대한 항체의 경우 혈청과 난황내에서 면역 후 12주째에 각각 약 104,000과 107,000의 역가 수준을 보였으며, BCV의 경우 8주째에 각각 약 145,000과 155,000의 수준을 보였다. BRV 및 BCV에 대한 중화능력 유무 확인을 위하여 분리된 난황항체를 이용하여 혈구응집억제반응 시험을 실시한 결과, BRV 및 BCV에 대한 혈구응집억제 희석비가 각각 5,120 및 1,260으로 면역하지 않은 대조군에 비하여 8배 이상 높은 중화력을 나타냈다. 이러한 결과를 종합하면, 산란계에 BRV 및 BCV를 면역하여 얻어진 난황항체는 BRV 및 BCV에 대한 면역 특이성을 가지고 중화할 수 있는 능력이 있으며, 이러한 난황항체는 BRV 및 BCV의 증식을 효과적으로 억제시킬 수 있어 임상에 적용할 경우 유용할 것으로 사료된다.
- dublin), 그리고 각각 BRV 및 BCV 항원과의 교차반응 시험을 실시하였다. 그 결과, BRV 및 BCV를 면역한 혈청은 각각 BRV 항원과 BCV 항원과 특이적인 결합반응 보였으며, 시험에 사용한 대장균 종과 살모넬라균 종과는 전혀 반응하지 않는 것으로 나타났다 (Table 1).
- BRV와 BCV antigen을 산란계에 2주 간격으로 5회 면역한 다음, 실험 0, 2, 4, 6, 8, 12주에 각각의 항원에 대한 혈청 및 난황내 항체 역가를 측정하였다. 그 결과, BRV 및 BCV에 대한 혈청 및 난황내 항체역가는 면역한 후 2주 경부터 증가되기 시작하여 8~12주경에는 최고의 수준에 도달하였다 (Fig. 1). BRV에 대한 항체의 경우, 혈청과 난황내에서 면역 후 12주째에 각각 약 104,000과 107,000의 역가 수준을 보였으며 (Fig.
- BRV 및 BCV를 면역한 산란계로부터 획득한 난황항체가 각 바이러스 항원을 중화할 수 있는 능력 유무를 확인 하기 위하여 혈구응집억제반응시험 (HI test)을 실시하였다. 그 결과, BRV 항원을 면역한 산란계로부터 얻어진 난황 항체의 HI unit는 5,120로 비면역 대조군의 난황항체 역가 160에 비해 월등히 높은 것으로 나타났으며 (Table 2), BCV 항원을 면역한 산란계의 난황항체도 역시 HI unit가 1,280으로 대조군에 비하여 높은 중화력을 나타내는 것으로 조사되었다 (Table 3).
- 1B). 그리고, BRV와 BCV를 면역한 산란계 모두에서 BRV 및 BCV 항원 면역 첫 접종부터 4주경까지는 혈청항체 역가의 수준이 난황항체 역가의 수준보다 높았으나 8주 이후부터는 난황항체의 역가 수준이 더 높은 것으로 나타났다(Fig. 1).
- 이러한 결과는, BRV와 BCV antigen을 면역한 산란계로부터 BRV 및 BCV 특이적인 항체 생산이 가능하며, 이 난황항체를 이용하여 수동면역 유도 시, 특이적인 항원항체 결합반응이 유발될 가능성이 큰 것으로 사료되었다. 또한 혈구응집억제반응 시험에서 BRV 및 BCV 항원을 면역하여 획득한 난황항체의 중화능력이 면역하지 않은 대조군에 비하여 8배 이상으로 월등히 높은 것을 확인할 수 있었다. 이를 통하여, 면역에 의하여 획득된 난황항체가 실질적으로 바이러스를 중화할 수 있는 활성이 있다는 것을 재확인하였다.
- 실험 6주차에 면역한 산란계로부터 획득한 혈청을 이용하여 교차반응 시험을 실시한 결과, BRV 및 BCV를 면역하여 얻은 혈청은 각각 BRV 및 BCV 항원과만 특이적인 결합반응을 보였다. 면역에 따른 혈청항체 및 난황항체의 수준은 실험 8~12주차에 최고도에 달했고, BRV에 대한 항체의 경우 혈청과 난황내에서 면역 후 12주째에 각각 약 104,000과 107,000의 역가 수준을 보였으며, BCV의 경우 8주째에 각각 약 145,000과 155,000의 수준을 보였다. BRV 및 BCV에 대한 중화능력 유무 확인을 위하여 분리된 난황항체를 이용하여 혈구응집억제반응 시험을 실시한 결과, BRV 및 BCV에 대한 혈구응집억제 희석비가 각각 5,120 및 1,260으로 면역하지 않은 대조군에 비하여 8배 이상 높은 중화력을 나타냈다.
- 난황항체는 다클론성 항체이나 종특이적인 면역체계로 인하여 교차반응이 적은 항체 생산이 가능한 것으로 알려져 있다 (Knecht 등, 1996; Kovacs-Nolan and Mine, 2004). 본 연구에서도 BRV와 BCV 항원을 면역한 산란계의 혈청을 이용하여 가축에서 질병을 유발하는 일부 대장균종(F4, F5, F6, F41)과 살모넬라균종 (S. typhimurium, S. dublin), 그리고 각각 BRV 및 BCV 항원과의 교차반응 시험을 실시한 결과, BRV 및 BCV를 면역한 혈청은 각각 BRV 및 BCV 항원과만 특이적인 결합반응 보였다. 이러한 결과는, BRV와 BCV antigen을 면역한 산란계로부터 BRV 및 BCV 특이적인 항체 생산이 가능하며, 이 난황항체를 이용하여 수동면역 유도 시, 특이적인 항원항체 결합반응이 유발될 가능성이 큰 것으로 사료되었다.
- 본 연구는 송아지 설사병의 주요원인체 중 소로타바이러스 (bovine rotavirus; BRV)와 소코로나바이러스 (bovine coronavirus; BCV)에 대한 난황항체를 생산하고 이의 면역 특이성을 확인하고자 실험을 실시하였으며, BRV 및 BCV를 2주 간격으로 5회 산란계에 근육주사를 실시하여 혈청과 난황내의 특이 항체 형성 유무를 확인하였다. 실험 6주차에 면역한 산란계로부터 획득한 혈청을 이용하여 교차반응 시험을 실시한 결과, BRV 및 BCV를 면역하여 얻은 혈청은 각각 BRV 및 BCV 항원과만 특이적인 결합반응을 보였다. 면역에 따른 혈청항체 및 난황항체의 수준은 실험 8~12주차에 최고도에 달했고, BRV에 대한 항체의 경우 혈청과 난황내에서 면역 후 12주째에 각각 약 104,000과 107,000의 역가 수준을 보였으며, BCV의 경우 8주째에 각각 약 145,000과 155,000의 수준을 보였다.
- dublin), 그리고 각각 BRV 및 BCV 항원과의 교차반응 시험을 실시한 결과, BRV 및 BCV를 면역한 혈청은 각각 BRV 및 BCV 항원과만 특이적인 결합반응 보였다. 이러한 결과는, BRV와 BCV antigen을 면역한 산란계로부터 BRV 및 BCV 특이적인 항체 생산이 가능하며, 이 난황항체를 이용하여 수동면역 유도 시, 특이적인 항원항체 결합반응이 유발될 가능성이 큰 것으로 사료되었다. 또한 혈구응집억제반응 시험에서 BRV 및 BCV 항원을 면역하여 획득한 난황항체의 중화능력이 면역하지 않은 대조군에 비하여 8배 이상으로 월등히 높은 것을 확인할 수 있었다.
- BRV 및 BCV에 대한 중화능력 유무 확인을 위하여 분리된 난황항체를 이용하여 혈구응집억제반응 시험을 실시한 결과, BRV 및 BCV에 대한 혈구응집억제 희석비가 각각 5,120 및 1,260으로 면역하지 않은 대조군에 비하여 8배 이상 높은 중화력을 나타냈다. 이러한 결과를 종합하면, 산란계에 BRV 및 BCV를 면역하여 얻어진 난황항체는 BRV 및 BCV에 대한 면역 특이성을 가지고 중화할 수 있는 능력이 있으며, 이러한 난황항체는 BRV 및 BCV의 증식을 효과적으로 억제시킬 수 있어 임상에 적용할 경우 유용할 것으로 사료된다.
- 또한 혈구응집억제반응 시험에서 BRV 및 BCV 항원을 면역하여 획득한 난황항체의 중화능력이 면역하지 않은 대조군에 비하여 8배 이상으로 월등히 높은 것을 확인할 수 있었다. 이를 통하여, 면역에 의하여 획득된 난황항체가 실질적으로 바이러스를 중화할 수 있는 활성이 있다는 것을 재확인하였다. 따라서, 본 연구에서 생산된 BRV, BCV에 대한 특이 난황항체를 현장에 적용할 경우, BRV 및 BCV의 증식을 효과적으로 억제시킬 수 있을 것으로 사료된다.
후속연구
- 따라서, 국내에서도 이와 같은 시도를 할 필요성이 있으며, 더불어 난황항체의 이용을 확대할 필요성이 있다. 결론적으로 본 실험을 통하여, 송아지 설사병의 주요 원인체인 BRV 및 BCV에 대한 특이적인 난황항체를 생산하여 in vitro에서그 중화 활성을 확인하였으며, 이러한 특이 난황항체를 실제 임상에 적용하기 위해서는 송아지 적용 시험이 추가적으로 이루어져야 할 것이다.
- 이를 통하여, 면역에 의하여 획득된 난황항체가 실질적으로 바이러스를 중화할 수 있는 활성이 있다는 것을 재확인하였다. 따라서, 본 연구에서 생산된 BRV, BCV에 대한 특이 난황항체를 현장에 적용할 경우, BRV 및 BCV의 증식을 효과적으로 억제시킬 수 있을 것으로 사료된다.
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