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문제 정의
- 따라서 본 연구에는 정액검사 상 정상 정자를 온도에 따라 일정기간 보존하고, 정자의 운동성, 운동 역학, 정자막 온전성 및 수정능획득 상태를 분석하여 일정기간 동안 정자의 생존성과 기능을 최대한 유지할 수 있는 정자의 최적 배양방법을 분석하기 위하여 시행하였다.
- 정자의 수정능획득과 첨체반응 정도에 따라 수정능력을 평가할 수 있는데. 본 연구에서는 CTC 염색으로 보존기간 동안 수정능획득과 첨체반응이 일어난 정자의 비율을 분석하였다. 보존기간 동안 온도에 따라 수정능획득과 첨체반응간의 유의한 차이는 보이지 않았고, ART 시술을 위하여 첨체반응의 유도가 필요한 것으로 사료된다.
제안 방법
- 12 UV BP 340-380/LP 425와 BP 450-490/LP 515 filters 하에 NiKon microphotFXA 현미경을 이용하여 슬라이드당 600마리의 정자를 Fraser 등 (1995)의 방법 즉, 살아 있는 정자 중 수정능획득이 야기되지 않은 정자 (F pattern), 수정능 획득이 야기된 정자 (B pattern), 첨체반응이 일어난 정자 (AR pattern)로 분류하였다.11
- 7 또한 Calamera (2001) 등은 정자를 37℃에서 보존하면 48시간 동안 점차적으로 운동성이 감소하나, 정자막의 온전성과 chromatin DNA의 안정성과 연속적으로 일어나는 첨체반응이나 첨체반응을 유도한 결과가 48시간 동안 유의차가 없다고 보고하였다. 23 본 연구는 정장을 제거한 후 정자를 HTALP로 세척하고 각각 4℃, 22℃ 및 37℃에서 5일간 배양하는 동안 정자의 수정능력에 영향을 미치는 운동성과 운동역학, 생존성, 정자막의 온전성 및 수정능획득과 첨체반응의 변화를 분석하였다. 이러한 정자의 요소들은 정자를 5일간 보존하는 동안 온도조건과 관계없이 시간이 경과함에 따라 모두 유의하게 감소하였다.
- 개인차이를 최대한 배제하기 위하여 일회의 실험을 수행하기 위하여 4명의 정액을 섞어 사용하였고, 정장액을 제거하기 위하여 HTALP로 희석하여 400×g에서 5분간 3회 세척하였다.
- 정액에서 정장을 제거하기 위한 기본 배양액은 HEPES가 첨가된 Tyrod's-Albumin-Lactate-Pyruvate (HTALP) 배양액을 사용하였으며, 성분은 114 mM NaCl, 0.3 mM NaH2PO4, 3.1 mM KCl, 2.1 mM CaCl2, 0.4 mM MgCl2, 10 mM sodium lactate, 2 mM NaHCO3, 0.2 mM sodium pyruvate, 10 mM HEPES, 및 10 μg/ mL gentamycin을 첨가하였다.
- 정자의 최종농도는 0.3% BSA가 첨가된 배양액으로 1×106/ml로 조정하였으며, 4℃, 22℃, 및 37℃에서 5일 간 배양하였다.
- 정액채취는 3일간 금욕한 남성에게서 수음을 통하여 이루어졌고, 세계보건기구 기준에 따라 정상소견을 보이는 11명의 정액을 사용하였다. 채취된 정액은 30분간 액화시키고 컴퓨터정액분석기 (SAIS version 10.1, Medical Supply, Korea)를 이용하여 정자의 수, 운동성 및 운동역학 즉, Curvilinear Velocity (VCL), Straight-Line Velocity (VSL), Average-Path Velocity (VAP), Linearity (LIN)을 분석하였다. Table 1에 본 실험에 공시한 11명의 정액검사결과를 요약하였다.
대상 데이터
- 1, Medical Supply, Korea)를 이용하여 정자의 수, 운동성 및 운동역학 즉, Curvilinear Velocity (VCL), Straight-Line Velocity (VSL), Average-Path Velocity (VAP), Linearity (LIN)을 분석하였다. Table 1에 본 실험에 공시한 11명의 정액검사결과를 요약하였다.
- 정액채취는 3일간 금욕한 남성에게서 수음을 통하여 이루어졌고, 세계보건기구 기준에 따라 정상소견을 보이는 11명의 정액을 사용하였다. 채취된 정액은 30분간 액화시키고 컴퓨터정액분석기 (SAIS version 10.
데이터처리
- 5일간 각각의 온도에서 배양한 정자의 특성 비교는 일원배치법을 사용하였다. 배양일에 따라 변화하는 정자의 특성은 반복 측정 자료의 분산분석법을 사용하였으며, 사후분석은 Turkey test를 이용하였다. 모든 검정은 p<0.
이론/모형
- 0, SPSS Inc, USA)을 이용하였다. 5일간 각각의 온도에서 배양한 정자의 특성 비교는 일원배치법을 사용하였다. 배양일에 따라 변화하는 정자의 특성은 반복 측정 자료의 분산분석법을 사용하였으며, 사후분석은 Turkey test를 이용하였다.
- 수정능획득을 평가하기 위해서 Perez 등 (1996)이 보고한 Hoechst 33258 (H258)/chlorotetracycline (CTC) 형광 염색법을 이용하였다.12 UV BP 340-380/LP 425와 BP 450-490/LP 515 filters 하에 NiKon microphotFXA 현미경을 이용하여 슬라이드당 600마리의 정자를 Fraser 등 (1995)의 방법 즉, 살아 있는 정자 중 수정능획득이 야기되지 않은 정자 (F pattern), 수정능 획득이 야기된 정자 (B pattern), 첨체반응이 일어난 정자 (AR pattern)로 분류하였다.
성능/효과
- ) 와 모든 배양온도 (4℃, 22℃, 및 37℃ in air)에서 배양일이 경과함에 따라 운동성이 유의하게 감소하였다. 1일 후의 정자 운동성은 대조구, 22℃ 및 37℃ in air에서 각 31.8%, 28.3%, 30.5%로 유의한 차이가 없었으나, 4℃에서는 13.1%로 다른 온도조건보다 운동성이 유의하게 낮았다. 그러나 3일과 5일 후에는 22℃에서 배양된 정자의 운동성이 대조구와 다른 온도조건에서 배양된 정자의 운동성보다 유의하게 높게 나타났다.
- 5일 동안 배양된 정자는 대조구 (37℃, 5% CO2) 와 모든 배양온도 (4℃, 22℃, 및 37℃ in air)에서 배양일이 경과함에 따라 운동성이 유의하게 감소하였다. 1일 후의 정자 운동성은 대조구, 22℃ 및 37℃ in air에서 각 31.
- 1%로 다른 온도조건보다 운동성이 유의하게 낮았다. 그러나 3일과 5일 후에는 22℃에서 배양된 정자의 운동성이 대조구와 다른 온도조건에서 배양된 정자의 운동성보다 유의하게 높게 나타났다.
- 21 본 연구에서 각 온도조건에서 정자를 배양 후 정자의 운동성은 1일에 대조구와 22℃, 37℃간에는 유의차는 없었으나 4℃에서만 유의하게 감소하여 cold shock이 일어난 것으로 보인다. 그러나 정자의 운동역학, 생존성, 정자막의 온전성 및 CTC pattern에서 정자보존 1일 후 온도조건간 유의한 차이가 없는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 비록 낮은 온도조건에서 1일간 정자를 보존하는 경우 정자막의 물리적인 변화가 운동성을 저하시켜도 수정능력에 영향을 주지 않는 것으로 사료된다.
- 본 연구에서 보존 1일까지는 정자의 운동성과 생존성이 22℃와 37℃에서 잘 유지되었다. 또한 1일 이후 정자를 보존하는 경우 22℃에서 HTALP로 보존하는 것이 정자의 운동성을 연장시키며, 첨체의 소실을 지연시켜 생존성을 유지하는 것으로 확인되었다. 따라서 이러한 정자 배양 혹은 보존방법은 ART 시술 시 정액채취가 원활히 시행될 수 없는경우, 시술자로 하여금 난자의 이용에 관한 계획을 수립 및 ART 시술 시 정자를 5일까지 보존하는 경우에 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
- F pattern 정자의 비율은 대조구, 4℃ 및 37℃에서 배양일에 따라 유의하게 감소한 반면, 22℃에서는 정자의 배양기간 동안 F pattern의 유의한 차이가 나타나지 않았다 (Figure 3). 또한 배양 1일 후에 대조구와 각각의 온도조건에서 F pattern은 유의한 차이가 없었으나, 3일과 5일 후에는 22℃에서 유의하게 높았다. 한편 B와 AR pattern을 보이는 정자의 비율은 모든 온도조건에서 배양일의 경과함에 따라 유의한 차이가 없었고, 배양 1일, 3일, 5일 후에 B와 AR pattern은 배양온도간 유의적 차이가 나타나지 않았다.
- 배양 1일 후, 대조구와 각 온도조건에서 배양된 정자의 생존성과 정자막의 온전성간의 유의한 차이는 없었으나, 3일과 5일 후에는 정자의 생존성과 정자막의 온전성이 다른 온도조건보다 22℃에서 유의하게 높은 것으로 나타났다.
- 본 연구에서 보존 1일까지는 정자의 운동성과 생존성이 22℃와 37℃에서 잘 유지되었다. 또한 1일 이후 정자를 보존하는 경우 22℃에서 HTALP로 보존하는 것이 정자의 운동성을 연장시키며, 첨체의 소실을 지연시켜 생존성을 유지하는 것으로 확인되었다.
- 13,16 본 연구에서 정자의 정자막의 온전성도 온도조건에 상관없이 시간이 경과함에 따라 감소하였다. 정자 배양 후 1일에는 각 온도조건에 대한 유의차가 없었으나, 3일경과 후에는 22℃에서 보존된 정자에서 정자막의 온전성이 높게 나타나 정자 수정능력 보존에 가장 적합한 온도로 평가되었다. 흥미롭게도 정자의 운동성, 생존성 및 정자막의 온전성의 관계를 시간에 따른 변화 그래프로 나타내면 운동성이 가장 급격하게 감소가 일어나고, 그 다음은 생존성, 마지막으로 정자막의 온전성이 시간에 따라 가장 완만한 감소가 일어나는 것으로 나타났다.
- Figure 2에 정자의 생존성과 정자막의 온전성 변화에 대한 결과를 요약하였다. 정자의 생존성은 대조구, 4℃ 및 37℃에서 배양일이 경과함에 따라 유의하게 감소하였으나, 22℃에서는 배양일이 경과함에 따라 생존성의 변화가 유의하게 나타나지 않았다. 정자막의 온전성은 대조구와 37℃에서 배양일이 경과함에 따라 유의하게 감소한 반면, 4℃와 22℃에서는 배양일이 경과함에 따른 변화는 나타나지 않았다.
- 정자의 운동역학 변수 중 VCL, VSL, VAP도 1일 후에 각 배양온도간의 유의한 차이는 없었으나, 3일과 5일 후에는 22℃에서 배양된 정자에서 유의하게 높게 나타났다. 그러나 정자의 LIN는 5일 동안 각 온도조건에서 배양된 정자간에 유의한 차이는 보이지 않았다 (Figure 1).
- 네 명의 남성으로부터 채취된 정액을 혼합한 후 혼합정액의 검사결과는 Table 2에 요약하였다. 즉 정자의 운동성은 63.58%, 생존성은 62.00%, 정자막의 온전성은 67.14%였으며, CTC에 의한 F pattern은 37.13%, B pattern은 11.38% 및 AR은 13.50%였다.
- 또한 배양 1일 후에 대조구와 각각의 온도조건에서 F pattern은 유의한 차이가 없었으나, 3일과 5일 후에는 22℃에서 유의하게 높았다. 한편 B와 AR pattern을 보이는 정자의 비율은 모든 온도조건에서 배양일의 경과함에 따라 유의한 차이가 없었고, 배양 1일, 3일, 5일 후에 B와 AR pattern은 배양온도간 유의적 차이가 나타나지 않았다.
- 그러나 3일 이후 22℃에서 정자의 모든 요소들이 다른 온도조건보다 유의하게 높은 것으로 나타났다. 한편, 3일 이후 4℃에서 보존한 정자와 37℃에서 보존한 정자를 비교하면 운동성, 운동역학, 생존성 및 CTC pattern에서 유의한 차이가 없는 반면 시간이 경과할수록 37℃에서보다 4℃에서 정자막의 온전성이 유의하게 높은 것으로 나타났다. 이는 시간이 경과함에 따라 높은 온도에서 정자를 보존 시 낮은 온도에 비해 정자막이 쉽게 손상받을 수 있음을 시사한다.
- 따라서 난포액을 첨가한 37℃ 배양액에서 정자가 수정능획득이 야기되며, 실온에서 정자를 보존한다면 수정능획득을 유도하기 위하여 37℃에서 16시간 이상 배양하여야 한다고 보고하였다. 한편, 본 연구에서 F pattern은 정자의 배양 1일 후 각 온도조건에서 유의한 차이가 없었으나 3일부터 22℃에서 높게 보존되는 것이 확인되어 형광검사에 의한 정자의 생존성도 22℃에서 ART 시술에 적합한 수준으로 유지됨을 알 수 있었다.
- 이러한 정자의 요소들은 정자를 5일간 보존하는 동안 온도조건과 관계없이 시간이 경과함에 따라 모두 유의하게 감소하였다. 한편, 정자의 운동성과 운동역학들은 정자 배양 1일 후 유의적인 차이가 없었으나, 3일경과 후부터는 LIN를 제외한 정자의 운동성, VCL, VSL, VAP가 22℃에서 배양된 정자에서 유의하게 높게 나타났다. Hirano 등 (2001)은 IVF 시술 시 정자의 운동역학 변수 중 VCL은 수정능력과 밀접한 관계를 가졌다고 보고하였고, 14 Shibahara 등 (2004)은 IUI에서 VAP, VCL, VSL은 임신을 예측하는데 이용될 수 있다고 보고하였다.
- 정자 배양 후 1일에는 각 온도조건에 대한 유의차가 없었으나, 3일경과 후에는 22℃에서 보존된 정자에서 정자막의 온전성이 높게 나타나 정자 수정능력 보존에 가장 적합한 온도로 평가되었다. 흥미롭게도 정자의 운동성, 생존성 및 정자막의 온전성의 관계를 시간에 따른 변화 그래프로 나타내면 운동성이 가장 급격하게 감소가 일어나고, 그 다음은 생존성, 마지막으로 정자막의 온전성이 시간에 따라 가장 완만한 감소가 일어나는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 Hossain 등 (2007)의 결과와 동일하며, 정자를 실온 (24℃)에서 7일간 보존 시 ART 시술 중 ICSI에 적합한정자를 얻을 수 있다고 하였다.
후속연구
- 또한 1일 이후 정자를 보존하는 경우 22℃에서 HTALP로 보존하는 것이 정자의 운동성을 연장시키며, 첨체의 소실을 지연시켜 생존성을 유지하는 것으로 확인되었다. 따라서 이러한 정자 배양 혹은 보존방법은 ART 시술 시 정액채취가 원활히 시행될 수 없는경우, 시술자로 하여금 난자의 이용에 관한 계획을 수립 및 ART 시술 시 정자를 5일까지 보존하는 경우에 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
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