단백질 분해효소는 아미노산 간에 존재하는 공유결합인 펩티드 결합을 절단하는 효소이며, 세계적으로 가장 많이 판매되는 효소이다. 해양 심층수로부터 분리된 Micrococcus sp. HJ19의 체외분비 단백질 분해효소를 생산하는 최적의 배지조건을 조사하기 위하여 기본배지로 변형 STY 배지(1% tryptone, 0.15% yeast extract, 0.01% NaCl, 여과살균한 바닷물)를 사용하였다. 탄소원으로 포도당보다 갈락토오스를 사용하였을 때 1.3배로 높은 활성을 보여주었으며, 질소원으로는 casamino acid를 사용하였을 때 가장 낮은 활성을 보여준 반면, 맥아추출물을 사용하였을 때 가장 높은 활성을 나타내었다. 생산된 체외단백질 분해효소는 $35^{\circ}C$에서 최적의 활성을 나타내었으며, 최적 pH는 8.5로 판명되었다.
단백질 분해효소는 아미노산 간에 존재하는 공유결합인 펩티드 결합을 절단하는 효소이며, 세계적으로 가장 많이 판매되는 효소이다. 해양 심층수로부터 분리된 Micrococcus sp. HJ19의 체외분비 단백질 분해효소를 생산하는 최적의 배지조건을 조사하기 위하여 기본배지로 변형 STY 배지(1% tryptone, 0.15% yeast extract, 0.01% NaCl, 여과살균한 바닷물)를 사용하였다. 탄소원으로 포도당보다 갈락토오스를 사용하였을 때 1.3배로 높은 활성을 보여주었으며, 질소원으로는 casamino acid를 사용하였을 때 가장 낮은 활성을 보여준 반면, 맥아추출물을 사용하였을 때 가장 높은 활성을 나타내었다. 생산된 체외단백질 분해효소는 $35^{\circ}C$에서 최적의 활성을 나타내었으며, 최적 pH는 8.5로 판명되었다.
Proteases are degradative enzymes which hydrolyze a peptide bond between amino acids and they are abundantly applied to commercial field. In order to investigate optimal medium compositions of carbon and nitrogen source for enzyme production, modified STY medium containing 0.15% yeast extract were u...
Proteases are degradative enzymes which hydrolyze a peptide bond between amino acids and they are abundantly applied to commercial field. In order to investigate optimal medium compositions of carbon and nitrogen source for enzyme production, modified STY medium containing 0.15% yeast extract were used as basal medium. When galactose was used as carbon source, enzyme activity showed 1.3 higher than that of glucose. For nitrogen source addition of casamino acids to basal medium in place of tryptone showed lowest activity, whereas addition of malt extract showed maximal activity. The optimum temperature and pH of extracellular protease were found to be $35^{\circ}C$ an pH 8.5.
Proteases are degradative enzymes which hydrolyze a peptide bond between amino acids and they are abundantly applied to commercial field. In order to investigate optimal medium compositions of carbon and nitrogen source for enzyme production, modified STY medium containing 0.15% yeast extract were used as basal medium. When galactose was used as carbon source, enzyme activity showed 1.3 higher than that of glucose. For nitrogen source addition of casamino acids to basal medium in place of tryptone showed lowest activity, whereas addition of malt extract showed maximal activity. The optimum temperature and pH of extracellular protease were found to be $35^{\circ}C$ an pH 8.5.
* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.
제안 방법
따라서 본 연구는 상업적으로 판매되는 단백질 분해효소의 새로운 공급원의 가능성을 타진하기 위하여 Micrococcus sp. HJ19 균주의 생육과 효소생산에 대한 최적의 배지조건을 구하고, 효소의 최적 온도와 최적 pH을 조사하였다.
Micrococcus sp. HJ19가 생산하는 효소의 최적 pH를 알아보기 위하여 세 가지 완충액에 기질을 녹여 pH를 5에서 9까지 0.5 단위로 변화시키면서 조효소액과 반응시켜 조사한 결과 Fig. 2와 같았다. pH 5에서는 최대 활성에 대하여 5%만의 낮은 효소활성만을 나타내었으며, pH의 증가에 따라 효소의 활성이 비례적으로 증가하여 pH 8.
균주가 생산하는 체외분비 단백질 분해효소의 최적온도와 pH를 알아보기 위하여 25℃에서 48시간 동안 종배양한 균을 1%가 되도록 MBS 배지에 접종하여, 30℃에서 30시간 배양한 균의 배양 상등액을 조효소액으로 하였다. 최적온도를 알아보기 위해서 효소의 반응온도를 5℃ 간격으로 0℃에서부터 60℃까지 조정하여 효소활성을 측정하였다.
변형 STY 배지에 부가적인 탄소원으로 glucose 또는 maltose, galactose, sucrose, lactose, mannitol, glycerol를 각각 2%로 첨가하여 30℃에서 30시간 동안 배양한 후 균체생육과 효소활성을 측정하였다.
이 균주가 생산하는 체외분비 단백질 분해효소의 최적온도와 pH를 알아보기 위해서는 0.5× marine broth (Difco, USA)에 0.01% skim milk (Difco, USA)를 첨가한 MBS 배지를 사용하였으며, 효소생산을 위한 최적의 배지조건을 찾기 위해서는 0.5% yeast extract를 0.15%로 바꾼 변형 STY 배지(1% tryptone, 0.15% yeast extract, 0.01% NaCl, 여과살균한 바닷물 사용)에 적당한 탄소원 또는 tryptone 대신에 다른 질소원을 첨가하여 사용하였다.
15%의 yeast extract를 소량함유하고 있으며, 그 외의 질소원으로 1%의 tryptone도 다량 함유하고 있다. 이 배지의 tryptone 대신에 부가적인 질소원으로 동일농도의 peptone 또는 yeast extract, malt extract, NaNO3, (NH4)2SO4, NH4Cl, skim milk로 각각 바꾸고, 1%의 glucose를 첨가하여 30℃에서 30시간 동안 배양한 후 균체 생육과 효소활성을 측정하였다.
최적온도를 알아보기 위해서 효소의 반응온도를 5℃ 간격으로 0℃에서부터 60℃까지 조정하여 효소활성을 측정하였다. 이때 대조군으로 심층수에서 분리한 균 중에서 체외분비 단백질 분해효소를 분비하지 않는 HJ56의 조효소액도 함께 측정하였다. 효소의 최적 pH를 알아보기 위해서 상기와 같이 조제된 조효소액을 pH 5에서 6까지는 0.
균주가 생산하는 체외분비 단백질 분해효소의 최적온도와 pH를 알아보기 위하여 25℃에서 48시간 동안 종배양한 균을 1%가 되도록 MBS 배지에 접종하여, 30℃에서 30시간 배양한 균의 배양 상등액을 조효소액으로 하였다. 최적온도를 알아보기 위해서 효소의 반응온도를 5℃ 간격으로 0℃에서부터 60℃까지 조정하여 효소활성을 측정하였다. 이때 대조군으로 심층수에서 분리한 균 중에서 체외분비 단백질 분해효소를 분비하지 않는 HJ56의 조효소액도 함께 측정하였다.
대상 데이터
실험에 사용된 균주는 동해 심층수에서 순수분리된 Micrococcus sp. HJ19를 사용하였다(2). 이 균주가 생산하는 체외분비 단백질 분해효소의 최적온도와 pH를 알아보기 위해서는 0.
이론/모형
효소의 활성측정은 배양 상등액을 사용하여 Windler와 Kelleher의 방법(22)에 준하여 다음과 같이 시행하였다.
성능/효과
2와 같았다. pH 5에서는 최대 활성에 대하여 5%만의 낮은 효소활성만을 나타내었으며, pH의 증가에 따라 효소의 활성이 비례적으로 증가하여 pH 8.5에 최대에 이른 후 pH 9.0에서는 다소 감소하는 경향을 나타내었다. 이와 같은 최적 pH는 차 등(3)과 Lee 등(15)이 보고한 Pseudoalteromonase sp.
효소의 활성은 casamino acid를 넣어준 경우에 50%로 급격히 감소하였으며, peptone의 경우는 tryptone과 차이가 없었으며 최고의 활성은 맥아추출물을 첨가하였을 경우로 효소의 활성이 약 35% 증가하였다. 단백질 분해효소의 생산과 활성에 대한 금속이온의 효과를 알아보기 위해 배지에 50 mM의 Ca2+를 첨가한 결과 균주의 성장은 약 30% 높아졌으며, 효소의 활성도 약 21% 증가하였다(자료 미제시).
HJ19에 부가적인 탄소원을 첨가하여 배양하였을 때의 단백질 분해효소의 생산결과 Table 1과 같았다. 포도당과, 수크로오스, 맥아당, 글리세롤을 첨가하였을 때는 탄소원의 첨가하지 않았을 때와 유사한 성장을 하였으나 글리세롤을 제외하고는 성장에 대한 효소의 활성은 약 10% 정도 낮았다. 반면에 갈락토오스와 젖당, 만니톨을 첨가한 경우에 세포의 성장은 다소 낮았으나, 성장에 대한 효소활성은 15% 이상 증가하였다.
HJ19와는 다른 양상을 보여주었다. 하지만 두 균 모두 당의 첨가로 균의 생육이 증가할 경우 단백질 분해효소의 생산이 적은 것을 보아 단백질 분해효소는 탄소원의 상태가 좋지 않은 경우에 많이 생산되는 것으로 생각되었다. 이러한 경향은 Vibrio vulnificus 분비하는 엘라스틴분해 단백질 분해효소도 유사하였다(13).
균의 성장은 복합 질소원을 사용하였을 때 좋았다. 효소의 활성은 casamino acid를 넣어준 경우에 50%로 급격히 감소하였으며, peptone의 경우는 tryptone과 차이가 없었으며 최고의 활성은 맥아추출물을 첨가하였을 경우로 효소의 활성이 약 35% 증가하였다. 단백질 분해효소의 생산과 활성에 대한 금속이온의 효과를 알아보기 위해 배지에 50 mM의 Ca2+를 첨가한 결과 균주의 성장은 약 30% 높아졌으며, 효소의 활성도 약 21% 증가하였다(자료 미제시).
후속연구
배양초기의 높은 효소 생산능력을 가진 Micrococcus sp. HJ19 (2) 유래의 중성 단백질 분해효소는 낮은 열안정성을 가져 식품 단백질의 가수분해정도를 열로서 쉽게 조절할 수 있어 식품산업에 유용한 효소가 될 수 있을 것으로 생각된다. 앞으로 최적 배양조건에 균주를 배양시켜 효소를 정제하고 유전자특성을 밝히는 연구가 필요할 것으로 생각된다.
HJ19 (2) 유래의 중성 단백질 분해효소는 낮은 열안정성을 가져 식품 단백질의 가수분해정도를 열로서 쉽게 조절할 수 있어 식품산업에 유용한 효소가 될 수 있을 것으로 생각된다. 앞으로 최적 배양조건에 균주를 배양시켜 효소를 정제하고 유전자특성을 밝히는 연구가 필요할 것으로 생각된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
상업적 단백질 분해 효소를 생산하는 미생물은 무엇이 있는가?
현재 산업적으로 사용되는 대부분의 단백질 분해 효소는 생물 공학적 응용에 필요한 모든 특성을 만족시켜주는 미생물 유래의 효소가 많이 사용되며(9) 대부분의 상업적 단백질 분해효소는 Bacillus 속의 세균으로부터 생산되는 중성 또는 알카리성 효소들이다. Bacillus sp. 외에도 Vibrio (6, 13), Serratia (14), Pseudomonas (8), Pseudoaltermonas (3, 15), Streptomyces (10), Brevibacterium (20), Kocuria sp.의 균주(12)들이 보고되어 있다. 이외에도 치즈류와 심층수에서 체외 단백질 분해효소를 분비하는 Micrococcus sp.
Micrococcus sp. HJ19 균주의 특징은 무엇인가?
심층수로부터 분리보고 된 Micrococcus sp. HJ19 균주는 20℃에서부터 37℃까지의 온도범위에서 생육이 빠르고, 많은 양의 체외분비 단백질 분해효소를 생산한다고 보고되어 있다(2). 따라서 본 연구는 상업적으로 판매되는 단백질 분해효소의 새로운 공급원의 가능성을 타진하기 위하여 Micrococcus sp.
체외 단백질 분해효소를 분비하는 것으로 보고된 것은 무엇이 있는가?
의 균주(12)들이 보고되어 있다. 이외에도 치즈류와 심층수에서 체외 단백질 분해효소를 분비하는 Micrococcus sp. (2, 7, 18)의 균주가 보고 되어있으며, Micrococcus caseolyticus로 부터는 상업적으로 판매되는 단백분해효소 Rulactine을 생산하여 치즈의 숙성에 사용되어지고 있다 (4, 17).
참고문헌 (22)
옥민, 김민석, 서원석, 차재영, 조영수. 2000. 토양으로부터 분리한 Bacillus sp. WRD-1이 생산하는 extracellular protease의 특성. 한국산업미생물학회지 28, 329-333
차인태, 오용식, 노동현. 2007. 단배질 분해효소를 분비하는 Micrococcus sp. HJ19의 분리 및 특성. 한국미생물학회지 43, 222-226
Alkhalaf, W., L. Vassal, M.J. Desmazeaud, J.C. Gripon, E. Perrot, G. Pitel, and J. Uro. 1987. Use of Rulactine as ripening agent in semi-hard cheese. Lait 67, 173-185
Cowan, D. 1983. Industrial applications: Proteins, pp. 353-374, In T. Godfrey and S. West (eds.), Industrial enzymology-The application of enzymes in industry. The Nature Press, New York, USA
Denkin, S.M. and D.R. Nelson. 1999. Induction of protease activity in Vibrio anguillarum by gastrointestinal mucus. Appl. Environ. Microbiol. 65, 3555-3560
Fernsndez, J., A. F. Mohedano, M.J. Polanco, M. Medina, and M. Nunez 2008. Purification and characterization of an extrcellular cysteine proteinase produced by Micrococcus sp. INIA 528. J. Appl. Microbiol. 81, 27-34
Fukushima, J., S. Yamamoto, K. Morihara, Y. Atsumi, H. Takeuchi, S. Kawamoto, and K. Okuda. 1989. Structural gene and complete amino acid sequence of Pseudomonas aeruginosa IFO 3455 elastase. J. Bacteriol. 171, 1698-1704
Godfrey, T. and S. West. 1996. Industrial enzymology, 2nd ed. Macmillan Publisher Inc., New York, USA
Henderson, G., P. Krygsman, C.J. Liu, C.C. Davey, and L.T. Malek. 1987. Characterization and structure of genes for proteases A and B from Streptomyces griseus. J. Bacteriol. 169, 3778-3784
Himelbloom, B.H. and H.M. Hassen. 1986. Effect of cysteine on growth, protease production, and catalase activity of Pseudomonase fluorescens. Appl. Environ. Microbiol. 51, 418-421
Hinrichsen, L.L., M.C. Montel, and R. Talon. 1994. Proteolytic and lipolytic activities of Micrococcus roseus (65), Halomonas elongata (16) and Vibrio sp. (168) isolated from danish bacon curing brines. Int. J. Food Microbiol. 22, 115-126
Kothary, M.H. and A.S. Kreger. 1985. Production and partial characterization of an elastolytic protease of Vibrio vulnificus. Infect. Immun. 50, 534-540
Kwon, Y.T., H.H. Lee, and H.M. Rho. 1993. Cloning, expression and sequencing of the minor protease encoding gene from Serratia marcescens ATCC 21074. Gene 125, 75-80
Lee, S.O., J. Kato, N. Takiguchi, A. Kuroda, T. Ikeda, A. Mitsutani, and H. Ohtake. 2000. Involvement of an extracellular protease in algicidal activity of the marine bacterium Pseudoalteromonas sp. strain A28. Appl. Environ. Microbiol. 66, 4334-4339
Mohedano, A.F., J. Fernndez, P. Gaya, M. Medina, and M. Nunez. 1997. Effect of pH, temperature and culture medium composition on the production of an extracellular cysteine proteinase by Micrococcus sp. INIA 528. J. Appl. Microbiol. 82, 81-86
Piard, J.C., M. EL Soda, W. Alkhalaf, M. Rousseau, M. Desmazeaud, L. Vassal, and J.C. Gripon. 1986. Acceleration of cheese ripening with liposome-entrapped proteinase. Biotechem. Lett. 8, 241-246
Prasad, R., R.K. Malik, and D.K. Mathur. 1986. Purification and characterization of an extrcellular caseinolytic enzyme of Micrococcus sp. MCC-315 isolated from cheddar cheese. J. Dairy Sci. 69, 633-642
Rattray, F.P., W. Bockelmann, and P.F. Fox. 1995. Purification and characterization of an extrcellular proteinase from Brevibacterium linens ATCC 9174. Appl. Environ. Microbiol. 61, 3454-3456
Secades, P. and J.A. Guijarro. 1999. Purification and characterization of an extracellular protease from the fish pathogen Yersinia ruckeri and effect of culture conditions on production. Appl. Environ. Microbiol. 65, 3969-3975
Windle, H.J. and D. Kelleher. 1997. Identification and characterization of a metalloprotease activity from Helicobacter pylori. Infect. Immun. 65, 3132-3137
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.